紫杉醇通过自噬相关蛋白7介导的自噬抑制人主动脉平滑肌细胞增殖及迁移

目的探究自噬在紫杉醇(PTX)抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移中的作用及机制。方法使用紫杉醇作用人主动脉平滑肌细胞(HASMCs), 采用细胞计数盒(CCK-8)法和5-乙炔-2’-脱氧尿苷(EdU)掺入法检测紫杉醇对HASMCs的增殖能力的影响, 采用划痕实验检测紫杉醇对HASMCs迁移能力的影响, 蛋白质印迹法(Western blot)及利用GFP-RFP-LC3Ⅱ-HASMCs观察PTX对自噬关键蛋白LC3Ⅱ表达水平的影响;利用自噬相关蛋白7(ATG7)小干扰RNA转染HASMCs, 抑制自噬水平, 检测PTX对HASMCs增殖及迁移能力的作用。两组间比较采用t检验。结果在紫杉醇作用下, 其细胞活性在2.5 nmol/L组(0.669 ±0.010, t=17.620, P<0.01)及5 nmol/L组(0.535±0.012, t=22.300, P<0.01)时明显低于对照组(1.008±0.018);Edu阳性细胞率在2.5 nmol/L组(0.356±0.016, t=14.380, P<0.005)与5 nmol/L组(0.293±0.018, t=1...     

γ-分泌酶抑制剂3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯与氯喹的交叉对话作用对胃癌MKN-45细胞增殖、凋亡的影响

目的观察胃癌MKN-45细胞中Notch信号通路抑制剂3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)对自噬的影响及自噬抑制剂氯喹(CQ)对Notch信号通道的影响,探讨DAPT联合CQ对MKN-45细胞增殖、凋亡的影响。方法将MKN-45细胞分成4个组,对照组(Control组,RPMI 1640完全培养基培养);氯喹组(CQ组,含40μmol/L氯喹的RPMI 1640完全培养基培养);γ-分泌酶抑制剂组(DAPT组,含80μmol/L DAPT的RPMI 1640完全培养基培养);联合用药组(Comb组,含40μmol/L CQ和80μmol/L DAPT的RPMI 1640完全培养基培养)。应用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡;应用透射电镜、蛋白质印迹法(Western blot)、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞自噬水平;应用Western blot检测Notch信号通路表达。两组间比较采用独立样本t检验。结果MTT结果显示,Comb组[(55.09±1.38)%]细胞增殖能力明显低于DAPT组[(78.83±1.74)%]和CQ组[(64.82±1.89)%],差异均有统计学意义(t=18.514、7.185,P<0.01)。流式细胞结果显示,Comb组[(43.43±2.30)%]凋亡率明显高于DAPT组[(27.26±3.02)%]和CQ组[(22.16±2.24)%],差异均有统计学意义(t=7.339、11.415,P<0.01)。Western blot、RT-PCR结果显示,DAPT组自噬相关的微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、苄氯素1(Beclin1)、自噬相关基因7(ATG7)信使核糖核酸(mRNA)、自噬相关基因12(ATG12)mRNA的相对表达量(0.587±0.030、1.503±0.066、1.797±0.110、2.433±0.111)明显高于Control组(0.333±0.002、1.137±0.068、1.000±0.000、1.000±0.000),差异均有统计学意义(t=14.893、6.695、12.527、22.446,P<0.01)。CQ组Notch1蛋白的相对表达量(0.932±0.061)明显高于Control组(0.477±0.031),差异有统计学意义(t=11.590,P<0.01)。结论胃癌MKN-45细胞中自噬与Notch信号通路存在交叉对话,两者相互调节,DAPT联合CQ可以使胃癌MKN-45细胞增殖能力下降、凋亡率提高。     

缺氧条件下大鼠髓核细胞中缺氧诱导因子1α与自噬相关分子的表达及相关性分析

目的探讨缺氧条件下大鼠髓核细胞中缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)与自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达及其相关性。方法取健康成年SD大鼠髓核组织,分离培养髓核细胞并传代。取第3代髓核细胞行HE染色和Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色鉴定后,随机分为4组。A组细胞于常氧条件下(37℃、5%CO2、20%O2)培养,B组细胞于缺氧条件下(37℃、5%CO2、1%O2)培养,C组细胞转染HIF-1α-小干扰RNA后于缺氧条件下培养,D组细胞加入自噬抑制剂3-MA后于缺氧条件下培养。各组细胞培养8 h后,采用Western blot和实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测HIF-1α与自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达情况。结果经分离纯化的第3代大鼠髓核细胞HE染色后细胞质呈淡粉色,细胞核呈蓝黑色;Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色为阳性。Western blot和qRT-PCR检测示,B组HIF-1α、Beclin1和LC3B蛋白及mRNA相对表达量均显著高于A组(P<0.05),C组均显著低于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。D组HIF-1α蛋白和mRNA相对表达量与B组比较差异无统计学意义(P>0.05),Beclin1和LC3B蛋白和mRNA相对表达量均较B组显著降低(P<0.05)。结论缺氧条件能诱导大鼠髓核细胞中HIF-1α和自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达,且HIF-1α与自噬相关分子的表达具有相关性,即HIF-1α下调能降低自噬相关分子的表达,而缺氧条件下自噬水平下调对HIF-1α的表达无明显影响。     

低频超声微泡增强紫杉醇诱导三阴性乳腺癌细胞自噬的作用及机制

目的 探讨低频超声微泡增强紫杉醇诱导三阴性乳腺癌细胞自噬的作用及机制。方法 将MDA-MB-468细胞分为对照组(不进行处理)、紫杉醇组(6μg/ml紫杉醇)、低频超声组(低频超声+6μg/ml紫杉醇)和低频超声微泡组(低频超声+6μg/ml紫杉醇+微泡),检测各组MDA-MB-468细胞增殖情况,凋亡情况,自噬情况,Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达情况。结果 与0μg/ml相比,1、3、6、12、24μg/ml紫杉醇处理下MDA-MB-468细胞增殖抑制率均升高(P 0. 05)。与对照组相比,紫杉醇组MDA-MB-468细胞增殖抑制率、凋亡率、细胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达水平升高(P 0. 05),细胞中绿色点状物明显增多,细胞中Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白表达水平降低(P 0. 05);与紫杉醇组相比,低频超声组MDA-MB-468细胞增殖抑制率、凋亡率、细胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达水平升高(P 0. 05),细胞中绿色点状物明显增多,细胞中Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白表达水平降低(P 0. 05);与低频超声组相比,低频超声微泡组MDA-MB-468细胞增殖抑制率、凋亡率、细胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达水平升高(P 0. 05),细胞中绿色点状物明显增多,Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白表达水平降低(P 0. 05)。结论 低频超声微泡可通过上调Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达及下调Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白表达增强紫杉醇诱导三阴性乳腺癌细胞的凋亡、自噬反应。     

自噬调节在结肠癌细胞化疗耐药性的作用机制研究

目的:探究自噬调节在结肠癌细胞化疗过程中耐药性的作用机制。方法:以顺铂诱导人结肠癌细胞系EC9706细胞自噬,观察自噬抑制剂3-MA对EC9706细胞的影响。CCK8法测定细胞生长情况。流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。MDC检测自噬。Western blot法检测Beclin-1、PI3KⅢ、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达情况。结果:联合组EC9706细胞抑制率为(57.34±0.55)%,明显高于顺铂组的(32.00±0.32)%;而联合组与顺铂组EC9706细胞抑制率均明显高于对照组的(5.22±0.06)%。顺铂组MDC染色自噬空泡数为(1.72±0.12),明显高于对照组的(1.00±0.06)和联合组的(0.99±0.35)。联合组EC9706细胞凋亡率为(29.12±0.34)%,明显高于顺铂组的(19.76±0.15)%;且G0/G1、G2/M期细胞凋亡率分别为(54.68±0.35)%、(2.33±0.05)%,均明显低于顺铂组的(58.45±0.12)%、(7.56±0.16)%;而S期细胞凋亡率为(44.78±0.45)%,明显高于顺铂组的(38.25±0.65)%(P<0.05)。联合组及顺铂组Beclin-1、PI3KⅢ、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达倍数均明显高于对照组,且联合组Beclin-1、PI3KⅢ、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达倍数均明显低于顺铂组(P<0.05)。结论:自噬可能是顺铂诱导的结肠癌细胞的一种自我保护机制,抑制其自噬可能是结肠癌辅助化疗的新策略。     

仙茅苷调节lncRNA MEG3/miR-181a-5p通路对骨质疏松大鼠成骨细胞自噬的影响

目的 探讨仙茅苷（Curculigoside，CUR）对骨质疏松症（osteoporosis，OP）大鼠成骨细胞自噬的影响以及对lncRNA MEG3/miR-181a-5p信号轴的调节作用。方法 体外培养骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）诱导成骨细胞分化，CCK-8法筛选CUR浓度；数据库预测lncRNA MEG3与miR-181a-5p结合位点；利用转染技术将BM-MSCs细胞分为NC组、CUR组、CUR+3-MA组、CUR+pc-NC组和CUR+pc-LncRNA MEG3组，qRT-PCR检测lncRNA MEG3、miR-181a-5p的表达水平，碱性磷酸酶（ALP）染色法检测细胞ALP活性，MDC法检测细胞自噬体数量，免疫荧光检测细胞微管相关蛋白1-轻链3（LC3）、自噬效应蛋白（Beclin1）的表达。肌肉注射地塞米松磷酸钠建立OP大鼠，大鼠分为对照组（CT组）、模型组（OP组）、OP+CUR组（灌胃15 mg/kg CUR），CT检测大鼠胫骨骨形态学，Western blot和qRT-PCR分别检测LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1与lncRNA MEG3、miR-181a-5的表达。结果 25 μg/mL以上浓度的CUR显著提高BM-MSCs细胞增殖活力（P＜0.05）；lncRNA MEG3与miR-181a-5p具有靶向结合位点；与NC组相比，CUR组细胞ALP活性、自噬体数量以及LC3、Beclin1表达增加（P＜0.05）；与CUR组相比，CUR+3-MA组细胞ALP活性、自噬体数量以及LC3、Beclin1表达减少（P＜0.05）；与CUR+pc-NC组相比，CUR+pc-LncRNA MEG3组细胞ALP活性、自噬体数量以及LC3、Beclin1表达减少（P＜0.05）。OP组大鼠骨形态学评价以及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、miR-181a-5p表达较CT组下降，lncRNA MEG3表达增加（P < 0.05）；OP+ CUR组大鼠骨形态学评价以及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、miR-181a-5p表达较OP组增加，lncRNA MEG3表达降低（P＜0.05）。结论 CUR可能通过调节LncRNA MEG3/miR-181a-5p信号轴促进OP大鼠成骨细胞自噬活性。     

狼疮肾炎患者自噬水平及其对足细胞相关蛋白表达水平的影响

目的探讨狼疮肾炎(lupus nephritis,LN)患者自噬水平及其对足细胞相关蛋白表达水平的影响。方法选择2017年5月至2019年5月于榆林市第一医院收治的69例LN患者为LN组,50例系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者为SLE组,50例肾切除手术患者为对照组,观察3组肾脏足细胞内自噬体数量,比较3组肾脏组织中自噬相关蛋白、微管相关蛋白轻链3(LC3)、B淋巴细胞瘤蛋白质-2-相互作用蛋白(Beclin1)的表达,以及足细胞相关蛋白,肾病蛋白(Nephrin)、足突蛋白(Podocin)的表达。分离狼疮肾炎患者肾脏足细胞,将足细胞分为自噬抑制组和自噬诱导组,自噬抑制组加入100 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA),自噬诱导组加入100 nmol/L雷帕霉素(RAPA),比较3组足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin等蛋白的表达。结果LN组、SLE组肾脏足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05);SLE组肾脏足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于LN组(P<0.05);自噬诱导组足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于正常对照组、自噬抑制组(P<0.05);正常对照组足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于自噬抑制组(P<0.05)。结论LN患者自噬水平呈升高状态,自噬水平升高可能通过上调足细胞相关蛋白Podocin、Nephrin水平而减轻足细胞损伤,抑制LN病情进展。     

风湿性心脏瓣膜间质细胞的生物学特征

目的 观察风湿性心脏瓣膜间质细胞的生物学特征.方法 收集风湿性二尖瓣(22例)和正常二尖瓣(10例)标本,常规石蜡包埋后行苏木素-伊红(HE)和胶原纤维(VG)染色;新鲜标本分选瓣膜间质细胞分别行免疫细胞化学、Hoechst 33342染色和Western blot检测.结果 与正常瓣膜比较,风湿性二尖瓣表现为纤维化(22例)、钙化(20例).体外实验表明正常瓣膜间质细胞无特殊的生长形态,免疫表型为波纹蛋白[vimentin(+)]、α-平滑肌肌动蛋白[α-SMA(-)]、碱性磷酸酶[ALP(-)];风湿性瓣膜间质细胞易聚集生长成,免疫表型为vimentin(+)、α-SMA(+)、ALP(+).而且风湿性瓣膜间质细胞的Ⅰ型胶原纤维量(3倍)和凋亡细胞数(6倍)均明显高于正常瓣膜间质细胞(P＜0.05).结论 瓣膜间质细胞生物学特征的改变是导致瓣叶增厚、纤维化、钙化的主要因素.     

自噬在吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡中的作用

目的:研究自噬在吉西他滨(gemcitabine,Gem)诱导胰腺癌细胞SW1990凋亡中的作用,并以氯喹特异性抑制自噬,以探讨其可能机制。方法:采用CCK8法检测Gem对胰腺癌细胞增殖的影响,并用实时定量PCR检测自噬相关基因LC3的表达,以p62免疫荧光染色检测细胞内自噬泡,通过Western印迹法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin 1的表达,并用AnnexinⅤ/PI流式细胞方法检测Gem诱导后细胞凋亡的变化。进一步通过氯喹抑制自噬,检测自噬抑制前后细胞增殖、自噬及凋亡的变化。结果:Gem对胰腺癌细胞SW1990增殖具有部分抑制作用,Gem作用能迅速激活细胞自噬从而产生耐药。LC3的mRNA表达升高1.4~2.2倍(P<0.05),LC3-Ⅱ蛋白水平升高1.5~2.7倍(P<0.05)。Gem和氯喹联合用药组较Gem单药组细胞凋亡蛋白Caspase-3表达升高,细胞存活率从64.3%±3.1%降低为35.2%±3.4%(P<0.05)。结论:自噬在Gem诱导胰腺癌细胞凋亡的过程中可能起到保护作用,氯喹抑制自噬后可增强Gem的促凋亡作用。     

3-甲基腺嘌呤促进吡柔比星诱导膀胱癌BIU-87细胞凋亡及机制

目的 探讨3-甲基腺嘌呤(3-MA)自噬抑制剂联合吡柔比星(THP)对膀胱癌BIU-87细胞杀伤作用及机制.方法 膀胱癌BIU-87细胞分为对照组、3-MA(10 mmol/L)组、THP(5 mg/L)组、3-MA(10 mmol/L)+ THP(5 mg/L)组.噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测各组细胞中自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ、Beclin-1以及凋亡蛋白半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3和Caspase-9的表达.结果 药物作用24h后,各组细胞增殖率分别为(86.64±3.09)％、(63.70±5.62)％、(58.43±3.89)％、(37.55±4.17)％,其中3-MA+THP组细胞增殖下降最明显(P ＜0.05);3-MA与THP联合应用后,自噬蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达明显减弱,而凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达在各组中最强(P＜0.05).结论 3-MA抑制膀胱癌BIU-87细胞对化疗药物保护性自噬反应,增加膀胱癌细胞对THP细胞毒杀伤作用的敏感性.     

调控自噬流对巨噬细胞粘附与迁移功能的影响

目的巨噬细胞浸润是包括糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)在内的多种慢性肾脏疾病的重要组织病理特征。本研究通过调控巨噬细胞(RAW264.7)自噬流各阶段,探究其对巨噬细胞黏附迁移功能的影响。 方法体内实验,建立糖尿病肾病大鼠模型,于12周末分别处死正常大鼠、DN组大鼠,病理染色观察肾脏病理改变,检测肾组织巨噬细胞标志物及自噬相关标志物表达。体外实验,检测正常与高糖(30 mM)条件下,巨噬细胞自噬体数量变化,LC3、Beclin－1(自噬相关标志物)、P62(自噬体清除指标)的表达,以及巨噬细胞粘附迁移数量。分别加用自噬溶酶体降解抑制剂氯喹(CQ)、自噬体生成激活剂雷帕霉素(RAPA),观察其对巨噬细胞自噬标记物表达及其粘附迁移功能的影响,电镜观察巨噬细胞自噬体数量与自噬溶酶体形态的变化。 结果体内实验,DN大鼠肾脏损伤明显,肾小球体积增大,基底膜增厚,系膜基质增多,肾组织CD68(巨噬细胞标志物)、P62表达增加(t＝3.35、t＝16.27, P<0.05),LC3表达减少(t＝51.12, P<0.05);体外实验,在高糖组,电镜观察发现自噬体数量较正常组减少,Western印迹与免疫荧光显示自噬相关蛋白LC3、Beclin－1表达降低,P62表达升高(t＝27.02,t＝45.56、t＝32.71,P<0.05),巨噬细胞粘附和迁移数量增多(t＝6.87、t＝8.76,P<0.05)。用CQ处理后,电镜观察发现巨噬细胞自噬体溶酶体降解受到抑制,Western印迹与免疫荧光显示自噬相关蛋白LC3、Beclin－1表达降低,P62表达升高(t＝14.64、t＝12.45、t＝8.57,P<0.05);CQ进一步促进高糖诱导的巨噬细胞黏附迁移数量增多(t＝4.37、t＝7.27,P<0.05);RAPA增加巨噬细胞自噬体数量,Western与免疫荧光显示RAPA提高了被高糖抑制的巨噬细胞自噬水平,[LC3、Beclin－1表达升高,P62表达降低(t＝9.37、t＝11.53,t＝8.73;P<0.05)],减少高糖诱导的巨噬细胞黏附、迁移数量增多(t＝4.16、t＝5.74, P<0.05)。 结论高糖抑制自噬水平,促进巨噬细胞黏附迁移;抑制自噬溶酶体降解可降低自噬水平、促进巨噬细胞粘附迁移;激活自噬体生成能提高自噬水平,减轻巨噬细胞粘附迁移。     

PKD1基因对主动脉平滑肌细胞自噬的影响

目的阐明多囊肾病基因1(PKD1)对小鼠主动脉平滑肌细胞自噬的影响。方法构建PKD1基因的shRNA慢病毒干扰及PKD1基因促进剂ETS-1慢病毒过表达载体,转染小鼠主动脉平滑肌细胞,采用实时荧光定量核酸扩增(qPCR)检验干扰及过表达效率。同时通过qPCR及Western blotting检测对照组、shPKD1组及ETS-1组小鼠主动脉平滑肌细胞自噬标志分子Atg5、Beclin1和LC3的表达水平。结果与正常对照组相比,shPKD1组PKD1 mRNA表达量下降(P<0.05),而ETS-1组ETS-1 mRNA及PKD1 mRNA表达量明显升高(P<0.05)。与对照组相比,shPKD1组自噬标志物Atg5和Beclin1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05),ETS-1组Atg5和Beclin1 mRNA表达水平明显升高(P<0.001)。与对照组相比,shPKD1组Atg5、Beclin1和LC3蛋白表达水平明显降低(P<0.05),ETS-1组Atg5、Beclin1和LC3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论PKD1基因的表达能够影响小鼠主动脉平滑肌细胞自噬,即PKD1基因表达下调可抑制主动脉平滑肌细胞自噬,而PKD1基因过表达能够促进小鼠主动脉平滑肌细胞自噬。     

B淋巴细胞瘤-2蛋白多位点磷酸化在大鼠脊髓损伤后细胞自噬中的表达研究

目的探讨大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后细胞自噬的变化及其与B淋巴细胞瘤-2(Bcell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白多位点磷酸化的关系。方法取40只8周龄雄性SD大鼠,采用改良Allen法制备SCI模型;将造模成功的36只大鼠随机分为SCI组、自噬抑制剂组、自噬促进剂组,每组12只。另取12只大鼠仅切除椎板、不损伤脊髓,作为假手术组。造模结束后,自噬抑制剂组及自噬促进剂组分别于脊髓鞘内注射20μL600 nmol/L 3-甲基腺嘌呤、25 nmol/L雷帕霉素,假手术组及SCI组仅注射20μL生理盐水;每天1次,连续4周。造模后1 d及1、2、4周,采用BBB评分法评价各组大鼠后肢运动功能。末次注射后24 h处死各组大鼠并取脊髓组织,ELISA法检测脊髓组织中过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性及TNF-α、IL-1β水平;HE染色观察脊髓组织形态学变化;透射电镜观察脊髓组织中线粒体超微结构变化;免疫荧光染色检测自噬相关蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)蛋白表达;TUNEL染色观察脊髓组织神经细胞凋亡;免疫荧光双染检测LC3/TUNEL阳性细胞表达;Western blot检测细胞Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、Bcl-2及p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达。结果与假手术组相比,SCI组各时间点BBB评分降低,MPO活性、TNF-α、IL-1β水平升高;神经细胞周围间隙增大,细胞肿胀、出现空泡,线粒体中出现自噬小体;Beclin1及LC3蛋白阳性率、神经细胞凋亡率显著升高;LC3、TUNEL阳性细胞增多;Bax、p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低;以上指标比较差异均有统计学意义(P0.05)。与SCI组相比,自噬抑制剂组各时间点BBB评分降低,MPO活性、TNF-α、IL-1β水平升高;线粒体中出现少量自噬囊泡;Beclin1及LC3蛋白阳性率降低,神经细胞凋亡率显著升高;LC3阳性细胞减少、TUNEL阳性细胞增多;Bax、p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低。而自噬促进剂组结果与自噬抑制剂组相反;以上指标组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论大鼠SCI后通过诱导细胞自噬可降低神经细胞凋亡,保护脊髓功能,其机制可能与抑制Bcl-2蛋白多位点磷酸化有关。     

血管紧张素Ⅱ诱导内皮细胞外泌体促进腹主动脉瘤形成

目的探讨Ang Ⅱ诱导内皮细胞来源外泌体(VECs-AngⅡ exos)在小鼠腹主动脉瘤(AAA)发生发展的作用。方法使用8周龄雄性敲除Apoe小鼠皮下埋泵构建血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的腹主动脉瘤模型。提取并鉴定健康内皮细胞来源外泌体(VECs-exos)及Ang Ⅱ诱导内皮细胞来源外泌体(VECs-AngⅡ exos), 使用收集的外泌体(20 μg/ml)处理小鼠原代血管平滑肌细胞(VSMCs)。VECs-exos及VECs-AngⅡ exos每周尾静脉注射至腹主动脉瘤模型小鼠体内, 4周后获取小鼠动脉瘤组织行苏木精-伊红(HE)、EVG和马松(Masson)染色观察腹主动脉形态改变、弹性纤维断裂和胶原沉积。蛋白质印迹法(Western blot)检测小鼠动脉组织收缩型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、SM22α和CNN表达。采用t检验分析数据统计学差异。结果小鼠实验组动脉瘤发生率[(80.670±4.842)%, t=16.66, P<0.01]、最大主动脉直径[(0.554 3±0.096 2) mm, t=5.759, P<0.01)及主动脉质量比[(...     

体外循环对大鼠肺组织细胞自噬的影响

目的观察大鼠体外循环后肺组织损伤情况及自噬蛋白的变化, 探讨大鼠体外循环肺损伤是否与自噬有关。方法选取18只健康的雄性SD大鼠, 完全随机分为3组:假手术组(Sham组)、单纯体外循环组(CPB组)和体外循环左肺缺血再灌注损伤组(IR组), 每组6只, 每只大鼠用1%戊巴比妥麻醉后行气管插管辅助通气。Sham组行血管穿刺置管, 暴露左侧肺组织;CPB组行单纯体外循环;IR组建立体外循环左肺缺血再灌注损伤模型。于实验开始时(T1)、开放肺门后10 min(T2)和实验结束时(T3)采集各组大鼠外周动脉血做血气检查, 并计算呼吸指数(RI)和氧合指数(OI)。T3时刻用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测左肺支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6(IL-6)的浓度。用蛋白质免疫印迹法检测方法检测左肺组织中自噬相关蛋白微管相关轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Beclin-1及自噬相关基因-5(ATG-5)的浓度。光镜下观察大鼠左肺组织受损程度, 电镜观察左肺组织自噬小体的变化情况。采用单因素方差分析及t检验统计分析。结果 T3时刻, IR组OI低于CPB...     

高迁移率族蛋白1通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬促进骨髓干细胞的趋化及成骨分化

目的 探讨高迁移率族蛋白1（HMGB1）通过PTEN诱导假定激酶1（PINK1）/帕金蛋白(Parkin)介导的线粒体自噬对骨髓干细胞的趋化及成骨分化的影响。方法 将人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）分为7组：control组、siRNA-NC组、siRNA-HMGB1组、pcDNA-NC组、pcDNA-HMGB1组、pcDNA-HMGB1+siRNA-NC组、pcDNA-HMGB1+siRNA-PINK1组。采用Transwell检测细胞迁移能力;茜素红染色检测各组细胞中钙结节数目;ELISA检测骨桥蛋白（OPN）、碱性磷酸酶（ALP）的含量;RT-qPCR检测各组细胞中成骨细胞特异性转录因子（Osterix）、HMGB1及Runt相关转录因子2（RUNX2）、转录因子CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPα）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）水平;透射电镜检测线粒体自噬小体数目;Western Blot检测hBMSCs中Parkin及微管相关蛋白1A/1B-轻链3（LC3Ⅱ/Ⅰ）、选择性自噬接头蛋白62（P62）和自噬关键分子酵母Atg6同系物（Beclin1）等线粒体自噬相关蛋白的表达。结果 HMGB1通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬对hBMSCs的趋化作用研究表明：与pcDNA-NC组相比,pcDNA-HMGB1组HMGB1表达、细胞迁移率、线粒体自噬数目及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达增加,Parkin、P62等蛋白的表达降低（P＜0.05）;与siRNA-NC组相比,siRNA-HMGB1组HMGB1表达、细胞迁移率、线粒体自噬数目及Beclin-1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ等表达降低,Parkin、P62表达增高（P＜0.01）。HMGB1通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬对hBMSCs的成骨分化作用研究结果显示：与pcDNA-NC组相比,pcDNA-HMGB1组钙结节数量、Osterix及RUNX2含量、ALP及OPN的表达升高（P＜0.01）,PPARγ、C/EBPα的表达降低（P＜0.05）;与pcDNA-HMGB1+siRNA-NC组相比,pcDNA HMGB1+siRNA-PINK1组钙结节数量、Osterix及RUNX2含量、ALP及OPN的表达降低（P＜0.05）,PPARγ、C/EBPα的表达升高（P＜0.05）。结论 HMGB1高表达能通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬促进hBMSCs的趋化、成骨细胞分化及抑制成脂细胞分化,可能是骨质疏松症的潜在治疗靶点。     

蝉花菌丝联合海昆肾喜胶囊对糖尿病肾小管上皮细胞自噬-溶酶体通路的影响

目的探讨蝉花菌丝联合海昆肾喜胶囊对糖尿病肾病(DN)肾小管上皮细胞自噬-溶酶体的影响与机制。 方法将24只大鼠腹腔单次注射链脲佐菌素(STZ)诱导SD大鼠高血糖模型后,随机分为模型组(DN)和治疗组(DN+蝉花菌丝联合海昆肾喜胶囊),用药24周;另外10只未诱导高血糖大鼠设为对照组。检测各组大鼠肾功能指标,取肾皮质行组织病理学检查,采用Western印迹检测大鼠分离肾小管的胶原蛋白-Ⅲ、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转录因子EB(TFEB)、自噬泡标记蛋白LC3和自噬底物p62表达。将HK-2细胞分为牛血清白蛋白(Co-BSA)组、Co-BSA治疗组、糖基化终末产物-BSA(AGEs-BSA)组及AGEs-BSA-治疗组。Western印迹检测各组细胞p62、TFEB表达;以TFEB质粒转染HK-2细胞,通过RT-PCR检测过表达效率,观察各组HK-2细胞溶酶体红色荧光探针荧光强度,并检测各组细胞组织蛋白酶活性。 结果与对照组大鼠相比,模型组大鼠的血肌酐(Scr)、24 h尿蛋白水平增高、LC3、p62、胶原蛋白-Ⅲ和α-SMA表达明显增多,而肾小球滤过率(GFR)、TFEB表达明显减少。与模型组大鼠相比,治疗组大鼠的Scr、24 h尿蛋白均明显降低,GFR明显升高,LC3、p62、胶原蛋白-Ⅲ和α-SMA表达明显减少,TFEB表达明显增多。在HK-2细胞中,TFEB和p62的表达情况与在大鼠肾组织中相似。与Co-BSA组相比,AGEs-BSA组的探针荧光强度和组织蛋白酶活性明显减弱;过表达TFEB后,AGEs-BSA组的荧光强度和组织蛋白酶活性均明显增强。 结论蝉花菌丝联合海昆肾喜胶囊对糖尿病肾小管上皮细胞可能具有上调TFEB表达、调节自噬-溶酶体通路的作用。     

主动脉瓣膜间质细胞体外诱导钙化的实验研究

目的体外培养、诱导主动脉瓣膜间质细胞钙化,并观察其表型变化。方法使用胶原酶消化法从新鲜猪主动脉瓣膜上分离并体外原代培养主动脉瓣膜间质细胞,行免疫荧光染色细胞鉴定。取4~8代间质细胞,随机分为两组,实验组:以含甘油磷酸、维生素C、地塞米松的钙化培养基进行钙化诱导培养2周;对照组:以标准培养基培养2周。在光学显微镜下行钙化结节计数,茜素红染色观察并半定量检测钙沉积含量;采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测间质细胞α-平滑肌肌动蛋白(-αSMA)及钙化相关因子(骨钙素、骨桥蛋白、核心结合因子)的基因表达。结果从猪主动脉瓣膜上成功分离并体外培养瓣膜间质细胞,-αSMA及波形蛋白(vimentin)染色阳性,血管性血友病因子(vWF)染色阴性。间质细胞钙化诱导培育2周可成功诱导钙化,自发形成钙化结节,实验组钙化结节(156.25±17.38个/孔vs.2.50±1.29个/孔)和钙沉积(17.52±2.04 vs.1.00±0.22)显著高于对照组(P0.05);实时RT-PCR提示:实验组-αSMA、骨钙素、骨桥蛋白、核心结合因子等表达均较对照组明显升高(P0.05)。结论体外诱导钙化的瓣膜间质细胞呈现相对激活状态,表型向收缩表型和成骨表型转化,可能为瓣膜钙化的病理基础。     

HIF-1α介导缺氧环境下肝癌Bel-7402细胞自噬的激活

目的:探讨缺氧环境肝癌细胞自噬的激活与H IF-1α的关系。方法:将肝癌B el-7402细胞分为常氧组、缺氧+C on sh R N A组和缺氧+H IF-1αsh R N A组,将慢病毒介导的H IF-1αsh R N A转染细胞,继续培养36 h,W estern blot检测H IF-1α蛋白表达;吖啶橙(A O)荧光染色检测自噬溶酶体的形成,丹酰尸胺(M D C)荧光染色检测自噬小体的形成,并应用流式细胞技术定量自噬溶酶体或者自噬小体的荧光强度;W estern blot检测自噬激活的标志蛋白LC 3-Ⅱ表达。结果:慢病毒介导的H IF-1αsh R N A降低了缺氧诱导的肝癌细胞中H IF-1α蛋白的生成(缺氧+H IF-1αsh R N A组vs缺氧+C on sh R N A组,P0.01),H IF-1α降低后,细胞中自噬小体及自噬溶酶体明显减少(缺氧+H IF-1αsh R N A组vs缺氧+C on sh R N A组,P0.01),自噬激活标志蛋白LC 3-Ⅱ明显减少(缺氧+H IF-1αsh R N A组vs C on sh R N A组,P0.01)。结论:缺氧环境下H IF-1α介导了肝癌细胞自噬的激活。     

六味地黄丸含药血清通过诱导自噬对氧化应激状态下成骨细胞增殖的影响

目的 观察六味地黄丸含药血清对氧化应激状态下MC3T3-E1细胞增殖、活性氧及自噬水平的影响。方法 用过氧化氢(H₂O₂)模拟氧化应激状态后采用不同浓度的六味地黄丸含药血清干预MC3T3-E1细胞，CCK-8法检测细胞增殖情况；通过细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测细胞ROS水平；qRT-PCR检测自噬相关基因Beclin 1、LC3B mRNA表达情况；蛋白印迹法检测自噬相关蛋白Beclin 1、LC3B表达情况。结果 (1)CCK-8结果显示，H₂O₂会抑制成骨细胞的增殖，当其浓度为0.10 mmol/L时具有相对较小程度的抑制增殖效果；六味地黄丸含药血清可以促进氧化应激状态下成骨细胞的增殖，且当体积浓度为20%时促进增殖的效果最好。(2)细胞活性氧检测结果显示，六味地黄丸含药血清组ROS水平降低(P<0.05)。(3)qRT-PCR结果显示，六味地黄丸组Beclin 1、LC3B mRNA表达上调(P<0.05),且该作用会被自噬抑制剂所抑制...