Lin28调节小鼠胚胎干细胞向原始生殖细胞分化

目的 探讨小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)向原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)分化过程中特异基因表达变化及可能机制.方法 mESCs分化形成拟胚体(embryoid bodies,EBs),不同浓度atRA(1μM,2 μ M,5 μ M)持续诱导EBs 16h、2d和5d,RT-PCR、和免疫荧光分别检测Lin28和Blimp1以及相应蛋白的表达变化.结果 atRA诱导16h的EBs其Lin28 mRNA表达量较高,随着诱导时间延长而逐渐降低,Blimp1则无明显变化.WB结果显示EBs的Lin28蛋白表达随诱导时间延长逐渐减弱,而Blimp1蛋白表达逐渐增强.免疫荧光显示Lin28和Blimp1阳性信号均定位于细胞胞浆,其变化特点与WB结果相一致.结论 EBs经atRA诱导后可影响Lin28的表达,Lin28和Blimp1的变化并不协调,其蛋白表达随着诱导会随之发生变化.atRA诱导可能使PGCs分化的Lin28低水平表达时期提前出现.     

全反式视黄酸影响小鼠胚胎干细胞向原始生殖细胞分化的相关基因表达

目的 探讨全反式视黄酸(all-trans retinoic acid,atRA)诱导小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)向原始生殖细胞(Primordial germ cellS,PGCs)分化的相关基因表达改变及其机制.方法 mESCs分化形成拟胚体(embryoid bodies,Ebs),不同浓度atRA(1 μM,2 μM,5 μM)持续诱导Ebs 16h、2d和5d,观察Ebs形态变化,实时PCR和Western blot检测PGCs分化相关基因和蛋白表达变化.分析基因肩动子中RA反应元件,以Stra8(Stimulated by Retinoic Acid Gene 8,Stra8)基因为阳性对照,确定各基因对atRA刺激的原发性反应和继发性反应.结果 不同浓度atRA诱导Ebs 16h和2d后形态无明显变化.诱导后Ebs的PGCs分化相天基因mRNA表达分4种情况:16h内(Stra8)表达量达最大,然后下降;2d内(Scp3)表达量达最大,然后下降;5d达到最大量(Mvh);表达量无明显变化(Fragilis,Blimp-1和Prm1).Mvh表达符合继发反应特点;Stra8和Scp3表达符合原发反应特点;Blimp1,Prm1和Fragilis表达可能与atRA调节无关.Stra8蛋白变化与mRNA变化相一致,而Mvh则不一致.结论 atRA诱导mESCs向PGCs分化,各阶段标志基因表达变化均在相对短的时间内完成(2～5d),atRA诱导浓度可选用1 μM.根据基因表达模式初步得出,atRA调控的靶基因为Mvh,具备继发反应特点,与特异性分化有关,而Blimp-1、Fragilis和Prm1调控PGCs分化可能与atRA无关.     

不同基质蛋白对小鼠胚胎干细胞生殖细胞分化相关基因表达的影响

目的:探讨不同基质蛋白对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)分化形成拟胚体(embry-oid bodies,EBs)后生殖细胞分化相关基因表达的影响及机制。方法:mESCs分化形成EBs 3 d后接种于不同基质蛋白包被的培养皿中,包括人工基底膜(matrigel,M组)、纤维连接蛋白(fibronectin,F组)、层粘蛋白(laminin,L组)、胶原(collagen,C组)和非生物活性底物琼脂糖(agarose,A组),同时设不加任何基质蛋白的空白对照组(B组)。RT-PCR检测EBs在不同基质蛋白上d1～d4期间生殖细胞分化相关基因的表达,以及mESCs内源性基质蛋白FN(fibronectin)、LN(laminin)以及整合素受体β1基因的表达。结果:L组和F组EBs易贴壁分化,RT-PCR结果也证实原始生殖细胞(PGCs)分化基因Blimp-1、Stella、Mvh和减数分裂启动基因Stra8在L组和F组表达总体趋势为逐渐增强;M组和C组的表达趋势不明显;A组基因表达水平整体偏低;空白对照B组基因表达水平整体偏高但均呈下降趋势。L组和空白对照组细胞表达内源性基质蛋白FN、LN以及整合素受体β1。结论:层粘蛋白/β1信号途径可能对mESCs向PGCs分化具有指导作用,外源性层粘蛋白可能通过其受体β1亚单位传递诱导信号,调节mESCs来源的EBs向PGCs分化,FN可能通过其他整合素受体亚单位发挥作用。无任何外源性基质蛋白时,自身分泌的内源性基质蛋白也促进细胞分化。     

诱导多能干细胞体外向生精细胞自发分化潜能的研究

目的:探讨诱导多能干细胞(iPS)体外培养自发分化过程中生精细胞相关基因的表达,评估iPS体外向生精细胞自发分化的潜能。方法:经类胚体(EB)形成,体外诱导iPS向生精细胞分化,实时定量PCR和PCR检测生精细胞相关基因的表达。结果:实时定量PCR和PCR结果显示iPS经EB形成诱导分化后生精细胞不同时期的相关基因均有不同程度表达。iPS体外培养自发分化后生精细胞相关基因出现4种时间表达特征:Oct4基因表达量呈波浪状上升;Dppa3和Stra8基因表达量随诱导时间延长而下降;Dazl基因表达量呈波浪状下降;减数分裂前期基因Tex14、Msy2,减数分裂期基因Scp1、Scp3以及单倍体基因Akap3随着诱导时间延长先表达增加,而后表达下降。结论:iPS在经EB自发分化过程中表达生精细胞不同时期的相关基因,并且表达雄性配子单倍体基因,具有向雄性配子的分化潜能。     

诱导的多潜能干细胞类胚体分化过程中残留未分化细胞的研究

目的：探讨诱导的多潜能干细胞（induced pluri potent stem cells,iPS cells）通过类胚体长期分化后残留未分化细胞的特性。方法：小鼠iPS细胞株,体外类胚体分化20天后消化打散,重新给予i PS细胞常规培养液培养。观察扩增的残留细胞形态;流式细胞仪和免疫荧光染色检测和观察残留细胞表面标志物及体外再次分化能力。将残留细胞扩增后注射入裸鼠背部皮下,6周后注射部位取材进行大体和组织学检查。结果：分化20天的类胚体中存在残留未分化的细胞,呈克隆样生长,高度表达SSEA-1、CD-9和OCT-4等多潜能性标志。残留细胞能反复传代,并可在体外再次分化和残留。残留细胞注射部位形成畸胎瘤,瘤体组织中存在成熟的内胚层、中胚层和外胚层组织。结论：iPS细胞分化为类胚体后残留部分未分化细胞,残留细胞在体内、外可再次分化,并能在体外分化中再次残留。     

人诱导性多潜能干细胞向表皮样干细胞分化的实验研究

目的 探讨人诱导性多潜能干细胞( iPSC)向表皮样干细胞分化的可能性.方法 (1)以经过灭活处理的小鼠胚胎Fb株作为滋养层,将人iPSC株接种于其上,加入胚胎干细胞完全培养液培养,Ⅳ型胶原酶消化法传代,倒置相差显微镜下观察人iPSC形态及生长状况并行碱性磷酸酶(AKP)染色.以胚胎干细胞不完全培养液悬浮培养iPSC,观察拟胚体形成能力.(2)将人iPSC接种于铺有人羊膜的6孔培养板培养,设为诱导组;另于未铺羊膜的6孔培养板上培养iPSC,作为对照组.观察2组iPSC形态,免疫细胞化学染色法检测整合素β1和细胞角蛋白19( CK19)表达.结果 (1)人iPSC在胚胎干细胞完全培养液中呈典型的干细胞克隆状生长,边界清楚,增殖旺盛;AKP染色阳性.iPSC在无滋养层条件下悬浮培养可形成拟胚体.(2)诱导组iPSC经培养4d后形成干细胞克隆,部分细胞整合素β1和CK19表达阳性.对照组细胞大量死亡,未见整合素β1和CK19表达.结论 人iPSC在羊膜诱导下可定向分化为表皮样干细胞,有望成为皮肤组织工程新的种子细胞.     

维甲酸增加人胚胎干细胞形成拟胚体中生殖细胞特异基因标记

目的 探讨维甲酸在增加人胚胎干细胞(hESCs)形成拟胚体中生殖细胞特异基因标记中的作用. 方法 hESCs在含有维甲酸或无维甲酸的分化液中悬浮培养形成拟胚体,采用实时荧光定量PCR技术检测未分化因子OCT-4及生殖细胞特异性标记VASA、SCP3、GDF9和TEKT1的表达情况. 结果 在拟胚体形成过程中,未分化因子OCT-4表达下降,但生殖母细胞标记VASA、减数分裂标记SCP3及减数分裂后标记GDF9和TEKT1表达均增加.在含有维甲酸的分化系统中,生殖细胞特异性标记表达均增加.培养5d后,生殖细胞特异性标记VASA、SCP3、GDF9和TEKT1分别增加9.3、6.9、7.2和11.8倍. 结论 hESCs具有分化为原始生殖细胞(PGCs)和早期配子的能力.维甲酸能增加hESCs形成拟胚体中生殖细胞特异性标记的表达.     

牙髓干细胞研究进展

干细胞是一类具有自我更新、高度增生能力和多相分化潜能的细胞,能够产生高度分化的功能细胞,包括胚胎干细胞和成体干细胞。目前,已在体外成功地扩增出人体多种组织的成体干细胞,自从2000年Gronthos等[1]发现人牙髓组织中存在成体干细胞即牙髓干细胞（dental pulp stemcells,DPSCs）后,近十年来国内外学者对牙髓干细胞的培养、生物学特性、细胞表型、分化能力及重组为诱导性多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）等方面已进行了大量研究,本文就牙髓干细胞的研究现状综述如下。     

小分子化合物XAV939诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的探讨采用小分子化合物XAV939对体外培养小鼠胚胎干细胞(mESC)诱导分化为心肌细胞的可行性。方法复苏、培养未分化的胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)在小鼠胚胎成纤维细胞制作的滋养层上长至汇合,胰蛋白酶消化后经悬滴法形成拟胚体(EBs),拟胚体贴壁后用XAV939诱导分化为心肌细胞。通过光镜观察并记录跳动的心肌细胞,采用免疫荧光技术鉴定心肌细胞。结果 XAV939能有效地诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化,诱导平均效率为71.85%±1.05%;分化的心肌细胞自发而有节律地收缩,心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达呈阳性。结论小分子化合物XAV939能有效地诱导小鼠胚胎干细胞在体外分化为心肌细胞。     

Stra8:生殖细胞有丝分裂转变为减数分裂前特异表达的基因

Stra8(stimulated by retinoic acid gene 8)是哺乳动物生殖细胞由有丝分裂转变为减数分裂前特异表达的基因。Stra8在小鼠胚胎卵巢从前向后先后表达,从E12.5到E16.5持续约4d,Stra8表达后1d随之诱发减数分裂使减数分裂前期进行;在出生后睾丸开始Stra8的表达并诱发减数分裂,在胚胎性腺生殖细胞减数分裂的发生时间决定生殖细胞是朝雄性还是雌性的方向发育。视黄酸(retinoic acid,RA)的合成部位及CYP26b1的表达(降解RA的酶)调节Stra8基因表达。胞质Stra8蛋白增加导致生殖细胞进入减数分裂前期,但Stra8蛋白的功能还是未知的。     

诱导脂肪干细胞向表皮细胞表型的转分化研究

目的探讨脂肪干细胞（ADSCs）经诱导向表皮细胞转分化的可能性。方法（1）切取12例SD大鼠脂肪组织，用酶消化法分离和培养ADSCs，流式细胞仪检测第3代细胞的CD49d、CD44和CD106的表达以鉴定脚s；（2）诱导大鼠ADSCs向表皮细胞转分化的实验分组和处理：①含30％大鼠皮肤匀浆液的条件培养基组；②条件培养基中加入EGF（20μg／L）组；③含EGF（20μg／L）的10％FBSDMEM组；④10％FBSDMEM为对照组，各组诱导3d。（3）诱导后经流式细胞仪检测：①各组ADSCsCK19、CK14的表达。②条件培养基组诱导前、3d后ADSCs细胞周期。结果流式细胞仪检测CD49d、CD44和CD106阳性率分别为98．32％、90．38％和0．06％；各诱导组细胞CK19阳性率分别为10．44％、8．22％、4．49％，CK14阳性率分别为12．46％、8．19％、4．37％，均较对照组CK19阳性率1．38％、CK14阳性率1．7％升高（P〈0．01），差异有统计学意义。条件培养基诱导前ADSCs细胞周期：G1：67．25％、G2：2．46％、S：30．29％，诱导3d后ADSCs细胞周期：G1：35．04％、G2：0．00％、S：64．96％，细胞分裂增殖速度加快。结论ADSCs可以被诱导向表皮细胞表型转分化，提示ADSCs具有参与皮肤创面修复的潜能。     

从人胚胎胰腺中分离获得巢蛋白表达阳性的细胞

目的 探讨从人胚胎胰腺组织分离巢蛋白（Nestin)阳性细胞并进行体外传代培养的方法。方法 取引产的16、18、20周人胚胎胰腺组织，分离胰岛样细胞簇（Ialet-like cell clusters,ICCs），进行体外培养。用免疫组织化学和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测巢蛋白、胰十二指肠同源盒基因-1（Pancreatic and duodenal bomeobox gene-1,PDX-1/IPF-1)以及胰岛内分泌激素胰岛素和胰升糖素（Glucagon)的表达。结果 ICCs经体外培养可获得巢蛋白表达阳性细胞，这种细胞可进一步形成球状细胞簇，除有巢蛋白阳性细胞外，还有PDX-1，胰岛素和胰升糖素表达阳性的细胞。并且细胞可连续传代，结论 从人胚胎胰腺组织中可分离获得巢蛋白表达阳性细胞，这种细胞可在体外增殖并有向胰岛内分泌细胞分化的能力。     

Derivation of motor neuron‐like cells from neonatal mouse testis in a simple culture condition

Embryonic stem cell (ESC) therapy is an exciting way to treat neurodegenerative disease and central nervous system injury. However, many ethical and immunological problems surround the use of embryonic stem cells. Finding an alternative source of stem cells is therefore pertinent. In this study, spermatogonia stem cells (SSCs) were used to generate mature motor neurons. SSCs were extracted from neonatal testes and cultured in DMED/F12 medium for 3 weeks. Characterisation of SSC‐derived ESC‐like cells was confirmed by RT‐qPCR, immunostaining, alkaline phosphatase activity and their ability to form embryoid bodies (EBs). The EBs were induced by retinoic acid and Sonic hedgehog and trypsinised to obtain single induced cells. The single cells were cultured in neural medium for 18 days. Characterisation of neural precursors and motor neuron‐like cells was confirmed by RT‐qPCR and immunocytochemical analysis at the 7th day (early stage) and 18th day (late stage), respectively, of culturing. The neural precursors were found to be positive for nestin and Sox2, and a small fraction of cells expressed β‐tubulin III. Upon further differentiation, multipolar neurons were detected that expressed β‐tubulin III and MAP2 markers. Moreover, the expression levels of Olig2 and PAX6 were significantly lower, while HB9, Isl1 and Isl2 expression levels were higher at the late stage when compared to the early stage. These results show that SSCs have the potential to differentiate to motor neuron‐like cells and express markers specific for mature motor neurons. However, the functional ability of these cells remains to be evaluated in future studies.     

诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为唾液腺腺泡样细胞的实验研究

目的:探讨在共培养系统下大鼠骨髓间充质干细胞分化为唾液腺腺泡样细胞的实验.方法:以纯化1代SD大鼠颌下腺腺泡细胞和3代骨髓间充质干细胞作为共培养实验对象.实验分组:含唾液腺培养液的共培养组;含10%FBS、DMEM/F12的共培养组;含唾液腺培养液的非共培养组;含10%FBS、DMEM/F12的非共培养组.培养1个月经α-淀粉酶(α-amylase)免疫组化染色各组的MSCs,计算阳性细胞数得出MSCs的转化率,并且通过光镜和电镜鉴定细胞形态变化.结果:各组诱导的MSCs经α-amylase染色,共培养组阳性细胞数较非共培养组多(P＜0.05),且诱导成功的细胞在镜下形态类似于唾液腺腺泡细胞.结论:在共培养条件下成功实现了MSCs向 SGCs的形态学转化,唾液腺专用培养液能够提高SGCs的诱导效率.     

Induction of bone marrow CD34+ cells and endothelialization of polytetrafluoroethylene prostheses

BACKGROUND: The aim of the study was to investigate the endothelialization of prostheses with bone marrow CD34(+) cells. METHODS: CD34(+) cells were isolated from the canine bone marrow by an immune magnetic cell sorting system and induced into endothelial cells (EC) with vascular endothelial growth factor. Cells were seeded to polytetrafluoroethylene prostheses, which were implanted into the abdominal aorta artery and inferior vena cava. RESULTS: The isolated cells derived from bone marrow were CD34(+) cells by flow cytometry, which could differentiate into EC when induced by vascular endothelial growth factor. The neointima on control prostheses was significantly thicker than that on prostheses seeded with EC at the anastomosis and the centre where the prosthesis interposed to aorta. All control prostheses (4/4) interposed to veins were occlusive and two seeded prostheses (2/8) interposed to veins were already occluded. The overall occlusion rate of prostheses interposed to veins in seeded prostheses and control prostheses were 25 and 100%, respectively. However, the neointima on seeded prostheses was significantly thicker in the vein than that in the aorta. CONCLUSION: Bone marrow CD34(+) cells can be induced into EC by vascular endothelial growth factor in vitro. Polytetrafluoroethylene prostheses seeded with CD34(+) cells have the ideal endothelialization and patency.     

A comparison of intravenous and intradiscal delivery of multipotential stem cells on the healing of injured intervertebral disk

A major hurdle of cellular therapy for biological treatment of intervertebral disk (IVD) degeneration is the delivery method where current delivery methods are limited to intradiscal injection which can potentially cause further degeneration. Recent studies indicated that multipotential stem cells (MPSCs) from human umbilical cord blood home to injured sites and induce local therapeutic changes, thereby potentially addressing the drawbacks of direct delivery. We tested the effects of these cells on injured IVD using a mouse model of puncture‐induced degeneration via two delivery methods. Caudal IVD underwent needle puncture, and MPSCs were injected indirectly (intravenously), or directly (intradiscally) into the nucleus pulposus. IVD were harvested for histological, gene and protein analysis after 14 weeks. Our finding showed limited homing ability of the MPSCs. However, regardless of delivery method, no engraftment or expansion of MPSCs was observed at the injured site. Contrasting to direct injection, intravenous injection neither improved the degeneration status, nor preserve disk height, however, both delivery methods increased glycosaminoglycan (GAG) protein and Acan gene expression relative to controls, suggesting possible paracrine effects. Identifying the mechanisms by which MPSCs act on endogenous IVD cells would provide insights into the potential of these cells to treat IVD injuries and degeneration. © 2014 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 32:819–825, 2014.     

姜黄素对大鼠糖尿病神经病理性痛的效应

目的 评价姜黄素对大鼠糖尿病神经病理性痛(DNP)的效应.方法 雄性SD大鼠48只,随机分为6组(n=8):正常对照组(C组)、DNP组(D组)、DNP+二甲基亚砜组(DD组)和DNP+姜黄素50、100、200 mg/kg组(DC50组、DC100组和DC200组).D组、DD组、DC50组、DC100组和DC200组采用腹腔注射链唑霉素75 mg/kg的方法 制备糖尿病神经病理性痛模型,注射链唑霉素后14 d开始腹腔注射二甲基亚砜(姜黄素的溶媒)或相应剂量姜黄素,1次/d,连续2周.分别造模前2 d、注射链唑霉素后14 d、姜黄素给药1、3、7、14 d时测定机械缩足痛阚(MWT)和热缩足潜伏期(TWL),最后一次测定痛阈后处死大鼠,测定脊髓背角和背根神经节细胞核磷酸化JNK(p-JNK)和NF-кB p65的表达水平.结果 与C组相比,D组各时点MWT降低,TWL缩短,脊髓背角和背根神经节细胞核p-JNK和NF-кB p65表达上调(P<0.05).与D组相比,DC50组、DC100组和DC200组姜黄素给药期间MWT升高,TWL延长,且与剂量有关,脊髓背角和背根神经节细胞核p-JNK和NF-кB p65表达下调(P<0.05).结论 姜黄素可减轻大鼠糖尿病神经病理性痛,其机制可能与抑制脊髓背角和背根神经节JNK和NF-кB的激活有关.     

许旺细胞诱导下脂肪来源干细胞向神经细胞方向分化的研究

目的 探讨脂肪来源干细胞(ADSCs)和SD大鼠许旺细胞(Schwann cells)利用Transwell非接触式共培养时生长增殖特性和向神经元样细胞分化的规律.方法 取1月龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织,按酶原消化法获取脂肪来源干细胞,同时取大鼠坐骨神经按改良植块法获取许旺细胞.取P3代脂肪来源干细胞分三组:A组使用ADSCs和许旺细胞构建Transwell非接触式共培养体系,B组利用β-巯基乙醇(BME)、丁酸酯羟基茴香醚(BHA)作为脂肪来源干细胞诱导因子使其向神经方向诱导,C组脂肪干细胞为对照组.比较各组细胞形态,观察脂肪来源干细胞代谢、轴突生长、免疫荧光染色情况,并做统计学分析.结果 A组脂肪来源干细胞部分分化为具有细长突起的细胞,B组诱导培养后,大多数存活的细胞也同样转变为类似于神经元的形态,A组突起长度(11.64±1.64)μm,B组突起长度 (13.03±1.35)μm,差异有统计学意义(P>0.05),细胞生长代谢旺盛.A组B组诱导分化后的细胞NF表达阳性率分别为(54.16±9.35)%和(62.25±8.95)%,两者差异无统计学意义,而GFAP染色阴性.在细胞数量上,A组为(4.08±0.68)×107/L,C组(4.20±0.79)×107/L,差异无统计学意义(P>0.05),但明显高于B组(3.23±0.37)×107/L(P<0.05).结论 许旺细胞能促进脂肪来源干细胞向神经方向分化,效果与使用β-BME加BHA试剂诱导的结果相近,并能有效防止脂肪来源干细胞损伤.