吡非尼酮抑制兔耳增生性瘢痕作用的研究

目的探索局部注射吡非尼酮对兔耳增生性瘢痕的抑制作用。方法选取健康新西兰大耳白兔36只,在兔耳双侧分别构建增生性瘢痕模型后,将36只兔子随机平均分为溶剂对照组(A组)、吡非尼酮实验组(B组)和曲安奈德阳性对照组(C组)。待创面完成上皮化后开始给药。B组注射含150μg吡非尼酮的DMSO溶液,共30μl;A组注射等体积的DMSO;C组注射曲安奈德30μl,1次/d,连续注射3 d后改为1次/周,共2次。给药后第45天取材固定,常规HE染色及组织病理学分析,并计算瘢痕增生指数。通过Masson染色分析胶原纤维排列,PCR检测瘢痕组织中TGF-β1、TGF-β2和Col-Ⅰ等基因表达情况。结果 B组和C组与A组相比,吡非尼酮和曲安奈德均可显著降低兔耳瘢痕增生指数,减少瘢痕的高度,其颜色更加接近正常皮肤,胶原组织排列也更为整齐有序;瘢痕组织中TGF-β1、TGF-β2和Col-Ⅰ等的m RNA表达也均明显下降。结论吡非尼酮对兔耳增生性瘢痕的形成具有明显的抑制作用,其初步作用机制可能与抑制瘢痕组织中的TGF-β1和TGF-β2的表达有关。吡非尼酮可能通过下调TGF-β1与TGF-β2等基因的表达抑制了兔耳增生性瘢痕的形成。     

不同时期注射A型肉毒毒素对兔耳增生性瘢痕的影响

目的探讨不同时期注射A型肉毒毒素对兔耳增生性瘢痕的影响,以期发现A型肉毒毒素抑制瘢痕的最佳时间。方法自2018年9月到2019年3月华中科技大学同济医学院动物实验中心选取健康的新西兰大耳兔18只,兔耳健全,雌雄不限,体质量2~3 kg,制作瘢痕模型。根据A型肉毒毒素注射时间分为即刻组(A组)、10 d组(B组)、3周组(C组)共3组,每组均根据有无注射A型肉毒毒素分为注射组(A1组、B1组、C1组)和对照组(A2组、B2组、C2组),并于注射30 d后取材,每组注射前取材作为注射前对照组(A0组、B0组、C0组)。共造模18只兔,36只耳,每耳4个瘢痕模型,共计模型144个,每小组模型16个(2只兔)。注射时于各创面3点及9点位注射A型肉毒毒素(40 U/ml),每点2 U。观察创面瘢痕的生长情况并记录,标本取材固定后行HE染色,镜下测量各组瘢痕的厚度、计算成纤维细胞数量以及血管数量,并行Masson染色观察胶原纤维的分布与排列。结果A1、B1、C1组瘢痕厚度增长量较A2、B2、C2组低,注射组与对照组之间瘢痕厚度差值A、B组>C组,差异有统计学意义(χ²=19.486,P<0.05)。成纤维细胞增长量A1组B2组,注射组与对照组之间成纤维细胞数量差值B组最大,A组次之,C组最小,差异有统计学意义(χ²=30.535,P<0.05)。血管数量增长量A1组C2组,注射组与对照组之间血管数量差值A组>B、C组,差异有统计学意义(F=22.889,P<0.05)。A1、B1、C1组分别较A2、B2、C2组胶原纤维增生少,纤维束排列相对有序。结论创伤后即刻、10 d、3周注射A型肉毒毒素均可抑制兔耳增生性瘢痕,其中创伤后即刻注射最佳。A型肉毒毒素可减少瘢痕组织中的成纤维细胞数量及胶原纤维增生。血管数量减少可能是A型肉毒毒素抑制瘢痕的机制之一。     

兔耳增生性瘢痕模型建立方法的探讨

目的:探讨手术方法对兔耳瘢痕模型建立的影响。方法:建立三种兔耳皮肤创伤愈合模型,A组在切除兔耳皮肤的同时,切除皮下软骨及软骨膜;B组切除皮肤及软骨膜但保留软骨;C组只切除皮肤,保留软骨及软骨膜。对创伤愈合过程进行形态学和组织学观察,并在镜下测量瘢痕突出皮肤的高度。结果:①A、B、C三组平均创面愈合时间分别为(10.4±1.0)天、(17.8±1.6)天、(11.4±1.3)天,三组之间统计学比较有显著差异;②A、C两组伤后4～5天肉芽组织充满创面,B组在伤后第10天,肉芽组织开始在坏死软骨下向中心生长;③A、B、C三组瘢痕隆起高度为(1.20±0.56)mm、(1.68±0.73)mm、(1.15±0.50)mm,B组与A、C组统计学比较有显著差异。结论:保留软骨,切除皮肤和软骨膜能获得较大的瘢痕,可用于瘢痕治疗性实验;切除软骨形成瘢痕较小,可用于观察创面外用药物对瘢痕形成的影响。     

透明质酸及透明质酸酶对兔耳创面增生性瘢痕形成影响的对比研究

目的观察皮肤创伤愈合过程中外源性透明质酸(HA)及透明质酸酶(HAse)对愈合后瘢痕增生的影响.方法成年日本大耳白兔18只,建立兔耳皮肤创伤愈合模型,随机分成HA治疗组(a组),HAse治疗组(b组),磷酸盐缓冲液(PBS)对照组(c组),观察形态学及组织学变化,创面愈合速度,羟脯氨酸(HPr)含量测定及瘢痕测量.结果①3组平均愈合时间为(11.7±0.6)d、(9.8±0.9)d、(10.8±1.0)d,差异显著(P＜0.01).②在创伤愈合期a组胶原纤维较细,排列较整齐,b、c两组胶原纤维较粗大,排列紊乱;在瘢痕增生期3组胶原形态基本相似.③在创伤愈合初期,a组伤口内HPr含量明显低于b、c两组(P＜0.01),在愈合晚期和瘢痕增生期差异逐渐减小b组HPr含量始终高于a、c两组(P＜0.01).④a、b、c三组相对瘢痕厚度分别为(1.55±0.35)mm、(1.89±0.39)mm、(1.59±0.29)mm,b组瘢痕大于a、c两组(P＜0.05);a组与c组间无显著差异.结论①创面外用HA不能减轻愈合后瘢痕增生.②创面外用HAse能促进愈合后瘢痕增生.     

细菌纤维素对兔耳增生性瘢痕中羟脯氨酸含量的影响

目的：观察细菌纤维素（BC）对兔耳增生性瘢痕的影响。方法：成年新西兰白兔30只,全麻下建立兔耳腹侧增生性瘢痕模型。在术后第21天（创面上皮化）后,根据每只兔耳5个不同瘢痕面随机给予不同处理方式分为5组,分别为3组实验组（贴敷持水性不同的细菌纤维素（BC）膜,A组BC（1：5）、B组BC（1：6）、C组BC（1：8））和2组对照组（贴敷疤痕贴的为阳性对照D组,未贴任何敷料且瘢痕自然生长的为阴性对照E组）。在给予瘢痕面不同处理方式之后的第0天、第14天、第21天、第28天、第42天、第56天分别切取标本行羟脯氨酸（Hpr）含量检测。结果：A、B、C三组瘢痕Hpr含量高于D组但低于E组（P〈0.01）;A、B、C、三组瘢痕Hpr含量分别比较A〉B〉C组（P〈0.05）。结论：兔耳创面愈合后增生性瘢痕贴敷的细菌纤维素抑制了兔耳瘢痕的增生,各组细菌纤维素减轻增生性瘢痕效果比较A组〈B组〈C组。     

他莫昔芬软膏对兔耳增生性瘢痕中TGF-β2表达的影响

目的 观察不同浓度他莫昔芬软膏对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞和转化生长因子的影响,并探讨其防治增生性瘢痕的可行性.方法 采用兔耳增生性瘢痕模型,将96只新西兰长耳兔共576个耳创面随机分为实验A、B、C组和对照组D组,每组创面144个,实验A、B、C组分别外涂不同浓度(0.5%,1%,2%)的他莫昔芬软膏,D组则涂以空白软膏,分别于术后30、60、90 d切取增生的瘢痕组织,测量瘢痕厚度、观察瘢痕组织形态学变化,并检测成纤维细胞密度及瘢痕组织中TGFβ2 含量变化.结果 ①30 d时,A、D组与B、C组瘢痕厚度差异有统计学意义(P＜0.05),A、D组＜B组＜C组;成纤维细胞密度与TGF-β2 含量则相反,A、D组＞B组＞C组(P＜0.05).② 60、90 d时,4组瘢痕厚度、成纤维细胞密度及TGF-β2 含量差异有统计学意义(P＜0.05),A、B、C、D组TGF-β2含量60 d时分别为:(43.97±3.63)μg/L、(41.92±3.91)μg/L、(36.69±4.15)μg/L、(54.90±4.71)μg/L,90 d时分别为:(45.69 ±2.63)μg//L、(40.43±3.87)μg/L、(38.76±3.24)μg//L、(52.59±4.92)μg/L;成纤维细胞密度60 d时A、B、C、D组分别为:(4 392.07±327.84)个/mm2、(4 208.57±329.76)个/mm2、(4 033.44±427.91)个/mm2、(4 863.03±387.98)个/mm2,90 d时分别为:(4 418.41 ±432.52)个/mm2、(4 077.65 ±386.70)个/mm2、(3 844.53 ±354.29)个/mm2、(4 838.64±390.52)个/mm2,D组＞A组＞B组＞C组(P＜0.05).结论 外用他莫昔芬可降低TGF-β2,减少成纤维细胞数目,引起瘢痕萎缩,从而防治瘢痕增生.

Abstract：

Objective To observe the effect of different concentration of Tamoxifen ointment on the fibroblasts and transforming growth factor (TGF-β2) of hypertrophic scar at rabbit ears, so as to explore the possibility of treatment of hypertrophic scar with Tamoxifen. Methods The hypertrophic scar model was established in 96 New Zealand rabbits' ears. The wounds were divided into four groups (A, B, C and D) , with 144 wounds in each group. Different concentration of tamoxifen ointment(0. 5% ,1% ,2% ) was topically administered in groups A, B and C respectively, and blank ointment in group D. On postoperative (54. 90 ±4. 71) μg/L, respectively, on 60th day; and (45. 69 ±2.63) μg/L, (40. 43 ±3.87) μg/L, (38. 76 ±3. 24) μg/L, (52. 59 ±4. 92) μg/L, respectively, on 90th day. The fibroblasts density of scar in groups A, B, C, D was (4 392. 07 ± 327. 84 ) point/mm2, ( 4 208. 57 ± 329. 76 ) point/mm2, (4 033.44 ±427.91) point/mm2, (4 863.03 ±387.98) point/mm2, respectively, on 60 th day; and (4 418. 41 ±432. 52) point/mm2, (4 077. 65 ±386. 70) point/mm2, (3 844. 53 ±354. 29) point/mm2,(4 838.64 ±390.52) point/mm2, respectively, on 90th day. The content of TGF-β2 and fibroblasts density of scar were lined up as group D ＞ group A ＞ group B ＞ group C ( P ＜ 0. 05 ) . Conclusions Topical Tamoxifen'can reduce the content of TGF-β2 and fibroblast, decrease fibroblasts density and the formation of hypertrophic scar at rabbit ears. It offers a new way for the treatment of the hypertrophic scar.     

A型肉毒毒素局部应用对兔耳增生性瘢痕创面愈合和瘢痕增生的影响

目的 研究A型肉毒毒素对兔耳增生性瘢痕组织的影响.方法 8只日本大耳白兔,体重3 kg,建立兔耳增生性瘢痕模型.将兔耳创面分为A型肉毒毒素治疗组(T组)和瘢痕组(S组),每组48个创面.大体观察创面愈合时间和瘢痕增生情况.术后28 d,同法另取4只兔子的兔耳腹面健康皮肤为空白组(B组),收集标本.测量S、T组标本HE切片的瘢痕增生指数HI,流式细胞仪分析2组标本中成纤维细胞的细胞周期,western-blot检测S、T、B组标本中Ⅰ、Ⅲ型胶原的蛋白表达.结果 ①T组标本的瘢痕增生指数HI较S组显著降低,P<0.01;②蛋白水平上,T组的胶原Ⅰ、Ⅲ蛋白表达和胶原Ⅰ/Ⅲ比值均较s组显著降低,P<0.01;③S组分布于G2-M期和S期的成纤维细胞较T组显著增多,而静止期G0-G1的细胞则显著减少,P<0.05.结论 A型肉毒毒素局部应用能抑制兔耳增生瘢痕的形成.抑制成纤维细胞的增殖活性,减少瘢痕组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成,降低胶原Ⅰ/Ⅲ比值,为其治疗增生性瘢痕的临床应用提供了一定的理论依据.     

A型肉毒毒素对兔耳增生性瘢痕组织中P物质、β1转移生长因子、α平滑肌肌动蛋白的影响

目的探讨A型肉毒毒素（botuliniumtoxintypeA,BTA）对兔耳增生性瘢痕组织中P物质（substanceP,SP）、β1转移生长因子（transforminggrowthfactorbeta一1,TGF—β1）和α平滑肌肌动蛋白（alphasmoothmusleactinA,αSMA）的影响及意义。方法12只日本大耳白兔,体重3kg,建立兔耳增生性瘢痕模型。将兔耳创面分为BTA注射组（I组）和瘢痕组（S组）,每组72个创面。大体观察创面愈合时间和瘢痕增生情况,统计术后14d时的创面愈合率。术后28d时,同法另取6只兔子的兔耳腹面正常皮肤为空白对照组（C组）,收集3组标本。实时定量PCR检测各组标本中SP、TGF-β1和α—SMA的mRNA含量,Western印迹法检测α—SMA的蛋白表达。结果（1）术后14d,Ⅰ组与S组的创面愈合率的差异无统计学意义;（2）1组SP和TGF一β1、α—SMA的mRNA含量较S组显著降低,但仍高于C组（P〈0．05）;（3）蛋白水平上,3组的α—sMA表达两组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）,且S组〉Ⅰ组〉C组。结论BTA注射不延迟创面愈合,并减少了兔耳增生瘢痕中SP、TGF-β1和α—SMA的mRNA表达,为其治疗增生性瘢痕的临床应用提供了一定的理论依据。     

IFN-γ抑制兔耳创面瘢痕形成中PTK活性变化

目的:观察在兔耳创面愈合前后使用IFN-γ对瘢痕形成的影响并检测瘢痕组织中PTK活性的变化,探讨二者间的关系。方法:在兔耳腹侧伤口愈合前(A组)和后(C组)以及连续使用IFN-γ(B组),观察瘢痕形成情况并测定正常兔耳皮肤、创面上皮化时(12-14天)及其后3天、7天、14天和21天时瘢痕组织中PTK活性变化。结果:A、B和C组瘢痕组织中PTK活性变化规律与对照侧相同:上皮化后活性均逐渐升高,和正常皮肤组织比较(P<0.001),21天时基本恢复正常皮肤的水平;各组的处理侧在3天和7天时以及A、B组上皮化时PTK活性高于对照侧(P<0.05)。IFN-γ能抑制瘢痕增生,以A组和B组作用最强(P<0.05)。结论:创伤愈合后瘢痕组织中PTK活性升高提示PTK介导的信号可能参与瘢痕改建过程。不同时期使用IFN-γ能进一步活化PTK并显著抑制瘢痕增生意味着IFN-γ的抑制作用可能经活化PTK介导。     

强脉冲光对兔耳增生性瘢痕微血管影响的定量分析

目的 研究580 nm强脉冲光(IPL)对兔耳增生性瘢痕微血管的影响.方法 选择12只健康的大耳白兔,建立兔耳腹侧面增生性瘢痕模型,随机分为A、B、C三组,每组4只,每只兔的两只耳分别设为实验组(s)和对照组(n).采用相同波长不同能量和脉宽的IPL对A(s)、B(s)、C(s)组的兔耳进行分别照射,共照射5次,每次间隔14 d.分别于5次照射后的不同时间切取A(s)、B(s)、C(s)组和A(n)、B(n)、C(n)组增生性瘢痕组织,进行HE染色及电镜观察,并利用CD34 血管内皮细胞可靠标记显示瘢痕微血管的构筑情况.结果 实验组增生性瘢痕微血管数量较对照组明显减少,血管的管径较对照组,变细,两者比较其筹异有统计学意义(P＜0.05);实验组之间血管的数量和管径的差异也有统计学意义(P＜0.05).IPL能量越大、脉宽越宽,对于微血管的封闭作用越强.结论 580 nm IPL通过破坏瘢痕内的微血管,可有效地改善增生性瘢痕的颜色、高度、质地等.对增生性搬痕早期毛细血管的扩张过程进行了有效干预,因此,也可用于预防创伤后的瘢痕增生.     

TGF-β1和IGF-1共同转染大鼠BMSCs向软骨细胞分化的实验研究

目的 探讨应用TGF-β1和IGF-1基因转染大鼠BMSCs后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果,为构建新型的组织工程软骨种子细胞提供思路. 方法 6周龄健康雄性Wistar大鼠2只,体重约150 g.扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-TGF-β1,酶切、电泳鉴定并测序.采用密度梯度离心法和贴壁分离法,分离、纯化Wistar大鼠BMSCs,倒置相差显微镜观察原代和传代BMSCs形态学改变,免疫荧光法检测细胞表面标志.将TGF-β1和IGF-1基因单独或共转染第3代BMSCs,按转染情况分为5组未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染TGF-β1组(C组)、转染IGF-1组(D组)、TGF-β1与IGF-1共转染组(E组).对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,RT-PCR和Western blot法检测筛选后细胞的表达. 结果 电泳显示IGF-1和TGF-β1两目的基因条带,基因测序与Gene-Bank cDNA序列相符.大鼠BMSCs原代细胞接种24 h后可见少量贴壁突起细胞,4、5 d开始形成典型的BMSCs簇状增生,9、10 d细胞生长即可达80%～90%融合;传代后细胞形态较均一.免疫荧光法检测BMSCs的CD29、CD44呈阳性反应,CD34、CD45呈阴性反应.转染24 h后有少量细胞死亡,筛选3周后细胞克隆形成,至第4周细胞可传代,多数细胞变成多边形,部分细胞边界不清,呈圆形,核偏位,核周颗粒明显.MTT法测定A、B、C、D、E组细胞在490 nm波长处的吸光度(A)值,分别为0.432±0.038、0.428±0.041、0.664±0.086、0.655 ±0.045和0.833 ±0.103.A、B组与C、D、E组间差异均有统计学意义(P＜0.01),但A、B组以及C、D、E组间差异无统计学意义(P＞0.05).RT-PCR和Westernblot检测目的基因和蛋白的表达量,TGF-β1表达以C组最多,分别为0.925 ±0.0220、124.341 7 ±2.982 0,E组次之,分别为0.771 7±0.012 0、101.766 7±1.241 0(P＜0.01);IGF-1表达以E组最多,分别为1.0200±0.026 0、128.171 7±9.152 0,D组次之,分别为0.465 0 ±0.042 0、111.045 0 ±6.248 0(P＜0.01);Ⅱ型胶原表达以E组最多,分别为0.980 0 ±0.034 0、120.355 0 ±12.550 0,C组次之,分别为0.720 0 ±0.026 0、72.246 7 ±7.364 0(P＜0.01). 结论 通过TGF-β1和IGF-1基因共同转染BMSCs修复软骨缺损是一个较有前景的发展方向,对组织工程软骨应用于临床具有重要意义.     

局部应用卡托普利凝胶对兔耳增生性瘢痕作用的实验研究

目的观察局部应用卡托普利对兔耳增生性瘢痕的作用。方法将12只日本大耳白兔随机分为:卡托普利组(3只);空白对照组(3只);瘢痕组(3只);正常兔耳对照组(3只)。前3组每只耳朵建立5个兔耳瘢痕,总计90个增生性瘢痕。卡托普利组于术后21天开始局部应用10mg/ml卡托普利羧甲基纤维素胶,28天取材,进行大体观察,组织学检测。结果卡托普利组兔耳增生性瘢痕的瘢痕增生指数、表皮厚度指数较瘢痕对照组分别减少了34.1%、41.5%,真皮内的胶原含量为瘢痕对照组的68.8%(P<0.05)。结论局部应用ACE抑制剂卡托普利能改善兔耳增生性瘢痕的增生。     

兔耳增生性瘢痕血管生成及腺病毒转染基因重组血管生成抑制因子1

目的 研究不同时期兔耳增生性瘢痕组织血管生成,探索新的增生性瘢痕防治方法. 方法 19 只日本大耳白兔,体重2.0～2.5 kg,制备兔耳增生性瘢痕模型.其中8只于创面上皮化后10、30、60及90 d行微血管计数、微循环监测及HE染色观察.另11只选择每只兔的左、右侧耳为实验组及对照组,于上皮化后10 d,实验组兔耳瘢痕局部多点注射基因重组血管生成抑制因子1 (adenovirus extracellular protein with metalloprotease and thrombospondin 1domains,Ad-METH1) 重组腺病毒40 μL,对照组注射等量空载腺病毒.取 1 只兔于注射后3 d,采用 RT-PCR 和 Westernblot 方法检测基因转染后瘢痕组织中 METH1 mRNA 和蛋白的表达.余 10 只兔注射后30 d,行两组大体观察、微血管计数及 HE 染色. 结果 上皮化后10、30、60 及 90 d 瘢痕组织微血管计数分别为(42.37±3.89)、(49.46±4.13)、(33.12±4.34) 及 (13.24±2.31) 支;瘢痕组织微循环灌注分别为(37.75±2.11)、(59.87±6.46)、(44.53±6.14) 及 (29.21±1.84) PU;上皮化后10～60 d微血管计数及血流灌注值明显高于上皮化后90 d,差异均有统计学意义(P<0.05).兔耳创面上皮化后10～30 d组织学为瘢痕增生早期和增生期表现;60 d时仍为增生期表现,但已出现成熟迹象;90 d时大部分瘢痕软化,为成熟期表现.Ad-METH1 注射后 3 d,实验组 METH1 mRNA 及蛋白有较高水平的表达,对照组未检测到靶基因表达;注射 Ad-METH1 后 30 d,大体观察:实验组瘢痕颜色接近正常兔耳肤色,质地接近正常;对照组瘢痕明显高出兔耳腹侧皮面,质地坚硬;瘢痕组织微血管计数实验组为(12.38±2.56)支,对照组为(48.12±6.46)支,组间比较差异有统计学意义(P<0.01).组织学染色显示实验组瘢痕微血管分布较少,成纤维细胞散在,胶原排列有序;对照组见大量成纤维细胞,血管分布丰富,胶原纤维粗大、排列紊乱. 结论 血管生成与增生性瘢痕的形成有密切关系,血管抑制基因治疗有望成为一种有效的增生性瘢痕防治方法.     

TGF-β和α-SMA在瘢痕组织中的表达及相关性研究

目的 检测转化生长因子－β（ＴＧＦ－β１,ＴＧＦ－β２,ＴＧＦ－β３）在增生性瘢痕和表浅性瘢痕中的表达,探讨其对增生性瘢痕的形成及α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ表达的可能作用。方法 采用免疫组化法检测２８例增生性瘢痕,１９例表浅性瘢痕和１６例正常皮肤组织中ＴＧＦ－β和α－ＳＭＡ的表达水平,并按年龄,性别,病程分组进行比较及ＴＧＦ－β和α－ＳＭＡ相关性分析。     

Comparison of the effectiveness of gene therapy with transforming growth factor-β or extracorporal shock wave therapy to reduce ischemic necrosis in an epigastric skin flap model in rats

The induction of neoangiogenesis by exogenous growth factors in failing skin flaps has recently yielded promising results. Gene transfer with virus vectors has been introduced as a highly capable route of administration for growth factors, such as vascular endothelial growth factor or fibroblast growth factor. Extracorporal shock waves (ESW) deliver energy by means of high amplitudes of sound to the target tissue and have been shown to induce angiogenesis. We compared the effectiveness of gene therapy with adenovirus-mediated transforming growth factor-beta (TGF-beta) and ESW therapy to treat ischemically challenged epigastric skin flaps in a rat model. Thirty male Sprague-Dawley rats were divided into three groups of 10 each with an 8 x 8 cm epigastric skin flap. Rats received either subdermal injections of adenovirus (Ad) encoding TGF-beta (10(8) pfu) or ESW treatment with 750 impulses at 0.15 mJ/mm2. The third group received no treatment and served as a control group. Flap viability was evaluated after 7 days and digital images of the epigastric flaps were taken and areas of necrotic zones relative to total flap surface area calculated. Histologic evaluation and increased angiogenesis were confirmed by CD31 immunohistochemistry. Overall, there was a significant increase in mean percent surviving area in the Ad-TGF-beta group and the ESW group compared to the control group (ESW group: 97.7 +/- 1.8% vs. Ad-TGF-beta: 90.3 +/- 4.0% and control group: 82.6 +/- 4.3%; p < 0.05). Furthermore, in the ESW group mean percent surviving areas were significantly larger than in the Ad-TGF-beta group (ESW group: 97.7 +/- 1.8% vs. Ad-TGF-beta: 90.3 +/- 4.0%; p < 0.05). Flap vascularization was increased by Ad-TGF-beta and ESW with numerous vessels, however, there was no significant difference between the two treatment groups. We conclude that treatment with ESW enhances epigastric skin flap survival significantly more than Ad-TGF-beta treatment and thus represents a modality that is feasible, cost-effective, and less invasive compared to gene therapy with growth factors to improve blood supply to ischemic tissue.     

Adenovirus-mediated transforming growth factor-beta ameliorates ischemic necrosis of epigastric skin flaps in a rat model

BACKGROUND: Gene therapy has been recently introduced as a novel approach to treat ischemic tissues by using the angiogenic potential of certain growth factors. We investigated the effect of adenovirus-mediated gene therapy with transforming growth factor-beta (TGF-beta) delivered into the subdermal space to treat ischemically challenged epigastric skin flaps in a rat model. MATERIAL AND METHODS: A pilot study was conducted in a group of 5 animals pretreated with Ad-GFP and expression of green fluorescent protein in the skin flap sections was demonstrated under fluorescence microscopy at 2, 4, and 7 days after the treatment, indicating a successful transfection of the skin flaps following subdermal gene therapy. Next, 30 male Sprague Dawley rats were divided into 3 groups of 10 rats each. An epigastric skin flap model, based solely on the right inferior epigastric vessels, was used as the model in this study. Rats received subdermal injections of adenovirus encoding TGF-beta (Ad-TGF-beta) or green fluorescent protein (Ad-GFP) as treatment control. The third group (n = 10) received saline and served as a control group. A flap measuring 8 x 8 cm was outlined on the abdominal skin extending from the xiphoid process proximally and the pubic region distally, to the anterior axillary lines bilaterally. Just prior to flap elevation, the injections were given subdermally in the left upper corner of the flap. The flap was then sutured back to its bed. Flap viability was evaluated seven days after the initial operation. Digital images of the epigastric flaps were taken and areas of necrotic zones relative to total flap surface area were measured and expressed as percentages by using a software program. RESULTS: There was a significant increase in mean percent surviving area between the Ad-TGF-beta group and the two other control groups (P < 0.05). (Ad-TGF-beta: 90.3 +/- 4.0% versus Ad-GFP: 82.2 +/- 8.7% and saline group: 82.6 +/- 4.3%.) CONCLUSIONS: In this study, the authors were able to demonstrate that adenovirus-mediated gene therapy using TGF-beta ameliorated ischemic necrosis in an epigastric skin flap model, as confirmed by significant reduction in the necrotic zones of the flap. The results of this study raise the possibility of using adenovirus-mediated TGF-beta gene therapy to promote perfusion in random portion of skin flaps, especially in high-risk patients.     

红景天苷对大鼠BMSCs向胆碱能神经细胞分化的影响

目的探讨传统中药红景天苷诱导大鼠BMSCs向胆碱能神经细胞分化的作用及影响,以期为红景天苷应用于干细胞治疗神经系统疾病提供理论依据。方法取4～6周龄Wistar大鼠(体重约120 g)2只分离、培养BMSCs,并采用流式细胞仪鉴定。取第2代细胞,根据诱导方法不同将实验分为红景天苷诱导组(A组)、维甲酸诱导组(B组)和空白对照组(C组),A、B组BMSCs分别采用红景天苷(20μtg/mL)和维甲酸(5μmol/mL)诱导培养1、3、6、9 d,MTT法检测细胞增殖活力;细胞免疫荧光染色检测神经细胞相关标志分子神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase,NSE)、神经微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)、β-微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach)及NGF的表达;RT-PCR检测NSE、β-TubulinⅢ、GFAP、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)mRNA的表达;ELISA法测定培养液中BDNF和NGF含量;Western blot检测NGF蛋白表达水平。结果流式细胞仪检测显示,CD90和CD106阳性,CD34和CD45阴性,实验细胞为BMSCs。A、B组诱导培养6 d和9 d,细胞增殖活力较C组明显增强(P<0.05)。RT-PCR检测示,A组诱导培养6 d,NSE、BDNF、β-TubulinⅢ、GFAP mRNA表达丰度上调至峰值。B组诱导培养6 d,NSE mRNA表达丰度上调至峰值;1 d时BDNF mRNA表达丰度上调,6 d时达峰值;3 d时β-TubulinⅢmRNA表达丰度上调至峰值;1 d时GFAP mRNA表达丰度达峰值,与其余各时间点及C组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。各组各时间点均未见GABA mRNA表达。细胞免疫荧光染色示,诱导培养3 d,A、B组NSE、MAP2、β-TubulinⅢ和GFAP阳性率与C组比较差异均有统计学意义(P<0.01);A、B组诱导培养3、6、9 d,Ach阳性率均高于诱导培养1 d时及C组阳性率(P<0.01);A、B组各时间点NGF阳性率均显著高于C组(P<0.01)。ELISA法检测显示,A、B组诱导培养1、3、6、9 d时,BDNF、NGF表达水平均较C组上调(P<0.01),各时间点A、B组间BDNF表达水平比较差异无统计学意义(P<0.01)。Western blot检测显示,A组诱导培养6 d、B组诱导培养3 d时NGF蛋白表达最高。结论红景天苷能定向诱导大鼠BMSCs分化为胆碱能神经细胞。     

Temporal expression of the transforming growth factor-Beta pathway in the rabbit ear model of wound healing and scarring

BACKGROUND: Despite numerous studies that have investigated the cellular and molecular mechanisms underlying scar formation, this process still remains poorly understood. The importance of transforming growth factor-beta (TGF-beta) in these processes has been well recognized, and this study sought to define the temporal expression of the key members in this pathway in a well-established, clinically relevant, rabbit ear model of hypertrophic scarring. STUDY DESIGN: Seven-millimeter (hypertrophic) and 5-mm (nonhypertrophic) punch wounds were made on the ears of 12 rabbits. Wounds were harvested at days 0, 7, 15, 28, and 40. RESULTS: There were no appreciable histologic differences between the 5- and 7-mm wounds at days 7 and 15. At day 28, however, the 7-mm scars were considerably more hypertrophic compared with the 5-mm control scars (p<0.001). The mRNA levels of TGF-beta1 and collagen Ialpha2 were notably higher in the hypertrophic 7-mm scars at day 28 than in the nonhypertrophic 5-mm scars (p<0.03). Although not pronounced, levels of TGF-beta2 were higher in the hypertrophic scars. There were no other statistically significant differences between the 7- and 5-mm scars. CONCLUSIONS: Elevated levels of TGF-beta1, and possibly TGF-beta2, are associated with hypertrophic scar formation.     

HA复合rhBMP-2转染的BMSCs对羊胫骨延长骨愈合的影响

目的 评价HA复合rhBMP-2的腺病毒(adenovirus mediated rhBMP-2,Adv-rhBMP-2)转染的羊BMSCs对骨痂延长骨愈合的影响. 方法 成年山羊19只,雌雄不限,体重15～20 kg.于每只羊髂嵴上穿刺抽取骨髓10 mL,常规传代培养BMSCs.取第3代BMSCs,以感染复数200转染腺病毒.取0.25%胰蛋白酶消化转染后3 d的细胞1×108个,与HA充分混匀制备Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA.建立山羊右侧胫骨延长模型,术后立即于截骨部位注射自体细胞复合物.按术后注入物质不同随机分成4组A组为Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA组(n=6),B组为Adv-rhBMP-2/BMSCs组(n=5),C组为Adv-β-gal/BMSCs/HA组(n=4),D组为空白组(n=4).术后第7天开始行胫骨延长,速度1 mm/d,共延长4周.术后5、8、12周摄X线片观察骨痂生长情况,12周处死动物,取标本分别行骨密度检测、生物力学测定、组织学观察和骨形态计量学分析. 结果 X线片检查示,术后5、8周A、B组骨痂生成量明显多于C、D组,X线片定量评分A、B组明显高于C、D组,差异均有统计学意义(P＜0.05);12周各组均在骨延长部位形成连续骨痂.骨密度测定术后12周A、B、C、D组延长部位骨矿物质含量分别为(4.175 ±1.921)、(2.600 ±0.638)、(2.425±0.826)和(1.175 ±0.574)g,骨矿物质密度分别为(0.612 ±0.196)、(0.630 ±0.159)、(0.450 ±0.166)和(0.266 ±0.113)g/cm2,A、B组显著高于C、D组(P＜0.05).生物力学测定A、B、C、D组最大载荷分别为(490.20 ±155.08)、(350.59±80.48)、(221.95±68.79)和(150.65±92.29)N,弹性模量为(178.24±105.80)、(105.88 ±27.09)、(81.18±48.67)和(50.35±47.64)Mpa,各指标A组显著高于C、D组(P＜0.05).组织学观察见A组骨延长处大量新生骨组织,骨小梁多为纵行网状排列.骨形态计量分析示A、B、C、D组新骨体积分别为72.35%±5.68%、67.58%±7.42%、49.63%±4.87%和38.87%±2.35%,A组新生骨生成量明显比D组多(P＜0.05). 结论 HA复合rhBMP-2修饰的BMSCs制备的组织工程骨可促进羊胫骨延长骨愈合.     

6-O-羧甲基壳聚糖对兔耳增生性瘢痕的作用

目的 通过建立兔耳腹侧增生性瘢痕的模型,探讨6-O-羧甲基壳聚糖（carboxyl methyl chitosan,6-O-CM-CH）局部注射对瘢痕的作用.方法 新西兰大白兔12只,在兔耳腹侧制备直径约1 cm、深达软骨膜的圆形瘢痕123个,随机将新西兰大白兔分为A、B、C3组,每组4只.分别于术后第30天、第40天瘢痕组织内注射药物,于术后第35天、第45天取瘢痕样本,分析成纤维细胞密度、羟脯氨酸含量和瘢痕增生指数.A组为治疗组,瘢痕内注射6-O-CM-CH（500μg/ml）;B组为对照组1,注射曲安奈德（10 mg/ml）;C组为对照组2,注射生理盐水.结果 A组与C组相比,瘢痕组织HE染色和胶原染色均可见胶原成纤维细胞密度降低（P＜0.05）,羟脯氨酸含量降低（P＜0.05）,瘢痕增生指数降低（P＜0.05）,两组间差异有统计学意义;A组与B组相比较,成纤维细胞密度、羟脯氨酸含量、瘢痕增生指数差异均无统计学意义（P＞0.05）.结论 6-O-CM-CH局部注射对兔耳增生性瘢痕的抑制作用与曲安奈德相近,局部注射能够抑制兔耳增生性瘢痕.