大鼠切牙颈环结构成牙能力的实验研究

目的:观察大鼠切牙颈环结构种植于鼠肾被膜下形成牙齿样结构的能力。方法:取出生后3~4d的SD仔鼠切牙,将切取的颈环结构种植到母鼠肾被膜下,建立组织工程牙齿的体内培养模型。2~4周后取材,常规固定,HE染色观察。结果:下切牙颈环结构在体内形成了包含釉质和牙本质牙髓复合体的牙齿样结构,上切牙颈环结构仅形成了牙本质牙髓复合体的牙齿样结构。结论:大鼠切牙颈环结构在体内能够形成牙齿样结构,其中颈环中的上皮干细胞起着重要的作用。大鼠肾被膜下种植可以做为体内组织工程化牙齿样结构构建的立体培养模式。     

牙本质磷蛋白和成釉蛋白在组织工程牙胚的表达模式研究

目的：采用大鼠牙胚细胞与胶原蛋白构建组织工程牙齿,通过免疫荧光组织化学分析牙齿特异性蛋白在组织工程牙齿的表达模式。方法：采用出生后4dSD仔鼠磨牙牙胚细胞,培养后将牙胚细胞与胶原蛋白溶液混合构建组织工程牙胚,2W后取材,HE染色观察移植物中的成牙能力,免疫荧光组织化学染色观察牙本质磷蛋白DSP和成釉蛋白AM的表达模式。结果：组织工程牙胚移植后2W可在肾被膜下形成乳白色矿化组织,HE染色可见典型的牙髓牙本质复合体样组织和釉质样结构,免疫荧光组织化学染色观察可见成釉蛋白AM阳性的釉质样结构和牙本质磷蛋白DSP阳性的牙乳头样组织,与正常牙齿组织表达模式一致。结论：采用牙胚细胞可与胶原蛋白进行重新排列形成组织工程牙胚,本实验从组织和蛋白分析上证实了其具有较强的成牙能力,为以后的临床应用提供了理论基础。     

大鼠牙胚细胞团块培养法构建组织工程化牙齿

目的探索采用大鼠牙胚细胞团块培养法在体内构建组织工程化牙齿的可行性。方法体外培养SD仔鼠磨牙牙胚细胞,并将牙胚细胞团置于离心管内孵育48h后植入近交系SD大鼠肾被膜下,2周取材,苏木精-伊红染色,观察移植物中的组织新生情况。结果牙胚细胞团块在肾被膜下生长良好,形成典型的牙髓牙本质复合体样组织和少量釉质样结构,牙本质小管样结构清晰可见,内侧可见长柱状的成牙本质细胞有序排列,牙髓样组织中可见少量血管样结构。结论以牙胚细胞为种子细胞,用团块培养法在大鼠肾被膜下成功地构建出组织工程化牙冠样结构。     

用人牙源性上皮和间充质细胞构建组织工程化牙齿样结构的实验研究

目的：以人牙源性上皮和间充质细胞作为种子细胞在裸鼠体内构建牙齿样结构。方法：将体外培养的人牙源性上皮细胞和经生长因子诱导后的牙源性间充质细胞分层接种于经塑形的陶瓷化骨或Collagraft三维支架上，将形成的细胞/支架复合物移植到免疫缺陷小鼠的皮下，建立牙源性上皮细胞复合间充质细胞的体内立体培养模型。14～18周后取材，采用HE染色、改良丽春红三色法、免疫组化和原位杂交方法检测移植物中的组织新生情况。结果：细胞在三维支架上形成了包含釉质样组织和牙本质牙髓复合体的牙齿样结构。新生的釉质样组织表达人成釉蛋白，其周围残留的牙源性上皮细胞表达人釉原蛋白mRNA。同时，人DSP蛋白在牙本质样组织中呈阳性表达。所有对照组标本中均未观察到该现象。结论：以优选出并经塑形的三维支架为载体，在裸鼠体内建立牙源性上皮细胞复合间充质细胞的立体培养模型，成功构建出组织工程化牙齿样结构。     

非牙源性上皮与牙胚间充质相互作用诱导模式的筛选

目的：筛选非牙源性上皮向牙源性上皮转化过程中上皮-外胚间充质的最佳诱导模式。方法：体外培养并鉴定出生1d的SD仔鼠的牙胚外胚间充质细胞和富含干细胞的皮肤表皮细胞,并建立4种不同的表皮细胞与牙胚外胚间充质细胞间的诱导模式,通过组织学观察比较不同诱导模式所获得的重组体形成牙齿样结构的能力。结果：所采用的4组方案中,只有细胞-材料组和上皮外胚间充质混合细胞团块体内培养组形成了牙齿样结构,尤其是上皮外胚间充质混合细胞团块体内培养组所形成的牙齿样组织中同时含有牙本质和釉质样结构,而其他2组均无牙齿样结构的形成。结论：上皮外胚间充质混合细胞团块体内培养重组法最有利于牙齿组织的形成,是一种理想的研究非牙源性上皮与牙源性外胚间充质相互作用模式的诱导方法。     

大鼠第一腮弓肾被膜下种植的成牙能力研究

目的:观察E12.5d大鼠第一腮弓肾被膜下的成牙能力。方法:切取E12.5d大鼠第一腮弓(下颌突),种植于肾被膜下,4周后收获种植的组织块,组织学观察种植的第一腮弓的发育情况。结果:种植4周,第一腮弓在肾被膜下继续发育,形成牙齿样结构,包含牙釉质、牙本质、牙髓、成牙本质细胞、上皮根鞘样结构及骨样组织。形成的组织结构与正常发育的牙齿形态结构相似。结论:E12.5d大鼠第一腮弓在肾被膜下可以模拟体内牙齿的发育过程,继续发育形成牙齿样结构。     

猪牙源性间充质与胶原类材料复合移植的实验研究

目的：探讨经体外培养的出生后的猪牙源性间充质细胞成牙能力。方法：将体外培养第4代的猪牙胚细胞接种到胶原凝胶基质中，体外培养3d后进行裸鼠体内移植，6W后取材观察。结果：猪牙胚细胞原代培养过程中可见上皮样细胞与成纤维样细胞混杂存在，传代3次后上皮样细胞消失。细胞胶原基质复合物取材结果显示细胞聚集的区域可见牙本质-牙髓复合体样结构。结论：经体外传代培养后未经体外诱导的牙胚细胞接种到胶原凝胶基质所构建的组织工程牙齿有牙本质-牙髓复合体样结构形成，说明牙胚细胞经体外培养后其所获得的发育信息仍可保持，是研究牙齿发育构建模型及组织工程牙齿的理想的种子细胞。     

大鼠冠根部牙髓体内成牙能力比较

目的 比较成年大鼠冠、根部牙髓分别接种于肾被膜下的成牙能力.方法 无菌条件下分离8周龄SD大鼠切牙牙髓,将冠部与根部牙髓锐分离,分别植入大鼠肾被膜下,2周后进行组织学观察.结果 冠部牙髓形成了包含釉质样组织和牙本质-牙髓复合体的牙齿样结构,与正常牙齿相似.而根部牙髓则形成了骨样牙本质结构.结论 成年大鼠牙髓依然具有独立的牙齿发育的能力,冠髓和根髓的成牙能力不尽相同.     

不同时期大鼠牙齿胚基各部分组织发育能力的研究

目的：比较不同发育时期牙胚各部分异位环境下的发育能力,为牙齿再生重组实验提供参考。方法：分离获取SD大鼠帽状期和钟状末期牙胚,分离成釉上皮与牙乳头间充质,分别将完整牙胚、牙间充质、成釉上皮剪碎后异位移植至同种异体大鼠肾被膜下。4周后取材,对移植物进行组织学观察。结果：帽状期牙胚碎组织块移植物中可见部分不规则的牙齿样结构形成。钟状末期牙问充质碎组织块移植组中既有牙本质牙髓复合体样结构形成,还能观察到大量骨样基质形成。而钟状末期成釉上皮碎组织块移植物生成的组织均为骨样的结构。结论：发育早期牙胚的碎组织较发育末期的牙胚碎组织具有更强的牙齿形成能力,所形成的牙齿结构完整包括釉质、牙本质以及牙髓且顺序正确,提示这个时期牙上皮和间充质之间信号网络所提供的微环境可以更加完善和充分地指导牙齿的发育。     

大鼠牙乳头与成釉器重组肾被膜下种植的研究

目的：观察大鼠牙乳头对成釉器上皮的诱导作用。方法：出生后7dSD大鼠下颌第一磨牙根部的牙乳头与出生后2d的第二磨牙成釉器分别重组，出生后2d冠部牙乳头与成釉器重组为对照组。体外培养2d后种植于成年大鼠肾被膜下，1周，4周后取材，组织学观察上皮分化情况和硬组织形成情况。结果：1周后实验组重组体生成薄层的牙本质结构，内侧成牙本质细胞排列整齐，牙源性上皮未分化成成釉细胞，而有大量的骨样物质生成，对照组形成较为完整的牙冠结构。4周后，实验组重组体形成类牙根形态但仍无釉质形成。结论：根部牙乳头不具有促进成釉上皮分化的能力。     

大鼠牙髓干细胞与牙乳头间充质细胞成牙能力的比较研究

目的:探讨采用牙髓干细胞替代牙乳头间充质细胞进行牙齿再生研究的可行性。方法:分别分离培养6周龄SD大鼠切牙牙髓干细胞(DPSCs)和出生1d的SD仔鼠切牙牙乳头间充质细胞(DPMCs),对上述2种细胞的表面标记、增殖能力、体外矿化能力以及向成牙本质细胞分化能力进行比较。结果:DPSCs与DPMCs均具有较强的增殖能力和矿化能力,体外诱导均有成牙本质细胞特异性标记物DSPP基因表达,体内移植后均能够形成牙本质样结构。结论:DPSCs是一种较为理想的牙胚间充质细胞的替代细胞,在适宜的诱导环境中能够替代DPMCs进行牙齿的再生研究。     

种植牙胚的牙冠发育

目的：观察种植牙胚的牙冠发育情况。方法：选择出生后（PN）8天的SD大鼠,完整剥离第一磨牙牙胚,种植到母鼠肾被膜下,4周后取材观察。结果：种植牙胚的牙冠继续发育,冠周有新生牙槽骨,部分釉质外侧生成骨样结构。结论：牙胚种植到肾被膜下后牙冠可正常发育。     

大鼠完整牙胚肾被膜下种植实验研究

目的：评价肾被膜作为组织工程牙根和牙周组织的种植环境。方法：分离出生后6 d SD大鼠下颌第一磨牙完整牙胚，种植于成年SD大鼠肾被膜下，4周后收获种植牙胚，组织学观察种植牙胚的牙根和牙周组织发育情况。结果：20个种植牙胚中，4个种植牙胚有牙根和牙周组织生成，剩余种植牙胚仅见牙本质继续发育。结论：肾被膜是组织工程牙根和牙周组织的适宜种植环境。     

牙胚颈部组织肾被膜下种植实验

目的：观察含上皮根鞘（Hertwig’s epithelial root sheath,HERS）的牙胚颈部组织发育牙根和牙周组织的能力。方法：选择出生后（postnatal,PN）8d的SD大鼠,分离下颌第一磨牙牙胚,横切牙胚,将获得的牙胚冠部和颈部组织分别植入成年大鼠肾被膜下。结果：牙胚颈部组织在肾被膜下发育出形态和结构正常的牙根和牙周组织,而牙胚冠部组织未能发育出牙根和牙周组织。结论：含HERS的牙胚颈部组织具有单独发育牙根和牙周组织的能力。     

大鼠牙胚体内种植实验

目的:观察牙胚在肾被膜、大网膜和皮下的生长发育情况。方法:分离出生后(PN)7～8 d的SD大鼠下颌第一磨牙完整牙胚,分别种植到成年SD大鼠肾被膜、大网膜和皮下,4周后收获种植牙胚并进行组织学观察。结果:牙胚在肾被膜、大网膜和皮下均发育出牙根和牙周组织。结论:除了牙槽窝外,体内多个部位的微环境均可满足牙根和牙周组织生长发育的需要。     

上皮根鞘结构对牙根发育的影响

目的: 研究上皮根鞘的结构对牙根发育的影响。方法: 选择出生后(postnatal, PN)8 d的SD大鼠, 切取第一磨牙牙胚的颈部组织, 用胶原酶和dispase酶消化, 1组直接离心形成细胞团, 另1组加用胰酶消化后, 离心形成细胞团。将细胞团体外培养4 h后, 种植到母鼠肾被膜下, 4周后取材观察。结果: 胶原酶和dispase酶消化可将上皮根鞘解离成碎片, 加用胰酶消化后, 上皮根鞘被解离为单个细胞。含有上皮根鞘碎片的细胞团种植后形成牙根样结构, 而含有上皮根鞘离散细胞的细胞团则形成管状牙本质和骨样牙本质块。结论: 上皮根鞘的结构对其引导牙根发育具有重要作用。     

Cell proliferation in teeth reconstructed from dispersed cells of embryonic tooth germs in a three-dimensional scaffold

Tissue engineering can now reproduce tooth from postnatal tooth cells. However, crown formation is not accurately reconstituted, even when the complex structure of the enamel dentin is reproduced. Here, we showed that a tissue-engineered (TE) tooth, exhibiting morphogenesis according to regular crown-cusp pattern formation, was produced by embryonic tooth germ cells in a three-dimensional scaffold. Heterogeneous cells dissociated from embryonic day 14 (E14) mice tooth germs were seeded on a scaffold and implanted under a kidney capsule in adult mice. The developmental process of the implants was examined for up to 14 d. At 5 d, the cells had formed initial tooth germ, followed by enamel-covered dentin tissue formed symmetrically. To study the developmental process, we examined the growth pattern using 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)-labeling analysis. The initial cell-proliferation patterns of the TE teeth were similar to that at the cap and early bell stages in natural teeth. This was particularly true in the cervical loop, which showed a similar distribution pattern of BrdU-positive cells in TE- and natural teeth. These results suggested that even when embryonic tooth germs are dissociated, the single cells can reconstitute tooth, and that enamel organ morphogenesis proceeds as in natural teeth.