牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)对破骨细胞EphA2基因表达的调控

目的:研究小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7在破骨分化过程中,Pg-LPS对破骨细胞EphA2表达的影响。方法:用终浓度10 mg/L的Pg-LPS 刺激RAW264.7 细胞后,分别在1、3、5 d,应用RT-PCR检测破骨细胞中EphA2基因和破骨细胞相关基因(破骨细胞内基质金属蛋白酶( MMP9)、ACP5、c-fos、组织蛋白酶K(CtsK)、NFATc1)的表达,并且通过酒石酸抗酸性磷酸酶(TRAP)染色观察实验组和对照组破骨细胞的分化成熟情况。结果:RT-PCR检测10 mg/L的Pg-LPS在第3天和5天,实验组比对照组EphA2基因表达分别增高2.4倍和1.2倍,两组之间存在显著差异(P<0.01);同时也能够促进破骨相关基因c-fos、NFATc1、CtsK、ACP5、MMP9的表达,实验组与对照组相比差异有显著性;TRAP染色结果显示:实验组比对照组的TRAP阳性多核细胞数目明显增多。结论:10 mg/L的Pg-LPS对小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7,在破骨分化的中期和晚期均能够促进EphA2基因的表达,但是在破骨分化早期对EphA2基因的表达无明显作用。     

脂多糖刺激单核细胞上清对成骨细胞Runx2/Cbfα1表达影响

目的　观察牙龈卟啉菌脂多糖(Pg-LPS)刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养上清对成骨细胞Runx2/Cbfα1表达的影响。 方法　收集经100 ng/ml Pg-LPS刺激的单核巨噬细胞RAW264.7培养24 h后上清,以20%的稀释浓度的分别作用于MC3T3-E1细胞1、6、12、24、48、72 h后,采用半定量RT-PCR与Western-Blot检测细胞Runx2/Cbfα1在基因与蛋白水平上的差异性表达。 结果　成骨细胞MC3T3-E1在20%稀释浓度的培养上清刺激后,半定量RT-PCR法发现Runx2/Cbfα1基因表达显著受抑制,且呈时间依赖性,72 h降到最低; Western-Blot检测显示细胞Runx2/Cbfαa1蛋白表达6 h后开始下降,72 h降至最低。 结论　Pg-LPS刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养上清能抑制小鼠成骨细胞Runx2/Cbfα1的表达且与时间呈一定相关。     

Dlx2在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用

目的:探讨Dlx2(distal-less homeobox 2)基因过表达对体外培养的小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1 向成骨方向分化的影响.方法:构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序验证.体外病毒转染MC3T3-E1后,以嘌呤霉素行抗性筛选稳定细胞株,以RT-PCR和Western印迹检测转染后细胞中Dlx2的表达.应用实时定量PCR(RT-PCR)检测Dlx2过表达对部分成骨相关基因(ALP、OCN、Runx2、Msx2)表达的影响.以碱性磷酸酶(ALP)活性测定和茜素红染色法检测Dlx2过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响.采用SAS 6.04软件包对数据进行随机设计的方差分析.结果:本实验成功构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序正确.体外转染后筛选出Dlx2稳定高表达细胞株MC3T3-E1-Dlx2,其mRNA和蛋白表达量显著高于对照组.在成骨诱导过程中,MC3T3-E1-Dlx2细胞ALP值在第4、7、14d均高于对照组细胞,茜素红染色显示实验组较对照组和空白组染色深.Dlx2过表达在成骨诱导早期能显著促进ALP和Msx2的表达(P<0.05),晚期则上调OCN表达(P<0.05),而Runx2表达无明显变化(P>0.05).结论:Dlx2过表达上调AIP、OCN等成骨相关基因的表达.促进MC3T3-E1细胞的成骨分化.     

MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导成骨模型的建立及Ano5基因表达的研究

目的 建立MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导成骨模型,探讨Ano5基因表达与成骨细胞形成的关系,了解其对成骨分化的影响.方法 MC3T3-E1 Subclone 14细胞贴壁培养,加入条件培养基,分别培养至0d、3d、7d、14d、21d.倒置显微镜下观察细胞形态,通过碱性磷酸酶活力测定和茜素红染色,鉴定成骨细胞.利用REALTIME-PCR检测Ocn、Colα1、Opg/Rankl、Osterix和Runx2等成骨相关因子的基因表达水平,同时检测Ano5基因在成骨细胞形成过程中的表达趋势.结果 体外诱导MC3T3-E1 Subclone 14倒置光学显微镜下观察细胞形态呈梭形.成骨细胞碱性磷酸酶活力逐渐增高.成骨诱导培养至14d和21d,茜素红染色可见细胞表面出现矿化结节.成骨相关因子基因表达均逐渐增高,至21d达到高峰.Ano5基因从诱导分化的第3d开始表达,随后表达量逐渐增高,至14d达到高峰,21d表达量下降.结论 在MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导分化为成骨细胞过程中,Ano5基因表达量逐渐升高,至14d达到高峰,21d开始表达量具有下降趋势.     

ADAM28在成骨样细胞MC3T3-E1中的表达

目的:研究ADAM28在成骨样细胞MC3T3-E1中的表达。方法:采用细胞培养,免疫组化和免疫荧光染色方法检测ADAM28在成骨细胞中可能存在的机制。结果:ADAM28成功表达于小鼠MC3T3-E1成骨样细胞上,免疫组化和免疫荧光检测显示:ADAM28在MC3T3-E1上表达阳性,对照组与实验组间p<0.01,有显著性差异;荧光显微镜下,可见实验组显示较强的绿色荧光,阳性表达明显。结论:ADAM28可能通过参与成骨细胞的生物学活动来促进其细胞的增殖分化。     

同源盒蛋白(Msx1)过度表达抑制成骨细胞碱性磷酸酶表达的实验研究

目的:观察同源盒蛋白(Msx1)过度表达在成骨细胞MC3T3-E1分化培养过程中对碱性磷酸酶的调节作用,以探讨Msx1蛋白对细胞成骨分化过程的调控机制。方法:将成骨细胞MC3T3-E1分为5组:未转染病毒组作为对照组1(A组);空白腺病毒载体组作为对照组2(B组);未分化组作为空白对照组(C组);分化前1 d转染携带同源盒基因Msx1的腺病毒载体组(D组);分化后1 d转染Msx1腺病毒载体组(E组)。在成骨分化培养基中培养4 d后,检测成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性。结果:A、B两组成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养基培养4 d后,ALP活性呈强阳性;C组中未分化成骨细胞MC3T3-E1无ALP活性,D、E两组的成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养4 d后的ALP活性明显较A、B组减低,而且D、E两组间ALP活性无区别。结论:过度表达同源盒蛋白(Msx1)能抑制成骨细胞MC3T3-E1的ALP表达,在其成骨分化的过程中起一定的抑制作用。     

釉基质蛋白诱导MC3T3-E1细胞成骨分化过程中微小核糖核酸的表达

目的 探讨微小核糖核酸(micro ribonucleicacid,miRNA)是否参与到釉基质蛋白(EnamelMatrix Derivative,EMD)诱导的小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞成骨分化的过程,并对发生显著变化的miRNA进行分析.方法 将MC3T3-E1用含EMD(刺激组)/不含EMD(对照组)的培养液培养0天、7天和14天,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,实时聚合酶链式反应(RT-PCR)技术分析成骨分化标记物ALP、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和骨钙素(osteocalcin,OC)的信使RNA(mRNA)水平的表达变化.利用基因芯片技术分析miRNA的相对表达.结果 0天、7天、14天的ALP染色结果显示随着培养时间的增加,两组ALP活性均逐渐增强,EMD刺激组ALP活性增强较对照组更为明显.RT-PCR结果表明,与对照组相比,ALP、BSP、OC的mRNA表达量均显著增加,ALP与OC均于14天时表达量达到峰值,BSP则于7天时处于峰值表达,EMD刺激组MC3T3-E1成骨活性更强;各期11个miRNA表达上调,28个miRNA表达下调,其中miR-335-5p,miR-503已被证实可参与促进骨形成,而miR-30家族(miR-30a,-30b,-30c和-30d)则被证实参与抑制成骨.结论 miRNA参与EMD诱导的MC3T3-E1细胞的成骨分化过程,这一发现可以为了解EMD促进成骨分化的机理及临床应用提供指导.     

TiO_2纳米管对MC3T3-E1前成骨细胞骨功能基因表达变化的影响

目的：研究阳极氧化TiO2纳米管对MC3T3-E1前成骨细胞骨功能基因表达变化的影响。方法：采用阳极氧化法在钛基底表面制备TiO2纳米管,扫描电镜观察其表面微结构,肌动蛋白染色研究细胞在材料表面的粘附生长情况,Real-time PCR技术系统分析材料对细胞骨功能基因表达的影响规律。结果：MC3T3-E1前成骨细胞在TiO2纳米管表面比光滑钛有更大的伸展面积,培养1周后,TiO2纳米管提高了细胞骨功能基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙蛋白的表达水平（P〈0.05）,培养2周后,骨功能基因表达水平与对照组之间没统计学差异。结论：TiO2纳米管可以促进MC3T3-E1前成骨细胞肌动蛋白组装,同时可以提高细胞骨功能基因的早期表达水平。     

ClC-3氯通道参与TGF-β通路调控PTH的促成骨分化作用机制研究

目的：：初步探究电压门控氯通道3(ClC-3)在甲状旁腺激素(PTH)调节成骨分化过程中的作用机制。方法：采用基因转染的方法,分别用特异性siRNA调节成骨细胞MC3T3-E1中转化生长因子β1(TGF-β1)及ClC-3基因的表达水平,采用实时定量RT-PCR检测ClC-3、TGF-β1及碱性磷酸酶(ALP)、骨唾液蛋白(BSP)、骨钙素(OC)、核心结合蛋白因子2(Runx2)等成骨相关因子的基因表达情况,并用Western blot及免疫荧光方法检测CLC-3和TGF-β1蛋白的表达情况。结果：在PTH间断刺激下,成骨细胞中仅干扰TGF-β1基因表达后,ClC-3氯通道基因及蛋白表达水平增强;仅干扰ClC-3氯通道基因后,TGF-β1基因及蛋白表达水平升高。同样在PTH间断刺激下,在分别干扰ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因后,成骨相关基因表达水平较对照组明显降低(P<0.05);然而共同干扰两者之后成骨相关基因表达较对照组无明显差异(P>0.05)。结论：ClC-3氯通道通过TGF-β通路参与介导了PTH在成骨细胞中促进成骨细胞分化的作用。     

MicroRNA-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响

目的:探讨miR-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响。方法:以小鼠前成骨细胞MC3T3-E1为实验对象,对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导,分别在0、3、5、7 d应用实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测细胞中Runx2、Osx、ALP、miR-103-3p表达水平,Western免疫印迹（Western blotting）检测Runx2、Osx蛋白表达并进行碱性磷酸酶（ALP）染色。通过脂质体lipofectamine2000瞬时转染miR-103-3p模拟物 （miR-103-3p mimics）及模拟物阴性对照进入MC3T3-E1细胞内,Real-time PCR检测2组细胞miR-103-3p的表达水平,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。分别对2组细胞进行成骨诱导,在成骨诱导后0、3、7 d,分别使用Real-time PCR和Western免疫印迹检测2组细胞Runx2、Osx等成骨相关基因mRNA和蛋白的表达变化,并对2组细胞进行ALP染色。实验数据采用SPSS19.0软件包进行统计学分析。结果:MC3T3-E1经成骨诱导0、3、5、7 d后,细胞内Runx2、Osx、ALP转录水平持续显著升高;Runx2、Osx蛋白表达升高。ALP染色逐渐加深。在成骨诱导3、5、7 d的MC3T3-E1细胞中,miR-103-3p水平较诱导前受到持续显著抑制(P<0.05)。瞬时转染miR-103-3p mimics后,MC3T3-E1细胞中的miR-103-3p表达水平较对照组显著上调(P<0.05),细胞增殖受到抑制,Runx2、ALP转录水平显著抑制（P<0.05）,Runx2蛋白表达显著抑制。对转染后的细胞进行成骨诱导3、7 d后,miR-103-3p转染组细胞Runx2、Osx、ALP在转录水平的表达较对照组显著降低,Runx2、Osx在蛋白水平的表达较对照组显著降低,且miR-103-3p转染组细胞ALP活性较对照组显著降低。结论:miR-103-3p可能对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化早期起抑制作用。     

柚皮苷协同骨形态发生蛋白-2促进小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖和分化的研究

目的 研究柚皮苷（NAR）联合骨形态发生蛋白（BMP）-2对体外培养的成骨前体细胞MC3T3-E1增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨相关基因ALP、骨钙素（OCN）、成骨特异性转录因子（Runx2）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）表达的影响。方法 以成骨细胞株MC3T3-E1为体外药效的试验模型,通过Alamar blue法检测第1、4和7天3种不同浓度NAR（10、100和1 000 μmol·L^-1）单独作用以及分别与50 ng·mL^-1 BMP-2联合诱导对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响。同时在第4天和7天测定成骨细胞内ALP活性,采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测成骨相关基因ALP、OCN、Runx2、ColⅠ的表达。结果 单纯NAR刺激及联合BMP-2刺激能够促进细胞增殖,在NAR浓度为100 μmol·L^-1时达到高峰（P<0.05）,且该浓度NAR与BMP-2联合作用时增殖效果大于两者单独作用（P<0.05）。单纯NAR刺激及联合BMP-2刺激4 d和7 d时均能促进细胞ALP活性,100 μmol·L^-1 NAR与BMP-2联合作用时ALP活性最强（P<0.05）。100~1 000 μmol·L^-1的NAR单独及联合作用在不同程度上能促进ALP、OCN、Runx2、ColⅠ成骨相关基因表达。结论 NAR能有效促进成骨细胞株MC3T3-E1增殖、分化,且适宜浓度的NAR和BMP-2有协同和促进作用。     

骨形态发生蛋白7在高糖环境下对成骨细胞分化的影响

目的:研究对于重组人骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7,BMP7)在持续稳定高糖环境下对成骨细胞生物学性能及成骨活性的影响。方法:细胞取小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1Subclone 14,MC3T3),分为4组:正常生理糖浓度组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)为对照组,生理糖浓度+BMP7组高糖组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L,BMP7浓度为100 μg/L)(葡萄糖浓度为25 mmol/L),高糖+BMP7组(葡萄糖浓度为25 mmol/L,BMP7浓度为100 μg/L)。甲基噻唑基四唑(MTT)法检测不同条件培养后1 d、3 d、5 d、7 d后的细胞增殖情况,成骨诱导检测细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。罗丹明-鬼笔环肽染色后以激光共聚焦显微镜观察MC3T3细胞骨架于BMP7作用24h后的形态变化,荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测BMP7作用48 h后成骨基因特异性转录因子2(Runx2),骨钙素(osteocalcin,OCN)、碱性磷酸酶(ALP)的mRNA表达。结果:MTT实验显示25 mmol/L葡萄糖可抑制MC3T3增殖(P<0.05),加入BMP7后可提高细胞增值率(P<0.05)。并可上调高糖导致的ALP活性下降。细胞骨架观察结果显示,对照组细胞骨架成束状铺开,交织成网,较为均匀。高糖组细胞微丝解聚成团状,模糊不清。RT-qPCR结果显示BMP7可促进MC3T3细胞的ALP、OCN及Runx2(P<0.05)的表达。结论:持续稳定高糖环境能够抑制成骨细胞的增殖及ALP活性,影响细胞骨架结构,抑制成骨基因表达,添加BMP7可以在不同程度上反转该趋势,但仍较正常水平低。     

miR-199a调控IGF1表达对机械刺激下成骨细胞分化的影响

目的： 探讨微小RNA（miR）-199a在机械牵张力刺激下MC3T3-E1细胞中的表达变化及其对牵张力刺激MC3T3-E1细胞成骨分化的作用机制。方法： 对体外培养的MC3T3-E1细胞加载12%牵张力0、3、6、12和24 h后,利用碱性磷酸酶（ALP）活性检测试剂盒检测ALP活性,实时荧光定量PCR检测骨钙素（OCN）、成骨细胞特异性转录因子Osterix（OSX）、Runt相关转录因子2（Runx2） mRNA和miR-199a的表达。将MC3T3-E1细胞分为对照组、牵张力组、牵张力+miR-NC组和牵张力+miR-199a组,加载12%牵张力和转染miR-199a模拟物后,观察miR-199a和OCN、OSX、Runx2 mRNA及蛋白表达以及ALP活性。茜素红S（ARS）染色观察钙结节形成能力。采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-199a与胰岛素样生长因子1（IGF1）的靶向关系,实时荧光定量PCR法和免疫印迹法检测miR-199a模拟物对IGF1 mRNA和蛋白表达的影响。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果： 与0 h时间点相比,以机械牵张力刺激3、6、12和24 h后,MC3T3-E1细胞ALP活性和OCN、OSX、Runx2 mRNA表达水平均显著升高,而miR-199a表达水平显著降低（P<0.05）,12 h时变化最为显著。与对照组相比,牵张力组细胞中miR-199a表达水平显著降低,而细胞ALP活性、OCN、OSX、Runx2 mRNA及蛋白表达水平、钙结节形成水平均显著升高（P<0.05）;与牵张力组相比,牵张力+miR-NC组细胞中上述各指标差异均无统计学意义（P>0.05）;与牵张力+miR-NC组相比,牵张力+miR-199a组细胞中miR-199a表达水平显著升高,而细胞ALP活性、OCN、OSX、Runx2 mRNA及蛋白表达水平、钙结节形成水平均显著降低（P<0.05）。miR-199a可与IGF1靶向结合,miR-199a模拟物可使MC3T3-E1细胞中IGF1 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。结论： miR-199a可抑制机械牵张力刺激诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化,其作用机制可能与靶向调控IGF1表达有关。     

高度浓缩生长因子对MC3T3-E1成骨细胞生物学性能的影响

目的：观察高度浓缩生长因子（concentrated growth factor,CGF）对成骨细胞生物学性能的影响。方法：将MC3T3-E1细胞在CGF环境下进行培养,并设立空白对照组。扫描电镜观察成骨细胞在CGF表面的附着;培养1、4、7 d后,检测细胞增殖情况以及碱性磷酸酶（ALP）活性;茜素红染色观察矿化结节和成骨相关基因Runx2的表达。CGF浸出液培养细胞24 h后,以鬼笔环肽染色观察细胞骨架的形态变化。采用 SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果：CCK-8比色显示,培养1、4、7 d,在相同时间点,实验组与对照组相比,CGF细胞增殖活性显著增强（P< 0.05）。ALP活性检测显示,培养1 d后,实验组与对照组无显著差异（P>0.05）;培养4、7 d后,实验组与对照组相比,ALP活性具有显著差异（P<0.05)。茜素红染色显示,CGF组钙化结节数量增多且面积较大。鬼笔环肽染色和DAPI染色可见,CGF组中细胞数量增多,细胞铺展面增大,肌动蛋白形态更为清晰。CGF可促进Runx2 mRNA表达（P<0.05）。结论：CGF可促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化以及Runx2的表达。     

微振动对成骨细胞成骨效应的瞬时影响

目的 在不考虑间歇期的介入所带来的延时效应下,研究高频率低振幅微振动（LMHFV）刺激对成骨细胞成骨效应的瞬时影响。方法 培养小鼠成骨前体细胞系（MC3T3-E1）,实验组在施加高频率（40 Hz）、低振幅（0.49 g）微振动30 min后,立即通过实时荧光定量聚合酶链反应检测早期成骨分化标志物Runt相关转录因子2（Runx2）、Ⅰ型胶原蛋白（Col-Ⅰ）、碱性磷酸酶（ALP）的表达,并检测活性氧（ROS）浓度变化及线粒体形态变化,后加入抗氧化剂后继续观察上述指标的变化。结果 LMHFV刺激后Runx2、Col-Ⅰ、ALP的mRNA表达明显下调（P<0.01）,线粒体ROS浓度升高（P<0.01）,线粒体长度缩短（P<0.01）;抗氧化剂的使用则使上述变化得到显著缓解（P<0.01）。结论 排除间歇期的干扰后,LMHFV（40 Hz,0.49 g）可降低成骨细胞内早期成骨分化标志物的表达,促进线粒体ROS的产生与积累并导致线粒体的过度分裂。