基于数据挖掘分析低氧诱导因子-3α在头颈鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的探讨头颈鳞状细胞癌（HNSCC）患者中低氧诱导因子-3α（HIF-3α）的表达与其DNA甲基化水平的关系,研究HIF-3α表达异常对HNSCC患者预后的影响。 方法以肿瘤基因组（TCGA）数据库为研究基础,分析HIF-3α在530例HNSCC及50例正常头颈组织中的mRNA表达及DNA甲基化水平,独立样本t检验进行统计分析;Pearson相关性分析HNSCC组织中HIF-3α DNA甲基化水平与其mRNA表达之间的关系。Kaplan-Meier生存分析法研究HIF-3α表达与HNSCC患者的总生存率及无复发生存率之间的关系,Log-rank检验进行统计分析。对HIF-3α高表达组与低表达组肿瘤组织进行差异表达基因分析,同时对差异表达基因进行基因富集分析（GSEA）,研究其可能参与的生物学功能。 结果与正常组织相比,HNSCC组织中HIF-3α的mRNA表达水平降低,表达量分别为（4.809 ± 0.293）和（3.100 ± 0.092）,差异有统计学意义（t= 5.369,P<0.001）;而DNA甲基化水平升高,表达量分别（0.158 ± 0.010）和（0.362 ± 0.009）,差异有统计学意义（t= 6.806,P<0.001）;HNSCC组织中HIF-3α的mRNA表达水平与其DNA甲基化水平呈负相关（r=-0.46,P<0.001）;HIF-3α低表达的HNSCC患者总生存率及无复发生存率均显著低于HIF-3α高表达组（HR= 0.701,P= 0.02;HR= 0.517,P= 0.004）;GSEA基因富集分析发现,HIF-3α低表达组和高表达组差异基因主要富集在P53信号通路、凋亡通路和免疫反应通路。互作蛋白分析显示,HIF-3α可能与血管内皮生长因子A（VEGFA）、CREB结合蛋白（CREBBP）等相互作用。 结论HIF-3α在HNSCC中表达降低与其DNA甲基化水平升高密切相关,是潜在的预后预测分子指标。     

低氧增强自噬促进舌鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭

目的探讨低氧条件下对舌鳞状细胞癌（TSCC）自噬活性和迁移能力的影响。 方法应用含1% O₂的低氧培养箱培养TSCC UM1细胞,Western blot检测低氧诱导3、6、9、12、24 h后低氧诱导因子1α（HIF-1α）和自噬标记蛋白Beclin-1、自噬相关蛋白5（ATG5）和微管相关蛋白轻链3（LC3）的表达变化;细胞划痕实验检测低氧诱导后细胞迁移能力的改变;Transwell侵袭小室实验检测低氧诱导后细胞的侵袭能力;SPSS 13.0统计软件进行数据分析。 结果低氧条件下,与对照组（0.527 ± 0.055）相比,TSCC UM1细胞自噬体双层膜标记蛋白LC3Ⅱ的表达（1.206 ± 0.053）增加（t= 12.96,P<0.001）,同时自噬相关蛋白Beclin-1表达量（1.151 ± 0.078）较对照组（0.775 ± 0.062）明显提高（t= 6.736,P= 0.001）,ATG5的表达（1.231 ± 0.06）较对照组（0.711 ± 0.052）也明显上升（t= 7.834,P= 0.001）。与对照组相比,低氧诱导后细胞迁移能力（0.349 ± 0.024）较对照组（0.788 ± 0.037）明显增加（t= 9.918,P= 0.001）,细胞侵袭能力（23 ± 2）较对照组（71 ± 4）明显增强（t= 9.528,P= 0.001）。 结论低氧条件下可以增强TSCC细胞自噬活性,促进其迁移和侵袭。     

转录因子Nanog过表达对人牙髓细胞增殖及多向分化能力的影响

目的探讨过表达多能相关转录因子Nanog对人牙髓细胞增殖及多向分化能力的影响。 方法构建过表达Nanog的慢病毒载体质粒pSIN-EF2-Nanog-IRES-GFP-puro,采用psPAX和pMD2.G慢病毒包装系统转入293T细胞进行病毒液的生产和收取,转染生长良好的第3代人牙髓细胞,构建稳定过表达Nanog的人牙髓细胞株,以空载体转染的细胞为对照组,对细胞进行成脂及成牙本质诱导。采用BrdU法检测细胞的增殖情况,检测多能性转录因子Oct4和Sox2的表达,以及细胞成脂、成牙本质分化能力。采用单因素方差分析数据。 结果成功构建Nanog过表达的人牙髓细胞株;BrdU法检测结果显示,Nanog过表达组比对照组细胞增殖能力强（F = 90.421,P = 0.000）。过表达组Oct4、Sox2 mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组（F_{Oct4 mRNA} = 71.649,P_{Oct4 mRNA}=0.000;F_{Sox2 mRNA} = 106.278,P_{Sox2 mRNA} = 0.000;F_Oct4蛋白 = 41.632,P_Oct4蛋白 = 0.002;F_Sox2蛋白 = 38.962,P_Sox2蛋白 = 0.002）。在矿化诱导条件下,Nanog过表达组DSPP、DMP1和OCN表达量、矿化结节产生量高于对照组（F_DSPP = 15.261,P_DSPP<0.05;F_DMP1 = 16.235,P_DMP1<0.05;F_OCN = 17.019,P_OCN<0.05）;成脂诱导21 d后,Nanog过表达组LPL和PPARγ2表达量及脂质产生高于对照组（F_LPL = 15.542,P_LPL<0.05;F_PPARγ2 = 10.437,P_PPARγ2<0.05）。 结论过表达Nanog能提高人牙髓细胞增殖能力,促进多能性转录因子Oct4、Sox2的表达,增强细胞多向分化能力。     

低氧状态下骨细胞参与破骨细胞形成的作用机制研究

目的 探究低氧状态下骨细胞对破骨细胞形成的作用及其机制。方法 用去铁胺甲磺酸（DFO）刺激骨细胞系MLO-Y4建立体外低氧骨细胞培养体系。CCK-8实验检测DFO对MLO-Y4细胞增殖活性的影响;采用DFO处理后的MLO-Y4细胞培养液制备条件培养基诱导RAW264.7细胞分化,行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测;利用实时荧光定量聚合酶链反应、细胞免疫荧光和蛋白质印迹（Western blot）检测DFO作用下MLO-Y4表达低氧诱导因子（HIF）-1α与核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的情况;检测HIF-1α siRNA转染对MLO-Y4表达HIF-1α和RANKL的影响。结果 100 μmol·L ^-1 DFO作用24 h时MLO-Y4增殖活性升高,之后随着时间延长细胞增殖活性下降（P<0.01）。加入可溶性RANKL后,低氧组可见破骨细胞形成明显增加（P<0.001）。100 μmol·L ^-1 DFO作用下,HIF-1α mRNA表达稳定,RANKL mRNA的表达随时间明显变化,24 h时最高（P<0.01）;HIF-1α、RANKL蛋白表达升高（P<0.01）。低氧状态下siHIF-1α转染可降低HIF-1α和RANKL的表达（P<0.01）,破骨细胞减少（P<0.01）。结论 低氧状态下MLO-Y4可通过上调HIF-1α的蛋白水平促进RANKL的生成,进而加速RAW264.7细胞向破骨细胞分化。     

Notch信号促进核因子κB受体活化因子配体诱导的破骨细胞分化的体外研究

目的 探讨Notch信号抑制对核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导的小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响。方法 建立RANKL诱导的小鼠RAW264.7细胞体外分化模型,实时定量聚合酶链反应（real-time PCR）检测Notch信号成分（Notch1、Notch2、Delta1、Jagged1）、下游靶基因Hes1以及破骨细胞标志基因抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和Cathepsin K在诱导前后mRNA的表达。在诱导体系中加入不同浓度的γ分泌酶抑制剂（GSI）,抑制Notch受体的表达,TRAP染色检测破骨细胞分化的变化情况。结果 50 ng•mL-1 RANKL诱导小鼠RAW264.7细胞3 d,Notch1、Notch2、Delta1、Jagged1及Hes1的mRNA表达均有不同程度的提高,其中以Notch2、Jagged1增高最明显;破骨细胞标志基因表达显著增高。在RANKL诱导的同时加入不同浓度GSI,抑制Notch的表达,可致Notch下游靶基因Hes1表达下降,同时TRAP阳性细胞计数显著减少,且呈剂量依赖性。结论 Notch信号可促进RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分化。     

低氧状态下骨细胞参与破骨细胞形成的作用机制研究

目的 探究低氧状态下骨细胞对破骨细胞形成的作用及其机制。方法 用去铁胺甲磺酸（DFO）刺激骨细胞系MLO-Y4建立体外低氧骨细胞培养体系。CCK-8实验检测DFO对MLO-Y4细胞增殖活性的影响;采用DFO处理后的MLO-Y4细胞培养液制备条件培养基诱导RAW264.7细胞分化,行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测;利用实时荧光定量聚合酶链反应、细胞免疫荧光和蛋白质印迹（Western blot）检测DFO作用下MLO-Y4表达低氧诱导因子（HIF）-1α与核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的情况;检测HIF-1α siRNA转染对MLO-Y4表达HIF-1α和RANKL的影响。结果 100 μmol·L ^-1 DFO作用24 h时MLO-Y4增殖活性升高,之后随着时间延长细胞增殖活性下降（P<0.01）。加入可溶性RANKL后,低氧组可见破骨细胞形成明显增加（P<0.001）。100 μmol·L ^-1 DFO作用下,HIF-1α mRNA表达稳定,RANKL mRNA的表达随时间明显变化,24 h时最高（P<0.01）;HIF-1α、RANKL蛋白表达升高（P<0.01）。低氧状态下siHIF-1α转染可降低HIF-1α和RANKL的表达（P<0.01）,破骨细胞减少（P<0.01）。结论 低氧状态下MLO-Y4可通过上调HIF-1α的蛋白水平促进RANKL的生成,进而加速RAW264.7细胞向破骨细胞分化。     

MiR-520b调控 Wnt/β-catenin信号通路促进舌鳞状细胞癌侵袭转移

目的研究miR-520b在舌鳞状细胞癌（TSCC）中的表达,探讨其在TSCC侵袭转移过程中的作用及分子机制。 方法实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测TSCC组织及细胞系中miR-520b的表达;沉默或过表达TSCC细胞株SCC-9和UM1中miR-520b的表达后,实时荧光定量PCR检测细胞上皮-间质转化（EMT）相关基因表达;Transwell小室验证细胞侵袭转移能力改变;TOP/FO双荧光素酶报告基因系统、实时荧光定量PCR、Western blot等检测miR-520b表达对Wnt/β-catenin信号通路的影响;生物信息学、Western blot及双荧光素酶实验验证miR-520b调控Wnt/β-catenin信号通路的潜在靶基因Dickkopf 1（DKK1）。使用SPSS 21.0软件进行统计学分析,样本均数间比较采用Student′s t检验。 结果与正常相邻组织（2.59±1.43）相比,miR-520b相对表达量在TSCC组织中显著上调（5.28 ± 1.63）,差异有统计学意义（t = 16.04,P = 0.0005）,并且与患者中更具侵袭性的TSCC表型正相关（5.81 ± 0.74 vs. 3.08 ± 0.89,t = 12.11,P = 0.0011）;过表达miR-520b促进TSCC细胞侵袭转移（SCC-9：110.8 ± 17.8 vs. 74.7 ± 9.8,t_SCC-9 = 32.58,P_SCC-9 = 0.0011;UM1：178.8 ± 39.7 vs. 90.3 ± 22.5,t_UM1 = 99.67,P_UM1 = 0.0002）,低表达则相反（SCC-9：74.7 ± 9.8 vs. 30.9 ± 7.8,t_SCC-9 = -31.47,P_SCC-9 = 0.0024;UM1：90.3 ± 22.5 vs. 35.7 ± 10.6,t_UM1 = -37.89,P_UM1 = 0.0019）;此外,过表达miR-520b可靶向抑制DKK1,进而激活Wnt/β-catenin信号通路,促进TSCC细胞上皮-间质转化。 结论MiR-520b在TSCC中高表达,可能通过抑制DKK1增强Wnt/β-catenin信号通路,促进TSCC侵袭转移。     

FAM20C在体外培养人牙髓细胞中的表达及成牙本质向分化诱导对其表达的影响

目的研究人牙髓细胞（hDPC）体外培养传代过程中FAM20C的表达模式,及对hDPC成牙本质向分化诱导后FAM20C的表达变化。 方法蛋白免疫印迹法（Western blot）检测第1代至第7代（P1 ~ P7）hDPC中FAM20C蛋白的表达量;结果采用独立样本t检验;对P3代hDPC进行成牙本质分化诱导7和14 d后,反转录聚合酶链反应与Western blot检测FAM20C的mRNA和蛋白水平变化。牙本质涎磷蛋白（DSPP）、牙本质基质蛋白1（DMP1）表达变化,FAM20C的mRNA以及蛋白表达变化采用单因素方差分析。免疫荧光法检测FAM20C在hDPC中的分布。 结果体外培养的hDPC中可检测到FAM20C表达,表达量随细胞传代先增加后减少（t_P2=-10.177,P_P2= 0.001;t_P3=-18.242,P_P3<0.001;t_P4=-19.143,P_P4<0.001;t_P5=-7.452,P_P5= 0.002;t_P6= 1.357,P_P6= 0.246;t_P7= 1.099,P_P7= 0.334）;成牙本质向分化诱导7和14 d后,FAM20C的mRNA和蛋白表达量高于未诱导组细胞（F_{FAM20C mRNA}=86.252,P_{FAM20C mRNA,7 d}<0.001,P_{FAM20C mRNA,14 d}<0.001;F_FAM20C蛋白= 85.569,P_{FAM20C蛋白,7 d}= 0.002,P_{FAM20C蛋白,14 d}<0.001）。免疫荧光结果显示,成牙本质诱导前FAM20C蛋白表达于细胞核,诱导后主要表达于细胞质,诱导14 d FAM20C在细胞质中表达量高于诱导7 d。 结论hDPC中表达FAM20C,成牙本质向分化诱导上调其表达水平,诱导后在细胞质中表达较高,提示FAM20C与hDPC的成牙本质分化相关。     

低氧激活HIF-1α诱导舌鳞癌细胞上皮-间质转化

目的：探讨低氧微环境诱导人舌鳞癌细胞上皮-间质转化以及HIF-1α在该过程中的作用。方法 体外常氧（20% O₂）或低氧（1% O₂）状态下培养舌鳞癌SCC9、CAL27细胞48 h,Western免疫印迹和实时定量PCR检测上皮间质标记蛋白vimentin、fibronectin和E-cadherin的表达变化和HIF-1α的表达水平,Transwell小室检测细胞的迁移能力。通过小干扰RNA（HIF-1α-Si）转染舌鳞癌细胞,检测HIF-1α、vimentin、fibronectin与E-cadherin蛋白表达以及细胞迁移能力的变化。应用SPSS13.0软件包对数据进行独立样本t检验。结果 人舌鳞癌细胞SCC9、CAL27在低氧环境中培养48 h后,间质标志蛋白vimentin和fibronectin在蛋白和mRNA水平均显著升高,上皮标志蛋白E-cadherin表达降低,HIF-1α表达上调,细胞迁移能力显著增强。小干扰RNA（siRNA）转染舌鳞癌细胞SCC9、CAL27并于低氧下培养后,HIF-1α表达显著降低,vimentin和fibronectin表达也显著降低,E-cadherin表达升高,细胞迁移能力显著下降。结论 低氧通过上调HIF-1α表达而促进人舌鳞癌细胞发生上皮-间质转化及转移。     

雌二醇和白藜芦醇二聚体对颏舌肌成肌细胞HIF-1α的作用及机制

目的: 研究雌二醇（17β-estrodial,E2）和白藜芦醇二聚体（resveratrol dimer,RD）对低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）的作用及其分子生物学机制。方法: 提取小鼠颏舌肌成肌细胞,构建ERα敲降的成肌细胞（KD组）低氧模型,将成肌细胞（NS组）和KD组细胞分别低氧、低氧+E2、低氧+RD或低氧++E2+LY294002处理24 h, 利用Western免疫印迹方法检测信号分子T-Akt和P-Akt的表达,qRT-PCR和 Western免疫印迹检测HIF-lα的表达水平。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 低氧环境下成肌细胞HIF-1α的表达显著高于常氧（P<0.05）,E2或RD处理后,HIF-1α的表达水平显著低于低氧组（P<0.05）;ERα敲降后,低氧也促进HIF-1α的表达（P<0.05）,但是E2或RD+低氧处理组成肌细胞HIF-1α的表达与低氧相比无显著差异（P>0.05）,Western免疫印迹结果与RT-PCR结果趋势一致。PI3K/Akt通路抑制剂与E2共培养则促进HIF-1α的表达（P<0.05）。结论: ERα在E2或RD对小鼠颏舌肌成肌细胞HIF-1α的抑制中起主导作用,其下游PI3K/Akt信号通路在该抑制效应中也发挥重要作用。     

人牙髓干细胞在钛金属表面向成骨细胞样细胞分化的实验研究

目的：探讨矿化液诱导条件下人牙髓干细胞( human dental pulp stem cells,HDPSCs)在钛金属表面向成骨细胞样细胞分化的潜力。方法将HDPSCs接种于钛金属板表面,于第3、7d时观察其增殖状态。将HDPSCs接种于钛金属板表面进行矿化液诱导,于诱导的第0、3、5、7、14、21、28d时,采用RT-PCR检测其牙本质涎磷蛋白( DSPP)、碱性磷酸酶( ALP)、骨涎蛋白( BSP)和骨钙素( OCN)的基因表达。 Western印迹分析、免疫荧光检测BSP及OCN蛋白表达。对照组为矿化液诱导培养皿中的HDPSCs,检测指标、方法基本相同,免疫细胞化学染色检测OCN蛋白表达。结果钛金属板上 HDPSCs增殖迅速,表现出良好的生物相容性。两组细胞均自诱导第3天ALPmRNA呈高表达、DSPP始终不表达。培养皿组BSP、OCNmRNA于第5天开始表达,并随时间延长而表达增高;钛金属组BSP、OCNmRNA表达于第14天出现第一峰值,随后有所下降,28天再次升高。两组BSP蛋白表达趋势与其RT-PCR结果一致,第5天 OCN染色阳性。结论钛金属表面 HDPSCs 经矿化液诱导向成骨细胞样细胞分化。     

Hypoxia promotes mineralization of human dental pulp cells

Introduction

Dental pulp can be exposed to hypoxic conditions in case of trauma or inflammation. Dental pulp cells (DPCs) have mineralization potential, which plays a key role in pulp repair and reparative dentinogenesis process. Little information is available about DPC mineralization in hypoxic condition. The purpose of this study was to assess the influence of hypoxia on DPC mineralization to pave the way for a better understanding of dental pulp regeneration and reparative dentin formation.

Methods

Human DPCs were obtained by using tissue explant technique in vitro and cultured in normoxia (20% O₂) or hypoxia (5% O₂). Cell viability was investigated by methyl-thiazol-tetrazolium assay. Cell mineralization was assessed by von Kossa staining and alizarin red S staining. Important mineral genes such as osteocalcin (OCN), dentin matrix acidic phosphoprotein-1 (DMP-1), bone sialoprotein (BSP), and dentin sialophosphoprotein (DSPP) were determined by real-time polymerase chain reaction.

Results

Cell viability of DPCs increased more in hypoxia than in normoxia from day 3 to day 5. Von Kossa staining and alizarin red S staining showed DPCs in hypoxia had higher mineralization activity than in normoxia. Expression of mRNAs for OCN, DMP-1, BSP, and DSPP was greater in hypoxia than in normoxia.

Conclusions

These results imply that hypoxia promotes DPC mineralization.     

MEPE基因沉默对人牙髓细胞增殖与成牙本质分化的作用研究

目的：研究细胞外基质磷酸化糖蛋白（Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein,MEPE）基因沉默对人牙髓细胞（Human Dental Pulp Cells,hDPCs）增殖和成牙本质分化能力的影响,探讨其在牙髓损伤修复中的功能.方法：酶消化组织块法分离培养hDPCs,以lipo2000介导siRNA-hMEPE转染hDPCs,以阴性对照组和未转染组设为对照,l、3、5、7d后,CCK-8法检测细胞增殖情况;转染hDPCs后以矿化诱导液培养5、7、10d后,实时荧光定量RT-PCR检测骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）、牙本质涎磷蛋白（Dentin Sialophos-phoprotein,DSPP）、骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）、Collagen I mRNA表达水平.结果：CCK-8结果显示Si-h-MEPE转染hDPCsld后OD值下降,3d时到达最低值,且均低于未转染组与阴性对照组,3d时差异有统计学差异（P＜0.05）,未转染组与阴性对照组中,OD值持续升高,7d时到达峰值,与各自组内其他时间点比较有统计学差异（P＜0.05）;ALP活性检测结果显示,Si-h-MEPE转染hDPCs3d细胞OD值最低,且明显低于未转染组与阴性对照组（P＜0.05）,未转染组与阴性对照组hDPCsOD值呈现逐渐升高趋势,在7d时达到最大值（P＜0.05）.Si-h-MEPE转染hDPCs3d时BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA的表达量均较未转染组与阴性对照组下调（P＜0.05）.在未转染组中,BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA水平持续升高,在7d时达最高值,与3d比较差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：MEPE基因瞬时沉默抑制hDPCs增殖、使BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ基因表达下调,ALP活性降低,与未转染组与阴性对照组比较结果提示MEPE可能通过调控hDPCs的增殖和成牙本质分化能力,在牙髓损伤修复中发挥重要作用.     

程序性坏死特异性抑制剂-1对高糖环境下牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响

目的探讨程序性坏死特异性抑制剂-1（Nec-1）对高糖环境下牙周膜干细胞（PDLSC）的增殖和成骨分化的影响。 方法体外克隆培养的PDLSC，按照如下处理方法分为3组：对照组（5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（25 mmol/L葡萄糖）和高糖+Nec-1组（25 mmol/L葡萄糖+30 μmol/L Nec-1）。通过蛋白免疫印迹（Western blot）检测细胞坏死性凋亡相关分子RIP1、RIP3的表达，噻唑蓝（MTT）比色法检测各组细胞增殖活力，通过茜素红染色、碱性磷酸酶（ALP）定量检测和实时荧光定量PCR等方法分析PDLSC的成骨分化情况。使用SPSS 26.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析比较各组间细胞增殖活力（MTT吸光度A值）、ALP表达含量及成骨相关基因（COL1、RUNX2、OCN）相对表达水平，并用LSD-t检验进行组间多重比较。 结果Western blot结果显示，高糖组PDLSC的RIP1和RIP3的表达较对照组明显增加，而高糖+Nec-1组的RIP1和RIP3的表达明显弱于高糖组。PDLSC培养7 d后，高糖组增殖活力较对照组明显降低，其吸光度A值（0.67 ± 0.06）显著低于对照组（1.23 ± 0.12），差异有统计学意义（t = 9.652，P<0.001）；而Nec-1抑制后，PDLSC的增殖活力明显增加，高糖+Nec-1组吸光度A值（1.12 ± 0.11）显著高于高糖组（0.67 ± 0.06），差异有统计学意义（t = 8.185，P<0.001）。经矿化诱导后，高糖组PDLSC 14 d时形成的矿化结节、7 d时ALP表达含量（3.42 ± 0.37）和成骨相关基因COL1（1.86 ± 0.16）、RUNX2（1.55 ± 0.23）、OCN（1.08 ± 0.20）的相对表达量均较对照组均显著减少，差异均有统计学意义（t_ALP = 13.149，t_COL1 = 14.257，t_RUNX2 = 7.593，t_OCN = 8.606，P均<0.001）；而Nec-1抑制后，PDLSC的成骨分化增加，高糖+Nec-1组PDLSC 14 d时形成的矿化结节、7 d时ALP表达含量（6.06 ± 0.26）和成骨相关基因COL1（3.64 ± 0.30）、RUNX2（2.53 ± 0.26）、OCN（2.14 ± 0.30）的相对表达量较高糖组均显著升高，差异均有统计学意义（t_ALP = 13.033，t_COL1 = 11.636，t_RUNX2 = 6.332，t_OCN = 6.573，P均<0.001）。 结论体外培养条件下，高糖环境抑制了PDLSC的增殖和成骨分化，而Nec-1明显改善了高糖环境下PDLSC的增殖和成骨分化。     

血管内皮生长因子和转化生长因子β1基因调控人根尖乳头细胞矿化相关因子的研究

目的克隆人血管内皮生长因子（VEGF）异构体中的VEGF165,构建真核表达载体,探讨过表达VEGF165和转化生长因子β1（TGFβ1）对人根尖乳头细胞矿化相关因子的影响。方法提取人脐静脉内皮细胞系ECV304总RNA,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法扩增VEGF165基因,插入pcDNA3.1hisA,构建重组质粒pcDNA3.1hisA-VEGF165,经酶切及测序验证正确后,将其和pcDNA3.1hisA-TGFβ1转染人根尖乳头细胞,采用实时定量聚合酶链反应检测转染效率和骨涎蛋白（BSP）、牙本质涎磷蛋白（DSPP）、骨钙素（OCN）、牙本质基质蛋白1（DMP1）的表达。结果插入表达载体的VEGF165基因序列与GenBank数据库中的序列具有100%同源性;转染后VEGF165及TGFβ1 mRNA显著增高;各实验组DSPP mRNA的表达均升高（P＜0.05）,实验2组和实验3组的OCN mRNA升高（P＜0.05）,各组间BSP mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05）,DMP1 mRNA均未见表达。结论成功构建VEGF165真核表达载体,VEGF165和TGFβ1均能促进人根尖乳头细胞多种矿化因子的表达,与根尖乳头细胞的分化相关。     

脂多糖对大鼠牙髓细胞ALP、BSP、DSPP表达的影响

目的:研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对大鼠牙髓细胞牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达的影响。方法:采用组织块法获得大鼠牙髓细胞,体外常规培养并进行鉴定,以含0.1、1、10、100和10000 ng/mL牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)的LPS作用牙髓细胞1、3、5 d,用实时定量PCR检测DSPP、ALP、BSP mRNA表达的变化,采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果:镜下贴壁后的细胞形态多样,多呈成纤维样细胞形态,还有部分多角形细胞,胞质突起。实时定量PCR结果显示,与对照组相比,1、10 ng/mL LPS组大鼠牙髓细胞DSPP、ALP、BSP的mRNA表达增高,100、10000 ng/mL LPS组DSPP、ALP、BSP的mRNA表达均降低;在1、3、5 d时,1、10、100和10000 ng/mL LPS组mRNA表达逐渐减少。0.1 ng/mL LPS对mRNA的表达无显著影响。3种因子呈现相似的表达变化趋势。结论:低剂量P.g LPS能促进牙髓细胞ALP、BSP、DSPP的表达,高剂量时则抑制ALP、BSP、DSPP的表达;随着培养时间的延长,促进作用逐渐减弱,抑制作用逐渐增强。     

Behavior of human dental pulp cells exposed to transforming growth factor-beta1 and acidic fibroblast growth factor in culture

The development of methods for regenerative endodontic procedures requires an understanding of the factors regulating the development of odontoblasts from adult cell populations such as pulpal cell lines. In this study, we exposed cultures of human pulp cells (7th passage) to growth factors including transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1, at 1 or 5 ng/mL), acidic fibroblast growth factor (aFGF, 5 ng/mL), or a combination of the 2 growth factors and evaluated cellular morphology and markers of cell phenotype including alkaline phosphatase activity, osteocalcin, bone sialoprotein (BSP), and dentin sialophosprotein (DSPP). The mean number of nucleoli in the 1 ng/mL TGF-beta1 group was significantly higher than with 5 ng/mL aFGF. Alkaline phosphatase activity was significantly greater with 1 ng/mL TGF-beta1 versus 5 ng/mL TGF-beta1 + 5 ng/mL aFGF (P < .05). Osteocalcin mRNA was expressed in all samples. The cells exposed to 1 ng/mL TGF-beta1 were stimulated; however, exposure to growth factors for 8 days was not sufficient for expression of BSP and DSPP mRNA. Cells treated with 1 ng/mL TGF-beta1 exhibited higher activity, whereas 5 ng/mL aFGF-treated cells were inhibited. Although osteocalcin was observed in all cultures, suggestive of the potential for odontoblast formation, under the present conditions, the exposure to TGF-beta1 and aFGF was not sufficient to induce expression of the dentin matrix components BSP and DSPP.     

Expression and distribution of SIBLING proteins in the predentin/dentin and mandible of hyp mice

Oral Diseases (2010) 16 , 453–464 Objectives: Human X‐linked hypophosphatemia (XLH) and its murine homologue, Hyp are caused by inactivating mutations in PHEX gene. The protein encoded by PHEX gene is an endopeptidase whose physiological substrate(s) has not been identified. Dentin matrix protein 1 (DMP1) and dentin sialophosphoprotein (DSPP), two members of the Small Integrin‐Binding LIgand, N‐linked Glycoprotein (SIBLING) family are proteolytically processed. It has been speculated that PHEX endopeptidase may be responsible for the proteolytic cleavage of DMP1 and DSPP. To test this hypothesis and to analyse the distribution of SIBLING proteins in the predentin/dentin complex and mandible of Hyp mice, we compared the expression of four SIBLING proteins, DMP1, DSPP, bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (OPN) between Hyp and wild‐type mice. Methods: These SIBLING proteins were analysed by protein chemistry and immunohistochemistry. Results: (1) Dentin matrix protein 1 and DSPP fragments are present in the extracts of Hyp predentin/dentin and bone; (2) the level of DMP1 proteoglycan form, BSP and OPN is elevated in the Hyp bone. Conclusions: The PHEX protein is not the enzyme responsible for the proteolytic processing of DMP1 and DSPP. The altered distribution of SIBLING proteins may be involved in the pathogenesis of bone and dentin defects in Hyp and XLH.