低氧环境下自噬对颏舌肌卫星细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨低氧环境下自噬对颏舌肌卫星细胞(Genioglossus muscle satellite cells,GG MuSCs)增殖能力与凋亡蛋白表达的影响。方法:体外培养大鼠颏舌肌卫星细胞, MTT法筛选自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)无毒剂量并检测细胞增殖能力。实验设常氧组、常氧+25 μmol/L氯喹组、单纯低氧组、低氧+5 μmol/L氯喹组、低氧+15 μmol/L氯喹组、低氧+25 μmol/L氯喹组。Western blot检测自噬标志蛋白LC3、促凋亡蛋白caspase-3及细胞色素c(cytochrome c,Cyt c)的表达水平。结果:1)Western blot结果显示:与常氧组相比,单纯低氧组LC3-Ⅱ/Ⅰ、caspase-3、Cyt c表达均增加;与单纯低氧组相比,低氧+氯喹组中随着给药浓度增加,LC3-Ⅱ/Ⅰ、caspase-3、Cyt c的表达水平呈递增趋势。2)MTT结果显示:与常氧组相比,单纯低氧组细胞增殖能力显著增强;而低氧+氯喹组中随着给药浓度增加,细胞增殖能力受到明显抑制。结论:低氧诱发的自噬促进颏舌肌卫星细胞存活,抑制自噬导致细胞增殖能力下降,凋亡蛋白表达显著增加。这提示自噬可能是颏舌肌卫星细胞抵御低氧损伤的重要机制。     

微小RNA-30a靶向Beclin1抑制舌鳞状细胞癌细胞自噬活性的研究

目的研究微小RNA(mi RNA)-30a转染对舌鳞状细胞癌细胞自噬相关基因Beclin1表达及其自噬活性的影响,探讨舌鳞状细胞癌细胞自噬活性调控的相关机制。方法利用脂质体转染技术,将内源性mi RNA-30a模拟物和抑制物分别转染至舌鳞状细胞癌UM1、UM2和SCC25细胞。实验设mi RNA-30a mimic组、mi RNA-30a inhibitor组和对照组;通过实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测转染前后Beclin1基因m RNA表达变化,通过Western blot检测Beclin1、LC3的蛋白表达变化。结果在mi RNA-30a mimic组中,Beclin1和自噬标记蛋白LC3-Ⅱ表达量与对照组相比均明显下降(P<0.05);在mi RNA-30a inhibitor组中,Beclin1和LC3-Ⅱ表达量较对照组均明显上升(P<0.05)。结论 mi RNA-30a负调控Beclin1表达,并抑制舌鳞状细胞癌细胞的自噬水平。     

低氧对大鼠颏舌肌成肌细胞分化的影响

目的:通过观测低氧环境对体外培养大鼠颏舌肌成肌细胞分化及低氧诱导因子1α(HIF-1α)表达的影响,探讨低氧引起颏舌肌损伤的机制以及HIF-1α在其中的作用。方法:根据环境氧浓度不同,将体外培养的原代大鼠颏舌肌成肌细胞分为正常氧浓度组(NC)(21%)和低氧组(HG)(1%),分别诱导分化0 d、1 d、3 d、6 d。采用RT-PCR及Western blotting检测生肌调节因子(MyoD)、肌源性决定因子(myogenin)、肌球蛋白重链(MHC)以及HIF-1α的mRNA及蛋白表达;倒置显微镜下观察成肌细胞分化的形态变化。结果:在颏舌肌成肌细胞分化过程中,两种氧状态下HIF-1αmRNA表达均没有显著变化(P>0.05),但蛋白表达逐渐上调;低氧对MyoD、myogenin、MHC的mRNA(P<0.05)和蛋白表达有显著的抑制作用,致肌管形成延迟;低氧使HIF-1αmRNA(P<0.05)和蛋白显著上调。结论:低氧环境可能是通过上调HIF-1α表达抑制大鼠颏舌肌成肌细胞的分化,从而抑制颏舌肌损伤的修复。     

过量氟对大鼠HAT-7细胞系自噬的影响

目的:研究过量氟对大鼠HAT-7细胞系自噬的影响.方法:取大鼠HAT-7细胞,分别加入不同浓度的氟化钠培养液,培养48 h后,透射电子显微镜检测过量氟对大鼠成釉细胞自噬泡的影响,Western免疫印迹和定量反转录聚合酶链反应技术检测过量氟诱导大鼠成釉细胞内微管相关蛋白轻链(LC3)和Beclin 1表达的变化.选择40只Wistar大鼠,随机分为A、B、C、D 4组,进行免疫组织化学实验,检测饮水氟对大鼠自噬分子表达的影响.采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析.结果:实验组自噬泡明显增多;Western免疫印迹及定量反转录聚合酶链反应结果显示,随着氟浓度的增加,HAT-7细胞自噬相关基因LC3和Beclin 1表达增加.回归分析结果显示,氟化钠与LC3及Beclin 1的表达有线性关系;大鼠体内免疫组织化学染色结果显示,实验组LC3以及Beclin 1为棕褐色,呈阳性表达.结论:过量氟诱导大鼠HAT-7细胞系自噬.     

自噬相关基因Beclin1和MAP1LC3在口腔鳞状细胞癌中的表达及意义

目的:通过检测自噬相关基因Beclin1和MAP1LC3在口腔鳞状细胞癌中的表达,探讨自噬在口腔鳞状细胞癌发生中的作用。方法:采用免疫组织化学方法,观察自噬相关基因Beclin1和MAP1LC3在47例口腔鳞状细胞癌和16例癌旁组织中的表达情况。结果:Beclin1在口腔鳞状细胞癌组织和癌旁组织中的表达率分别为40.43%和75%;MAP1LC3在口腔鳞状细胞癌组织和癌旁组织中的表达率分别为29.79%和62.5%,Beclin1和MAP1LC3在癌组织中的表达率明显低于癌旁组织,2组间均有显著差异(P<0.05)。Beclin1在高分化鳞状细胞癌组织中的表达率为42.31%,在中低分化鳞癌中的表达率为38.1%;MAP1LC3在高分化鳞状细胞癌组织中的表达率为30.77%,在中低分化鳞癌中的表达率为28.57%,Beclin1和MAP1LC3这2组之间的差异均无显著性差异。Beclin1在有淋巴结转移的癌组织和无淋巴结转移的癌组织中的表达率分别为9.09%和50%;MAP1LC3在有淋巴结转移的癌组织和无淋巴结转移的癌组织中的表达率分别为0%和38.89%,这2组均有显著性差异(P<0.05)。结论:Beclin1和MAP1LC3在口腔鳞状细胞癌中表达明显低于癌旁组织,在有淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌组织中的表达明显低于无淋巴结转移组织。     

miR-30a在雷帕霉素刺激人炎症牙周膜干细胞后的表达情况及其与Beclin1基因的靶向调控作用的研究

目的:研究雷帕霉素对人牙周膜干细胞中miR-30a的表达的影响,并验证其与Beclin1的靶向调控关系,探讨miR-30a与自噬途径在牙周膜干细胞的炎症作用机制。方法:分离培养人牙周膜干细胞,并分别进行50 μg/L雷帕霉素作用2 h,10 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用12 h,收集细胞,提取总RNA;应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-30a的表达水平;应用qRT-PCR、Western blot及双荧光素酶报告系统验证miR-30a与Beclin1的相互作用关系。结果:雷帕霉素刺激细胞后,细胞内的miR-30a的表达升高;qRT-PCR、Western blot及双荧光素酶报告系统证实,miR-30a对Beclin1的mRNA及蛋白均有抑制,且与Beclin1的3’UTR具有靶向抑制作用。结论:miR-30a可靶向抑制自噬相关基因Beclin1的表达,并参与人牙周膜干细胞的细胞自噬过程。     

粪肠球菌脂磷壁酸对巨噬细胞自噬的影响

目的通过研究粪肠球菌脂磷壁酸（LTA）对巨噬细胞自噬功能的影响,为后续进一步深入探讨顽固性根尖周炎的发病机制提供实验依据。 方法体外培养小鼠巨噬细胞系RAW 264.7,细胞计数试剂盒（CCK-8）检测LTA的细胞毒性作用;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测LTA作用下巨噬细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin1的表达水平;实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测自噬相关基因LC3、Beclin1 mRNA表达水平的变化;构建稳定表达自噬双荧光慢病毒载体HBLV-mRFP-GFP-LC3-PURO的巨噬细胞系,激光共聚焦显微镜观察自噬情况;SPSS 20.0统计软件进行数据分析。 结果CCK-8结果表明,选用20 μg/mL LTA及其以下浓度处理巨噬细胞24 h均未见明显毒性作用（t = 2.102,P = 0.1106）;Western blot结果表明,LTA刺激巨噬细胞后：LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值表达量（0.42 ± 0.04）与对照组（0.04 ± 0.02）相比显著提高,差异有统计学意义（F = 14.25,P<0.001）,Beclin1蛋白表达量（0.56 ± 0.11）与对照组（0.28 ± 0.08）相比呈上升趋势（F = 3.459,P = 0.0258）,均存在剂量依赖效应;实时荧光定量PCR结果表明,LTA刺激巨噬细胞后,LC3基因表达水平（5.94 ± 0.85）与对照组（1.03 ± 0.28）相比显著提高（F = 12.93,P<0.001）;Beclin1基因表达水平（2.22 ± 0.21）与对照组（1.02 ± 0.28）相比呈上升趋势（F = 6.036,P<0.001）,存在剂量依赖效应;成功构建稳定表达HBLV-mRFP-GFP-LC3-PURO的巨噬细胞系,激光共聚焦显微镜下观察显示,LTA作用组自噬体形成量（58 ± 6）与对照组（18 ± 8）相比差异有统计学意义（F = 12.36,P = 0.0021）。 结论粪肠球菌LTA可诱导巨噬细胞产生自噬,且存在剂量依赖效应。     

沉默Beclin1基因抑制自噬促进舌鳞状细胞癌细胞增殖及侵袭转移

目的 探讨抑制自噬基因Beclin1表达对舌鳞状细胞癌(以下简称舌鳞癌)细胞增殖及侵袭转移的影响,了解舌鳞癌侵袭转移的调控机制.方法 利用RNAi技术,针对人cDNA序列设计Beclin1干扰序列,用脂质体Lip02000包裹后转染至舌鳞癌UM2细胞.实验设空白对照组、脂质体2000(Lip02000)组、阴性siRNA组和Beclin1 siRNA组,通过蛋白印迹法检测Beclin1、LC3的表达变化;CCK-8法检测细胞增殖能力变化;Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力改变;SPSS13.0统计软件进行数据分析.结果 转染Beclin1 siRNA对UM2细胞Beclin1有显著敲减作用(P＜0.05),自噬标记蛋白LC3-Ⅱ的表达明显降低(P＜0.05),细胞增殖较对照组增快(P＜0.05),细胞迁移和侵袭转移能力明显增强.结论 沉默Beclin1表达可下调舌鳞癌细胞自噬水平,并促进舌鳞癌细胞增殖和侵袭能力.     

PRRX1对唾液腺腺样囊性癌细胞自噬的影响

目的: 探讨配对相关同源框 1（paired related homeobox1,PRRX1）对唾液腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma,SACC）细胞自噬的影响。方法: 用PRRX1过表达慢病毒载体及PRRX1慢病毒空载体转染SACC细胞后,应用Western蛋白免疫印迹法检测转染效果。利用透射电子显微镜观察自噬小体,通过细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹法检测自噬标志物（LC3-II/Beclin1）水平。采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 与未转染的空白对照组和阴性空病毒载体转染组相比,PRRX1过表达组的PRRX1表达量升高,自噬小体减少,自噬标志物水平降低（P<0.05）。结论: PRRX1对SACC细胞的自噬有抑制作用。     

雷帕霉素诱导自噬抑制舌鳞癌细胞增殖和迁移

目的探讨自噬诱导对舌鳞癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法应用雷帕霉素(Rap)诱导上调舌鳞癌Tca8113细胞自噬活性,Western blot检测诱导后Tca8113细胞自噬标记蛋白Beclin1和LC3的表达变化;MTT法检测自噬诱导对细胞增殖的影响;Wound-healing检测诱导后细胞迁移能力改变;SPSS 19.0统计软件进行数据分析。结果 Rap诱导6h即可上调舌鳞癌Tca8113细胞自噬标记蛋白LC3-Ⅱ表达,24h时LC3-Ⅱ表达最强,自噬活性最高(P<0.05)。与对照组相比,Rap诱导后细胞生长明显抑制(P<0.05),迁移速率减慢。结论上调舌鳞癌细胞自噬活性可以抑制其增殖和迁移。     

低氧促进口腔鳞癌细胞TLR3及TLR4表达的相关研究

目的　　检测常氧培养条件下口腔鳞癌细胞HSC3中Toll样受体3、4（Toll like receptor 3,4,TLR3、TLR4）的表达水平,并进一步探讨低氧微环境对其表达可能的影响。方法　常氧条件下,将口腔鳞癌细胞HSC3培养至指数增长期,收集细胞,采用Real-time PCR方法在mRNA水平检测TLR3、4的表达,继之,采用Western blotting在蛋白水平检测其表达。模拟体内低氧微环境,在体外采用1% O2浓度分别刺激细胞0、3、6、12及24 h,采用Real-time PCR方法在mRNA水平检测TLR3、4的表达变化,进一步通过Western blotting在蛋白水平检测其表达改变。结果　在常氧培养条件下, HSC3细胞中可检测到TLR3和TLR4的表达。采用低氧刺激可以显著促进TLR3、TLR4的表达水平,其中低氧刺激24 h后,与对照组相比,实验组TLR3的蛋白表达水平增高至(6.2±0.1)倍,而TLR4在低氧刺激6 h后蛋白表达水平可增高至(5.6±0.1)倍,其结果在统计学上具有显著性差异（P＜0.05）。结论　口腔鳞癌细胞HSC3在常氧培养下可检测到TLR3、TLR4的表达,肿瘤低氧微环境可进一步促进其表达水平。     

低氧对人牙周膜细胞增殖、细胞周期及分化潜能的影响

目的研究低氧对人牙周膜细胞（hPDLC）增殖、细胞周期以及干细胞表面标志物（STRO-1和CD146）表达水平的影响。 方法采用组织块法体外分离培养hPDLC;取第3~5代细胞分别在常氧和低氧（1.5%~2.0% O₂）条件下培养12、24、36、48 h,采用MTT法检测低氧对细胞增殖的影响;并通过流式细胞术检测低氧条件下细胞周期的变化以及细胞表面STRO-1和CD146表达水平的变化。 结果两组细胞增殖率随时间延长而增加,12和24 h低氧组细胞增殖率比常氧组稍高,差别无统计学意义。36和48 h低氧组增殖活性较常氧组降低,差异有统计学意义（t_{36 h} = 3.538,P_{36 h} = 0.024;t_{48 h} = 5.349,P_{48 h}= 0.006）;12 h低氧组细胞的增殖指数（PI）比常氧组低,24和36 h低氧组细胞PI比常氧组高,但差异均无统计学意义,48 h低氧组细胞PI比常氧组高,差异有统计学意义（t_{48 h}=-5.768,P_{48 h}= 0.004）;4个时间点低氧组细胞STRO-1和CD146的表达水平与常氧组比较差异无统计学意义。 结论低氧抑制hPDLC的增殖,但促进hPDLC DNA合成;hPDLC在低氧条件下能保持其分化潜能。     

p38丝裂素活化蛋白激酶信号通路在应力调控成肌细胞分化中的作用

目的研究在C2C12细胞成肌分化过程中应力对丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路中p38丝裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）信号通路的影响。方法将6孔Bio Flex培养板上贴壁培养的C2C12细胞,以0.5 Hz的加载频率和10%的细胞拉伸变形幅度,分别进行拉伸培养2、6、12、24 h,应用Western blot免疫印迹检测总p38和磷酸化p-p38（Thr180/Tyr182）蛋白的表达情况。结果周期性机械拉伸在调控C2C12成肌细胞分化过程中,p38MAPK信号通路被激活。p38MAPK信号通路蛋白磷酸化水平在较高水平;而p38MAPK通路总蛋白表达维持在一基线水平,各组之间差异无统计学意义。加入p38MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580后再加力,Myogenin的表达明显降低。结论p38MAPK信号通路在应力介导的C2C12成肌细胞分化过程中发挥重要作用,但不是这一调控过程的唯一通路。     

Beclin1和LC3在腮腺多形性腺瘤及癌在多形性腺瘤中的表达和意义

目的:探讨自噬相关基因Beclin1和微管相关蛋白LC3表达和腮腺肿瘤之间的关系。方法:用免疫组化方法检测20例正常腮腺组织、37例腮腺多形性腺瘤、41例癌在多形性腺瘤中Beclin1和LC3的表达,并结合临床病理因素进行分析。结果:Beclin1在正常腮腺组织、腮腺多形性腺瘤、癌在多形性腺瘤中的阳性率分别为100%、92%、63%;LC3在这3种组织的阳性表达率分别为100%、86%、56%。淋巴结转移及TNM分期与Beclin1的表达间有显著性关系(P<0.05),不同侵袭性、有无淋巴结转移与LC3的表达间有显著性关系(P<0.05)。结论:Beclin1和LC3在腮腺多形性腺瘤及癌在多形性腺瘤中表达下调,自噬功能改变可能在腮腺肿瘤形成中具有一定作用。     

自噬在hAMSCs促进血管新生作用的初探

目的：：通过构建人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)与人脐静脉内皮细胞(hUVECs)3D共培养体系,探讨自噬与血管新生的相关性。方法：使用蛋白酶和胶原酶消化法及胶原酶消化法提取hAMSCs和hUVECs。通过流式细胞仪、免疫荧光及多向分化实验鉴定hAMSCs和hUVECs。通过3D成管实验观察0、3、6、12、24、48、72 h hAMSCs-hUVECs(共培养)组及hUVECs(单培养)组中hUVECs出芽的长度及面积,检测各时间点中反应自噬水平的蛋白ATG5、Beclin-1、LC3Ⅱ表达水平。结果：流式细胞仪检测发现,hAMSCs中间充质细胞表面分子标志呈阳性表达,造血干细胞及血管细胞相关的表面分子标志呈阴性表达;hUVECs中CD34呈阳性表达,CD45呈阴性表达。免疫荧光检测发现,hUVECs细胞膜上表达CD31,胞浆中表达抗血管性血友病因子(vWF)。多向分化实验证实hAMSCs具有向成骨细胞、成脂细胞及成软骨细胞分化的潜能。3D成管实验中共培养组在12 h以后出芽的长度及面积均高于单培养组,共培养组ATG5表达水平在3、6 h高于单培养组,共培养组Beclin-1表达水平在0、3、6 h高于单培养组,共培养组LC3Ⅱ表达水平在0、3、6、12 h高于单培养组。结论：本研究发现hAMSCs可以促进血管新生,并证明其促进作用与共培养体系建立早期的胞内自噬水平增高密切相关。     

Schisandrin C enhances odontoblastic differentiation through autophagy and mitochondrial biogenesis in human dental pulp cells

ObjectiveTo investigate the role of Schisandrin C in odontoblastic differentiation, and its relations between autophagy and mitochondrial biogenesis in human dental pulp cells (HPDCs).DesignFresh third molars were used, and cultured for HDPCs. Western blotting technique, Alizarin red S staining, alkaline phosphatase (ALP) activity, and confocal microscopy were used to detect autophagy, mitochondrial biogenesis, and odontoblastic differentiation. To understand the mechanism of Schisandrin C, the HDPCs were treated with lipopolysaccharide (LPS), autophagy and heme oxygenase-1 (HO-1) inhibitors: 3-Methyladenine (3-MA) and Zinc protoporphyrin IX (ZnPP), respectively.ResultsLPS decreased the expression of autophagy molecules [autophagy protein 5 (ATG-5), beclin-1, and microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3 (LC3-I/II)] and mitochondrial biogenesis molecules [heme oxygenase-1 (HO-1) and peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1α)], and disrupted odontoblastic differentiation. The down-regulation of autophagy and mitochondrial biogenesis with 3-MA and ZnPP inhibited odontoblastic differentiation. However, Schisandrin C restored the expression of all the above molecules, even with LPS and inhibitor treatment. This result demonstrates that autophagy and mitochondrial biogenesis plays an essential role in odontoblastic differentiation, and Schisandrin C activates these systems to promote odontoblastic differentiation of HDPCs.ConclusionSchisandrin C has potential characters to regulate odontoblastic differentiation, and may be recommended for use as a compound for pulp homeostasis.     

慢性间歇性低氧条件下大鼠龈沟液中牙龈卟啉单胞菌的变化

目的:探讨间歇性低氧条件下大鼠龈沟液中牙龈卟啉单胞菌的变化.方法:将32只6周龄雄性SD大鼠随机分成4组(n=8):常氧对照组(A组)、常氧牙周炎组(B组)、间歇性低氧组(C组)、间歇性低氧合并牙周炎组(D组).用正畸结扎丝结扎双侧上颌第二磨牙颈部和高糖饮食方法建立牙周炎模型,常氧和低氧组分别在常氧和模拟阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征条件下饲养8周,采集大鼠实验牙龈沟液标本,实时荧光定量PCR方法检测牙龈卟啉单胞菌的变化.结果:所有的大鼠均检出牙龈卟啉单胞菌.D组牙龈卟啉单胞菌的量明显高于其他3组(P＜0.05);B组牙龈卟啉单胞菌的量高于A组(P＜0.05).结论:慢性间歇性低氧可加重牙周炎病程,与龈沟液中牙龈卟啉单胞菌的增加有关.