沉默信息调节因子1对高糖诱导的足细胞凋亡的影响及机制研究

目的研究沉默信息调节因子1(silence information regulator 1,SIRT1)对高糖诱导的足细胞凋亡的影响和机制。方法取足细胞分别给予不同处理,分为5组:Control组(5.6 mmol/L葡萄糖培养液培养)、Osmotic-NC组(葡萄糖5.6 mmol/L+甘露醇25 mmol/L培养液培养)、HG组(30 mmol/L葡萄糖培养液培养)、HG+SIRT1组[SIRT1过表达载体(pcDNA3.1-SIRT1)转染+30 mmol/L葡萄糖培养液培养]、HG+NC组[阴性对照载体(pcDNA3.1)转染+30 mmol/L葡萄糖培养液培养],采用qRT-PCR和Western blot技术检测各组SIRT1表达效果,以试剂盒分别检测各组细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)、活性氧簇(ROS)水平,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡,采用Western blot检测各组细胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达变化。结果高糖培养后的足细胞中SIRT1 mRNA及蛋白水平均降低。转染SIRT1过表达载体后的足细胞经过高糖处理以后,细胞中的SIRT1 mRNA及蛋白水平升高。高糖处理后的足细胞中SOD、CAT、GSH-Px活性降低,MDA和ROS水平升高,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白水平升高。上调SIRT1可以提高高糖条件下足细胞SOD、CAT、GSH-Px活性,减少细胞中MDA和ROS水平,减少细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达。结论上调SIRT1可以降低高糖诱导的足细胞凋亡,其作用机制可能与降低氧化损伤有关。     

益肾胶囊通过上调SIRT1抑制高糖诱导足细胞凋亡的机制研究

目的:探讨益肾胶囊通过调控SIRT1表达,抑制炎症反应,减轻高糖诱导的足细胞凋亡。方法:体外培养小鼠足细胞,(1)给予SIRT1及SIRT1siRNA质粒转染分为:(1)NC组(空白质粒组);(2)过表达组(SIRT1质粒);(3)si组(SIRT1siRNA质粒);(2)给予益肾胶囊干预,实验分为:(1)NG组(5.5 mmol/L葡萄糖);(2)HG组(30 mmol/L葡萄糖);(3)YS组(30 mmol/L葡萄糖+10%益肾胶囊含药血清);(4)R组(30 mmol/L葡萄糖+10 mmol/L白藜芦醇),western blot及RTPCR检测SIRT1、NF-κBp65、BCL-2、MCP-1的蛋白和mRNA表达,流式细胞检测细胞凋亡。结果:(1) SIRT1过表达组的SIRT1、Bcl-2的蛋白和mRNA表达升高(P 0.05),乙酰化NF-κBp65、MCP-1的蛋白和mRNA表达下降(P 0.05);SIRT1siRNA组的SIRT1、Bcl-2的蛋白和mRNA表达下降(P 0.05),乙酰化NF-κBp65、MCP-1的蛋白和mRNA表达升高(P 0.05)。(2)高糖组的SIRT1、Bcl-2的蛋白和mRNA表达较正常组下降(P 0.05),乙酰化NF-κBp65、MCP-1蛋白和mRNA表达升高(P 0.05)。益肾胶囊含药血清组和白藜芦醇组的SIRT1、Bcl-2的蛋白和mRNA表达升高(P 0.05),乙酰化NF-κBp65、MCP-1蛋白和mRNA表达下降(P 0.05)。(3)高糖组足细胞凋亡率较正常组高(P 0.05),益肾胶囊含药血清组和白藜芦醇组的足细胞凋亡率低于高糖组(P 0.05)。结论:益肾胶囊可能通过上调足细胞SIRT1表达,抑制足细胞炎症及凋亡,修复足细胞损伤。     

厄贝沙坦对高糖诱导的小鼠足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6表达的影响

目的研究血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(angiotensinⅡreceptor blockers,ARB)厄贝沙坦对高糖诱导的条件永生化小鼠足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(transient receptor potential cation channel,TRPC6)表达的影响。方法首先体外培养条件永生化小鼠足细胞,分为高渗对照组(甘露醇30 mmol/L+葡萄糖5 mmol/L),正常对照组(葡萄糖5 mmol/L)、实验组(葡萄糖浓度分别为15 mmol/L、25 mmol/L和35 mmol/L),免疫细胞化学检测小鼠足细胞TRPC6分布,Western Blot和RT-PCR分别检测小鼠足细胞TRPC6蛋白和mRNA的表达;其次使用高糖(25 mmol/L)在不同时间点(0 h,12 h,24 h,48 h)作用于足细胞,Western Blot和RT-PCR分别检测小鼠足细胞TRPC6蛋白和mRNA的表达;最后将细胞分为5组:正常对照组、高糖组、高糖+厄贝沙坦组(10~(-7)mol/L)、高糖+厄贝沙坦组(10~(-6)mol/L)、高糖+厄贝沙坦组(10~(-5)mol/L),倒置显微镜下观察不同浓度厄贝沙坦对高糖诱导的足细胞形态学变化,Western Blot和RT-PCR分别检测小鼠足细胞TRPC6蛋白和mRNA的表达。结果①免疫细胞化学检测可见,随着葡萄糖浓度的增加,TRPC6主要集中表达于足细胞胞膜,沿足突分布更加明显;Western Blot和RT-PCR检测到TRPC6蛋白和mRNA表达量逐渐增加,以25 mmol/L变化最明显。②高糖刺激足细胞后,与0h比较,随着刺激时间的延长,足细胞TRPC6蛋白和mRNA表达量明显增加(P0.05),在48 h达到高峰,呈一定的时间依赖性。③与正常对照组比较,高糖诱导的TRPC6表达明显增高(P0.05)。与高糖组比较,高糖+厄贝沙坦组随厄贝沙坦浓度的增加,TRPC6蛋白和mRNA表达量明显下调(P0.05),呈浓度依赖性。结论高糖可诱导足细胞TRPC6表达增加,厄贝沙坦对高糖诱导的足细胞损伤具有保护作用,其机制可能是通过下调足细胞TRPC6的表达来实现的。     

番茄红素对高糖诱导的足细胞自噬以及凋亡的影响

目的探讨番茄红素(Lyc)对高糖诱导的足细胞自噬及凋亡的影响,旨在为临床治疗糖尿病肾病提供可靠的理论依据。方法采用条件永生化小鼠足细胞系为研究对象,通过添加不同剂量的Lyc对高糖诱导的足细胞进行干预。实验细胞分6组,分别为正常对照组(5.5m m ol/L葡萄糖)、高渗对照组(5.5 m m ol/L葡萄糖+1 9.5 m m ol/L甘露醇)、高糖组(2 5 m m ol/L葡萄糖)、低剂量Lyc组(25 mmol/L葡萄糖+3.125μmol/L Lyc)、中剂量Lyc组(25 mmol/L葡萄糖+6.25μmol/L Lyc)和高剂量Lyc组(25 mmol/L葡萄糖+12.5μmol/L Lyc)。在细胞培养4 8 h后,用吖啶橙染色法观察各组细胞的自噬体变化情况;流式细胞技术检测各组细胞的凋亡率变化;采用实时定量荧光PCR和蛋白质印迹法分别检测自噬相关基因LC3、beclin-1、p62/SQSTM I m RNA和蛋白的表达变化情况。结果与正常对照组、高渗对照组相比,高糖组细胞中的自噬体数目明显增多,细胞的凋亡率极显著增加(P0.01),自噬相关基因LC3-II、beclin-1的表达量显著增加(P0.05),而p62/SQSTMI基因的表达量则显著降低(P0.05)。与高糖组比较,不同剂量Lyc组中的足细胞自噬体数目更多;细胞的凋亡率显著降低(P0.05),且高剂量Lyc组细胞的凋亡率降低极显著(P0.01);自噬相关基因LC3-II、beclin-1表达量显著增加(P0.05);而p62/SQSTMI基因表达量则显著降低(P0.05);且高剂量Lyc组基因表达量变化极显著(P0.01);蛋白水平上的检测结果与mRNA水平基本一致。结论Lyc能进一步增强高糖诱导引起的足细胞的自噬,但对足细胞的凋亡却起到了一定的抑制作用,且高剂量的Lyc作用效果更加明显。     

长链非编码RNA PVT1通过调控miR-455的表达影响糖尿病肾病足细胞损伤和凋亡

目的:探究长链非编码RNA(lncRNA) PVT1通过调控miR-455对糖尿病肾病足细胞损伤和凋亡的影响。方法:采用高糖刺激永生化小鼠足细胞建立糖尿病肾病足细胞损伤模型,实验分为正常糖(NG)组:5.6 mmol/L葡萄糖,高糖(HG)组:30 mmol/L葡萄糖,高糖+转染对照(HG+si-NC)组:30 mmol/L葡萄糖+siRNA control,高糖+转染(HG+siPVT1)组:30 mmol/L葡萄糖+PVT1 siRNA。各组足细胞处理48 h后采用qRT-PCR检测细胞中PVT1和的miR-455的表达水平,荧光素酶报告实验检测PVT1和miR-455的靶向关系,Western blot检测足细胞标记蛋白Nephrin、WT-1和损伤因子Desmin的表达水平,流式细胞术检测足细胞凋亡情况。结果:与NG组相比,HG组足细胞中PVT1的表达明显升高,miR-455的表达水平明显降低,Nephrin、WT-1蛋白表达明显下调,Desmin蛋白表达明显上调,足细胞凋亡率明显升高,差异均有统计学意义(P 0.05);与HG组相比,HG+si-PVT1组足细胞中PVT1的表达水平明显降低,miR-455的表达水平明显升高,Nephrin、WT-1蛋白表达明显上调,Desmin蛋白表达明显下调,足细胞凋亡率明显降低,差异均有统计学意义(P 0.05)。荧光素酶报告实验结果表明PVT1能够靶向调控miR-455。结论:敲低PVT1可通过上调miR-455的表达抑制高糖诱导的足细胞损伤和凋亡。     

高糖与高尿酸通过醛糖还原酶通路协同作用加重内皮细胞损伤

目的寻找高血糖与高尿酸血症协同加重内皮细胞损伤的共同作用靶点和分子机制,为糖尿病合并高尿酸血症患者心血管疾病的保护提供干预靶点。 方法用人脐静脉内皮细胞系(HUVEC-C)给予高糖(30 mmol/L,HG)、高尿酸(600 μmol/L,UA)和高糖(HG)＋高尿酸(UA)联合培养48 h。利用10 μmol/L阿司他丁阻断醛糖还原酶(AR)的活性。实时定量PCR检测内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)和AR mRNA的表达;Western blot检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2 (NOX2)、NOX4、eNOS和AR蛋白的表达;共聚焦显微镜检测细胞内ROS的活性;一氧化氮(NO)试剂盒检测NO活性。 结果与单独HG组和UA组相比,HG＋UA共培养组明显降低eNOS mRNA水平和蛋白表达,减少NO产生,增加内皮细胞胞内ROS活性;HG＋UA共培养明显上调AR mRNA水平和蛋白表达。应用AR抑制剂能够明显增加HG＋UA组内皮细胞eNOS mRNA水平和蛋白表达,增加内皮细胞NO的分泌水平。AR抑制剂能够明显下调HG＋UA组内皮细胞NOX4的蛋白表达,对NOX2无影响;降低细胞内ROS的含量。 结论高血糖和高尿酸协同作用通过激活醛糖还原酶途径下调内皮细胞eNOS的表达,增加ROS活性,减少NO的产生,加重内皮细胞功能障碍;而抑制醛糖还原酶,能够通过抑制NOX4表达,阻断这种协同损伤作用。     

活性维生素D_3对高糖环境下小鼠足细胞巢蛋白表达的影响

目的:探讨活性维生素D3是否与高糖环境下小鼠足细胞巢蛋白(nestin)的表达调控有关。方法:采用体外培养永生化小鼠足细胞,将分化成熟的足细胞分为正常糖(糖5 mmol/L)组、高糖(糖25 mmol/L)组、甘露醇对照组、高糖+活性维生素D3(10-7,10-8,10-9mol/L)组,应用Western blot及RT-PCR半定量检测nestin蛋白水平及其mRNA水平的表达情况。结果:高糖+活性维生素D3组较高糖组小鼠足细胞nestin蛋白水平及其mRNA水平表达均增高(P0.05)。结论:活性维生素D3能上调高糖环境下nestin mRNA和蛋白水平的表达而发挥保护作用。     

乌索酸通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路改善高糖诱导的系膜细胞损伤

目的:探讨乌索酸(ursolic acid,UA)对高糖所致人肾小球系膜细胞(RMC)损伤的保护作用,明确是否通过抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路的活化,抑制细胞增殖及活性氧簇等活动。方法:将体外培养人系膜细胞分为正常葡萄糖组(NG)、高糖组(HG)、甘露醇高渗对照组(MA)及HG+不同剂量(0.5、1.0、2.0μmol/L)乌索酸干预组(UA),采用MTT法及DCFH-DA流式细胞仪分别检测系膜细胞增殖及活性氧簇产生;Westen-blot检测系膜细胞PI3K/AKT/m TOR信号通路活性及TGF-β1、FN表达;RT-PCR法检测TGF-β1、FN mRNA表达。结果:高糖刺激人肾小球系膜细胞48 h后,系膜细胞异常增殖,UA呈剂量依赖性抑制高糖诱导的系膜细胞增殖。UA抑制系膜细胞ROS的产生及氧化应激反应,减轻系膜细胞损伤。UA抑制高糖诱导的系膜细胞AKT、m TOR磷酸化水平及系膜细胞TGF-β1、FN蛋白及mRNA的表达(P0.05 vs.HG)。结论:乌索酸通过抑制高糖介导的PI3K/AKT/m TOR信号通路活化,抑制系膜细胞增殖及ROS的产生,减轻系膜细胞损伤。     

脱氢抗坏血酸对高糖诱导系膜细胞产生氧自由基的影响

目的 探讨脱氢抗坏血酸(DHA)对高糖诱导系膜细胞产生氧自由基(ROS)的影响。 方法 (1)原代培养大鼠系膜细胞；(2)以Fe3+还原法检测细胞内抗坏血酸(AA)和DHA浓度，观察系膜细胞摄取AA和DHA的情况及葡萄糖、葡萄糖转运蛋白(GLUT)抑制剂细胞松弛素B对其的影响；(3)采用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内ROS，观察高糖诱导系膜细胞ROS产生的情况及不同浓度DHA对其的影响；(4)采用凝胶电泳迁移率法(EMSA)检测活性蛋白1(AP-1)和DNA的结合活性，观察DHA对高糖诱导的系膜细胞内AP-1 活性的影响。结果 (1)AA不能由细胞外进入系膜细胞，而DHA可以进入，并且随着细胞外葡萄糖浓度的增加，其进入速度减慢；细胞松弛素B则完全抑制了DHA进入到系膜细胞。(2)高糖快速诱导系膜细胞ROS产生增多；DHA抑制了高糖的这种作用，并且该抑制作用在≤4 mmol/L的浓度范围内呈浓度依赖性。(3)DHA抑制了高糖诱导的系膜细胞内AP-1 的激活。 结论 (1)系膜细胞是依赖DHA利用Vit C的细胞型；DHA进入该细胞依赖GLUT介导，高糖可抑制其进入细胞。(2)DHA可有效抑制高糖诱导的系膜细胞ROS产生增多，并在一定范围内呈浓度依赖性。(3)DHA在抑制ROS产生的同时，也显著抑制了高糖诱导的AP-1 的激活。     

普罗布考抑制氧化低密度脂蛋白诱导的人肾近曲小管上皮细胞转分化的作用及机制研究

目的研究普罗布考对氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,Ox-LDL)诱导的人肾近曲小管上皮细胞HK-2转分化的保护作用,并探讨凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)及氧化应激在其中的作用和相互关系。方法采用不同浓度Ox-LDL(0~100μg/ml)孵育HK-2细胞,并予普罗布考(20μmol/L)和LOX-1抑制剂多聚肌苷酸(250μg/ml)干预。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测细胞增殖情况,用DCFH-DA法检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)活性,生化比色法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)浓度,Western blot检测E-钙粘素(cadherin)、α平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、LOX-1、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide 2-phosphate reduced tetrasodium salt,NADPH)氧化酶4(NOX4)表达。结果 12.5~200μg/ml浓度范围内的Ox-LDL对HK-2细胞的增殖无明显影响,25~100μg/ml的Ox-LDL以浓度依赖方式促进HK-2细胞LOX-1、α-SMA蛋白表达上升,E-cadherin下降。而多聚肌苷酸、普罗布考能使LOX-1、α-SMA蛋白表达抑制,E-cadherin表达上调。50μg/ml的Ox-LDL能促进NOX4表达上调,ROS活性增加(451.5μg/ml比839.8μg/ml,P0.05),NO含量略增加(46.0μmol/L比46.2μmol/L),但无统计学意义(P0.05)。而多聚肌苷酸、普罗布考能使NOX4表达下调,ROS活性下降,但对NO浓度无明显影响。结论Ox-LDL可诱导HK-2细胞转分化,其机制可能与其结合LOX-1促进氧化应激有关,而普罗布考可以通过降低LOX-1,抑制氧化应激损伤,从而延缓HK-2细胞转分化的进程。     

丙泊酚对体外高糖培养的人脐静脉内皮细胞中MDA、SOD和NF-κB的影响

目的 探讨丙泊酚对体外高糖培养的人脐静脉内皮细胞(HUMCEs)中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性及NF-κBp65表达的影响.方法 按体外培养HUMCEs的条件不同随机分为七组,葡萄糖5.5 mmol/L组(C1组)、甘露醇25 mmol/L组(C2组)、葡萄糖30mmol/L组(HG1组)、葡萄糖30mmol/L+脂肪乳90 μmol/L组(HG2组)、葡萄糖30 mmol/L+吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)50μmol/L组(HG3组)、葡萄糖30 mmol/L+丙泊酚25μmol/L组(HG4组)、葡萄糖30 mmol/L+丙泊酚100μmol/L组(HG5组).分别检测各组细胞的MDA含量、SOD活性及C1、HG1、HG3、HG4、HG5组中NF-κB p65表达量.结果 与C1、C2组比较,HG1组MDA含量升高,SOD活性降低,NFκB p65表达量增多(P＜0.05).与HG1组比较,HG3组、HG4组及HG5组的MDA含量均下降、SOD活性均升高、NF-κBp65表达量均降低(P＜0.05).与HG2组比较,HG3、HG4及HG5组的MDA含量均下降、SOD活性均升高(P＜0.05).与HG4组比较,HG5组MDA含量下降、SOD活性升高(P＜0.05);HG4、HG5组间NF-κB p65表达量差异无统计学意义.结论 丙泊酚与PDTC一样可抑制高糖对内皮细胞损伤,提示丙泊酚的作用与抑制NF-κB信号通路有关.     

MitoTEMPO通过调控PGC-1α/TFAM信号通路减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的研究

目的:探讨MitoTEMPO减轻高糖诱导的人肾小管上皮细胞损伤的作用机制。方法:人近端肾小管上皮细胞分为对照组、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)、实验组(10μmol/L的MitoTEMPO+30 mmol/L葡萄糖)。采用CCK-8法检测细胞生存率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,ELISA检测各组丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)表达水平,化学荧光法检测各组活性氧(ROS)含量,qRT-PCR检测各组PGC-1α、TFAM mRNA表达水平,Westernblot检测各组PGC-1α、TFAM表达水平。结果:与对照组相比,高糖组细胞活性降低,凋亡率增加(P<0.05),MDA、ROS表达水平明显升高(P<0.05),SOD和GSH表达水平明显降低(P<0.05),PGC-1α和TFAM蛋白和mRNA水平降低(P<0.05)。与高糖组比较,实验组细胞存活率升高,凋亡率下降(P<0.05),MDA、ROS表达水平明显降低(P<0.05),SOD和GSH表达水平明显升高(P<0.05),PGC-1α和TFAM蛋白和mRNA...     

表没食子儿茶素没食子酸酯对高糖环境下体外小鼠足细胞活性氧的影响

目的　观察不同浓度表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对高糖造成氧化应激状态下体外小鼠足细胞损害的作用并探讨其机制。 方法　以高糖（25 mmol/L）培养的小鼠足细胞为研究对象,维生素E培养为对照。首先以MTT法检测细胞活力,再在激光共聚焦显微镜下以CM-H2DCFDA荧光探针观察不同浓度EGCG（0.2、10、100 μmol/L）刺激足细胞6、12、24 h后活性氧（ROS）生成,并以流式细胞仪定量分析ROS平均荧光强度。RT-PCR法检测足细胞内ROS产生的主要通路NADPH氧化酶各亚基mRNA（ph22phox、p47phox、p67phox）的表达。 结果　高糖刺激下6 h,足细胞ROS生成显著增加（P < 0.01）。正常糖组和甘露醇组培养12 h ROS生成无显著增加（P > 0.05）。EGCG 0.2 μmol/L作用6 h可显著降低高糖环境下体外小鼠足细胞ROS水平（P < 0.01）。与高糖组比较,EGCG（100 μmol/L）显著减少NADPH氧化酶亚基p22phox和p67phox mRNA表达（均P < 0.05）。与维生素Ｅ组比较,EGCG（0.2 μmol/L）和维生素E（0.2 mmol/L）协同作用组显著减少p47phox mRNA表达（P < 0.05）。 结论　EGCG能缓解高糖环境下体外足细胞氧化应激状态,对高糖培养下足细胞有保护作用。     

罗格列酮对高糖环境中大鼠系膜细胞活性氧及单核细胞化学吸引蛋白质1的抑制作用

目的 观察罗格列酮对高糖培养基中大鼠系膜细胞活性氧（ROS）及单核细胞化学吸引蛋白质1（MCP-1）mRNA、蛋白表达的抑制作用,并探讨相关机制。 方法 将培养的大鼠系膜细胞分为以下6组：对照组（C组,普通MEM培养基,含5.6 mmol/L葡萄糖）、甘露醇组（M组,24.2 mmol/L甘露醇＋C组）、高糖组（H组,30 mmol/L高糖MEM培养基）、小剂量罗格列酮干预组（R1组,H组＋10 μmol/L罗格列酮）、大剂量罗格列酮干预组（R2组,H组＋20 μmol/L罗格列酮）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）干预组（N组,H组＋5 mmol/L NAC）。采用激光共聚焦法检测ROS水平,分别采用RT-PCR和ELISA法检测MCP-1 mRNA及蛋白含量。 结果 C组和M组间ROS、MCP-1的表达差异无统计学意义,H组ROS水平较C组增高4.1倍（P < 0.01）,分别采用罗格列酮（20 μmol/L）和NAC干预后,ROS水平显著降低（P < 0.01）;罗格列酮（20 μmol/L）和NAC均可显著抑制高糖环境中MCP-1 mRNA的高表达（P < 0.01）。H组中MCP-1蛋白水平[（940.9±20.3） ng/L]显著高于C组[（403.0±8.1） ng/L]（P < 0.01）,而R2组和N组的MCP-1蛋白水平[（562.5±15.3） ng/L,（539.8±8.3） ng/L]显著低于H组（P < 0.01）。 结论 罗格列酮可通过减少ROS而降低高糖所诱导的MCP-1表达,而这可能是罗格列酮发挥直接肾脏保护作用的机制之一。     

葛根素抑制吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡

目的观察葛根素对吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡的影响。方法 MTT法检测不同浓度葛根素(0.01-100μmol/L)和吡格列酮(20μmol/L)作用于MC3T3-E1细胞24 h后细胞增殖活性影响。流式细胞仪测定葛根素和吡格列酮对MC3T3-E细胞凋亡的影响。Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2、Bax的表达情况。结果 1、与对照组相比,吡格列酮组的细胞增殖活性明显下降(P0.05),而0.1-10μmol/L葛根素组细胞增殖活性明显增强(P0.05)。2、与吡格列酮组相比,加入0.1-1μmol/L葛根素后细胞的增殖活性明显增强(P0.05)。3、加入1μmol/L的葛根素后,吡格列酮导致的细胞凋亡率上升受到抑制(P0.05)。4、吡格列酮处理后caspase-3、caspase-8、Bax蛋白的表达上调,Bcl-2蛋白的表达下调,而加入葛根素共同作用后,caspase-3蛋白表达下调,Bcl-2蛋白的表达上调。结论葛根素可以抑制吡格列酮诱导的成骨细胞凋亡。     

高糖和胰岛素对肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白4 mRNA表达及细胞骨架纤维状肌动蛋白的影响

目的探讨高糖和胰岛素对肾小球系膜细胞(GMC)葡萄糖转运蛋白4(GluT4)mRNA表达及细胞骨架纤维状肌动蛋白(F-actin)的影响,进一步研究糖尿病肾病发生发展中GluT4及其下游分子F-actin的重要作用.方法将培养的鼠1097系膜细胞分为8组正常对照组,生理浓度胰岛素组(10-9mol/L),低浓度胰岛素组(10-8mol/L),高浓度胰岛素组(10-6mol/L),高糖组(30 mmol/L),甘露醇组,高糖加高浓度胰岛素组,高糖加生理浓度胰岛素组.采用RT-PCR法检测GluT4mRNA含量,rhodamine-phalloidin染色,激光共聚焦显微镜观察F-actln形态并测定荧光强度.结果(1)正常系膜细胞可检测到GluT4 mRNA.(2)高糖组GluT4 mRNA表达为对照组的58.7%(P＜0.05);10-8mol/L胰岛素组、10-6mol/L胰岛素组分别为对照组的230.2%和297.2%(P＜0.01);高糖加10-6mol/L胰岛素组,高糖加10-9mol/L胰岛素组分别为高糖组的170.6%和140.3%(P＜0.05).(3)高糖组F-actin荧光强度为对照组的44.5%;10-8mmol/L胰岛素组、10-6mol/L胰岛素组分别为对照组的122.4%(P＜0.05)和129.6%(P＜0.01);高糖加10-6mol/L胰岛素组为高糖组的183.8%(P＜0.05).(4)GluT4 mRNA表达与F-actin荧光强度呈正相关(r=0.786,P＜0.05).结论(1)正常系膜细胞有GluT4 mRNA表达.(2)高糖可抑制GluT4 mRNA表达及促进F-actin解聚.(3)胰岛素有一定拮抗作用,且呈剂量依赖性.(4)GluT4 mRNA表达与F-actin荧光强度呈正相关.(5)GluT4、F-actin是糖尿病肾病发生发展过程中的重要因子.     

高糖培养下系膜细胞JAK2／STAT3信号转导通路活性变化及与活性氧簇作用的研究

目的：通过观察高糖培养条件下大鼠肾小球系膜细胞P-STAT3的表达变化,探讨糖尿病状态下JAK2／STAT3途径活性的变化及该通路与活性氧簇（ROS之间的相互作用。方法：用传代培养的大鼠肾小球系膜细胞同步化后分组：（1）正常糖浓度组（含5．5mmol／L）,高糖浓度组（25mmol／L）,甘露醇组（5．5mmot／L糖＋19．5mmol甘露醇）,正常糖＋AG-490（浓度10／μmol／L）组,高糖＋AG-490（浓度10μmol／L）组。继续观察培养后用Westem Blot及细胞免疫化学方法检测系膜细胞STAT3、P-STAT3表达的变化。（2）正常糖浓度组（N）,高糖浓度组（H）,甘露醇组（M）,正常糖＋Apocynin组（N＋A,Apocynin浓度为100μmol／L）,高糖＋Apocynin组（H＋A,Atx）cynin浓度为100μmol／L）,收集上清液,用比色法检测系膜细胞ROS水平。（3）NADPH氧化酶抑制剂Apocynin预处理,分组同（2）,Apocynin提前1h加入,与正常糖或高糖同时培养后,用Westem Blot方法检测系膜细胞P-STAT3表达。结果：（1）高糖培养大鼠肾小球系膜细胞P-STAT3的表达较正常糖浓度组明显升高,甘露醇组与正常糖浓度组相比差异无统计学意义;各组之间STAT3表达差异无统计学意义。（2）高糖条件下,ROS产生明显升高,NADPH氧化酶抑制剂Apocynin可明显降低ROS的产生。（3）高糖条件下,Apocynin经预处理,在正常糖浓度和高糖浓度同时培养48h后,正常糖浓度组和正常糖＋Apocynin组对比P-NTAT3的表达差异无明显区别;高糖十Apocynin组较正常糖浓度组有明显区别,但与高糖组相比明显降低。结论：高糖通过磷酸化方式激活大鼠肾小球系膜细胞JAK2／STAT3信号转导通路;高糖作用下,肾小球系膜细胞ROS产生增加,并具有时间依赖性;高糖状态下ROS可激活肾小球系膜细胞的JAK2／STAL信号传导通路,证明ROS可能参与糖尿病肾病的发生和发展过程。     

PPARα激动剂非诺贝特在高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖中的作用

目的研究过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）激动剂非诺贝特在高糖诱导的肾小球系膜细胞中的作用,探讨其对糖尿病肾脏疾病的可能保护作用。方法将。肾小球系膜细胞分为6组：正常对照组（5mmol／L葡萄糖）、高糖组（40mmol／L葡萄糖）和高糖＋不同浓度PPARα激动剂组（FN,40mmol／L葡萄糖加1、10、50、100μmol／L非诺贝特）。应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot检测各组肾小球系膜细胞PPARα的表达;通过转染含PPAR反应元件的p4XPPRE-luc重组质粒,双荧光素酶分析法检测体外不同组细胞PPARα活性的改变;MTT法检测细胞增殖;Westernblot检测α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅳ型胶原蛋白的表达情况。结果高糖刺激组系膜细胞PPARα mRNA及蛋白表达均上调;非诺贝特组上述表达水平则显著升高,且呈浓度依耐性;正常。肾小球系膜细胞弱表达PPARα受体,高糖组PPARα活性无显著升高,而合适浓度的非诺贝特干预后PPARα受体活性明显增加;高糖组Q-SMA及Ⅳ型胶原蛋白表达明显上调,非诺贝特干预后上述指标明显下调。结论非诺贝特可通过抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质蛋白的表达而对糖尿病肾脏疾病起保护作用     

P38 MAPK抑制剂在高糖诱导系膜细胞CTGF表达和基质蛋白分泌中的作用

目的:探讨P38 MAPK抑制剂SB203580在高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞对丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1,MKP-1)与结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达和细胞外基质蛋白分泌的作用。方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞分为4组:正常对照组(NG组,5. 5 mmol/L葡萄糖);渗透压对照组(NG+M组,5. 5 mmol/L葡萄糖+24. 5 mmol/L甘露醇);高糖组(HG组,30 mmol/L葡萄糖);高糖+SB203580组(HG+SB203580组,30 mmol/L葡萄糖+10μmol/L SB203580),分别给予不同刺激。48 h收集细胞,分别提取系膜细胞蛋白、RNA及细胞上清液。采用Western blot检测MKP-1、p38 MAPK及磷酸化p38MaPK的表达; RT-PCR检测p38 MAPK、MKP-1、CTGF和FN mRNA的表达; ELISA法测定细胞上清CTGF和纤维黏连蛋白(fibronectin,FN)含量,放免法测定细胞上清液Ⅳ型胶原的含量。结果:与NG组相比,HG组系膜细胞MKP-1表达下调,p38 MAPK蛋白表达无明显差别,但磷酸化的p38 MAPK表达明显升高,MKP-1 mRNA表达下降,p38 MAPK、CTGF和FN mRNA的表达增加,细胞上清液中CTGF、FN和Ⅳ型胶原含量增加;与HG组相比,HG+SB203580组MKP-1表达升高,p38 MAPK蛋白表达无明显差别,但磷酸化的p38MAPK表达明显下降,p38 MAPK、CTGF和FN mRNA的表达下降,系膜细胞上清液中CTGF、FN和Ⅳ型胶原含量下降。结论:p38 MAPK抑制剂SB203580通过增强MKP-1的表达,增强p38 MAPK去磷酸化,使p38 MAPK活性下降,从而阻断CTGF的合成和细胞外基质蛋白表达,在糖尿病肾病细胞外基质重构中发挥保护作用。     

缬沙坦对高糖上调系膜细胞细胞外调节蛋白激酶表达的影响

目的观察在高糖刺激下，系膜细胞细胞外调节蛋白激酶（ERKI／2）的活性变化以及缬沙坦对其影响，探讨缬沙坦保护肾脏作用的可能机制。方法原代培养大鼠肾脏系膜细胞，随机分为4组：低糖组（NG，d-葡萄糖5．5mmol／L）、高糖组（HG，d-葡萄糖30mmol／L）、甘露醇组（MG，d-葡萄糖5．5mmol／L＋甘露醇24．5mmol／L）和缬沙坦组（HG＋Val，d-葡萄糖30mmol／L＋缬沙坦10μmol／L）。用免疫细胞化学法及Western印迹法对系膜细胞中磷酸化ERK1／2（p-ERK1／2）的表达进行定位及半定量分析；RT—PCR法检测细胞中TGF-β1 mRNA的表达；放射免疫法测定各组细胞上清中Ⅳ型胶原的含量。结果高糖组系膜细胞中P-ERK1／2蛋白的表达较低糖组明显增高，并由胞质向胞核内转移，呈时间依赖方式（P〈0．01）；TGF-β1 mRNA及细胞上清液中Ⅳ型胶原水平均高于低糖组（P〈0．01）。而缬沙坦组上述指标均较同时相点高糖组显著降低，差异有统计学意义（P〈0．01）。甘露醇组与低糖组各指标间差异均无统计学意义。结论高糖可显著激活系膜细胞ERK信号通路，缬沙坦可抑制高糖的激活作用。