鼠疫菌基因组学研究进展

不同来源鼠疫菌株和假结核菌的测序完成,为我们通过比较基因组学手段对鼠疫菌进行研究提供了前所未有的机遇。本文通过对鼠疫菌基因组间及其与假结核菌基因组的分析比较,从全基因组的水平描述了鼠疫菌的基本特征,并论述了目前以比较基因组学为手段,从基因组水平来探讨鼠疫菌在编码序列、基因组重排、毒力基因、生境适应、种间种内进化等方面的研究现状。     

鼠疫与假结核耶尔森菌基因组比较分析

为了在流行静息期间建立鼠疫监测,比较自网上下载的10株鼠疫菌及3株假结核菌的全基因组序列。发现依照鼠疫菌CO92株划分的68个"板块",67个在假结核菌中完整或大部出现,确定了这些板块在假结核菌基因组中的连接顺序。确定了假结核菌具有与鼠疫菌同样的7拷贝rRNA基因簇,并由此引起最初的基因组重排。假结核菌与鼠疫菌分野前已在16个位置插入了4种插入序列,这些插入序列在假结核菌中尚未引起重排。确定了20处鼠疫菌特有的"疫岛(PeI)"与39处假结核菌特有的"假岛(PsI)"序列,这些序列可在监测中遇到非典型菌株时,用于鉴别鼠疫菌与假结核菌。     

鼠疫菌起始板块编码序列分析

目的 验证核糖体结合部位(RBS)定位的可靠性。 方法 选取了鼠疫菌基因组中一个具有特征性的板块,采用传统及RBS方法确定其中含有的编码序列(CDS)数量,比较其一致性,并通过对10株不同来源的鼠疫菌全基因组序列的比较,确定突变发生的位置及对CDS的影响,从而判断RBS基因判定方法的可靠性。 结果 利用RBS定位鼠疫菌起始板块中的蛋白质编码序列,CO92序列在该板块范围内共标注了47个基因的CDS,按本研究的方法可发现74个 CDS,其中与原标注完全相符24个,部分相符8个。发现9个CDS具有多个翻译起点。发现42个新CDS,多编码不足100个氨基酸的短肽。分析了10株鼠疫菌的突变,以判断突变对CDS的影响。在该板块范围内共出现SNP及插入或缺失突变36处,按原CO92基因标注,这些突变对12个CDS发生影响,但按照RBS的标注方法,受到影响的CDS减少至9个,还有3个CDS减轻了影响的程度。 结论 RBS可以成为认定基因确实存在的最重要指标,但目前尚不能取代以马尔科夫模型为基础的基因标注方法。     

首株分离自云南元谋猫的鼠疫噬菌体裂解谱及基因组学特性研究

  目的  以云南元谋鼠疫疫源地指示动物猫中分离到的一株鼠疫噬菌体为研究对象，通过观察其形态，并对其裂解谱及基因组特性进行研究，进一步丰富云南省鼠疫噬菌体数据库。  方法  将鼠疫疫苗株EV76作为宿主菌，采用双层琼脂平板法从云南省鼠疫疫源地指示动物猫肛拭子中分离纯化噬菌体并测定其效价，利用透射电子显微镜观察其形态，单层平板法观察鼠疫噬菌体YMM68对66株菌在室温（约18～22 ℃）、28 ℃、37 ℃的裂解能力，提取该株鼠疫噬菌体的DNA进行二代测序，并利用生物信息学软件分析其基因组的特征与功能。  结果  分离得到一株鼠疫噬菌体，将其命名为YMM68。 该株鼠疫噬菌体噬菌斑清晰、大小均一，直径在（0.7～1.4）mm，透射电子显微镜观察其具有正二十面体头部和收缩性的尾部，其在室温（18～22 ℃）、28 ℃、37 ℃ 3个温度下均能裂解受试的鼠疫菌，还能裂解福氏志贺菌2a，其余的受试菌株不能被裂解。 鼠疫噬菌体YMM68的基因组全长46 902 bp，G＋C含量为50%，并发现YMM68的基因组上共编码71个蛋白，不编码tRNA基因，未发现抗生素抗性基因。  结论  首次从云南元谋鼠疫疫源地指示动物猫中分离到一株鼠疫噬菌体，该株鼠疫噬菌体属于肌尾噬菌体，具有一定的裂解宽度，根据其裂解谱特性及基因组特性研究，具有一定的潜在应用价值。     

衣壳蛋白和甲基转移酶对戊型肝炎病毒的基因分型

目的探讨人戊型肝炎病毒(HEV)的部分编码区序列能否作为其基因组分型的依据。方法从GenBank中查找并下载全基因组测序完整的能感染人类的HEV基因组及蛋白序列共35株,用Clustal W程序对35株HEV全序列以及部分编码区序列进行多序列比对,并用treev 32绘制基因进化树,研究其进化关系。结果HEV的基因组全长7.5kb;而衣壳蛋白和甲基转移酶的编码序列分别为1 982bp和545bp,这2种蛋白的多序列比对和进化分析结果与完整基因组的分型结果相符。结论衣壳蛋白和甲基转移酶可作为HEV的分型依据,且是一种更简便、快捷的方法。     

单增李斯特菌前噬菌体的分布及遗传特征分析

目的 了解单增李斯特菌基因组中前噬菌体分布状况和基因组特征。方法 自公共数据库GenBank获得275株单增李斯特菌的全基因组序列，运用前噬菌体在线预测软件（PHASTER）对其携带的前噬菌体进行预测。并对预测的完整前噬菌体进行聚类分析、插入位点识别、噬菌体整合酶多态性分析。此外，通过比对耐药基因和毒力基因数据库，搜寻前噬菌体可能携带的耐药基因和毒力基因。结果 本研究发现99.3%的单增李斯特菌基因组含有前噬菌体序列，155株（56.4%）单增李斯特菌基因组预测到229个完整前噬菌体序列。所有完整前噬菌体聚集成4个群，进一步划分为10个簇。前噬菌体分群与其宿主菌所属家系具有较强的相关性，但与宿主菌来源无关。本研究识别到10个前噬菌体插入位点，其中lmot17(tRNAArg),lmot11(tRNASer)和comK是3个最常见的插入位点，lmo1263为新发现的插入位点。相同插入位点前噬菌体所携带整合酶氨基酸序列高度相似。此外，研究发现部分家系Ⅲ菌株和1株家系Ⅰ菌株的噬菌体中携带毒力相关蛋白E编码基因（virE），所有完整前噬菌体中未发现耐药基因。结论 单增李斯特菌普遍携带前噬菌体，...     

斯氏弓形杆菌基于基因组序列遗传特征分析

  目的  获得斯氏弓形杆菌的遗传特征,并对其耐药基因及毒力相关基因进行预测分析。  方法  对本实验室分离培养的8株斯氏弓形杆菌进行基因组测序并从NCBI和PATRIC数据库中下载全部已完成基因组测序的15株斯氏弓形杆菌的全基因组序列,应用生物信息学软件对23株不同地域、不同宿主来源的斯氏弓形杆菌进行遗传特征分析。  结果  23株斯氏弓形杆菌中仅3株菌携带耐药基因,且均为β-内酰胺类抗生素耐药基因。 所有菌株均含有与免疫逃避、侵袭及运动等相关的毒力基因。 与其他菌种弓形杆菌常见的10种毒力基因比对分析发现,本研究中所有斯氏弓形杆菌菌株均含有ciaB、tlyA、cj1349、pldA和mviN基因,2株菌（CNAS12-1和F28）含有iroE基因,均不携带另外4种毒力基因。 21.7%（5/23）的菌株包含Ⅵ型分泌系统（T6SS）基因簇,且其与弯曲菌属内的T6SS存在基因组成及排列的差异。  结论  斯氏弓形杆菌有较高的遗传多样性,部分菌株可能有潜在的耐药和致病特征。     

基于高通量测序的平均核苷酸一致性在1株弗朗西斯菌鉴定中的应用

目的对一溺水性肺炎患者血液标本中分离的弗朗西斯菌(编号Wenzhou1)进行菌种鉴定。方法采用Illumina二代测序平台2000/mi Seq系统对实验菌株进行高通量测序,Microbe Trakr Plus软件对测得的全基因组草图进行序列拼接。在Gen Bank数据库中,对实验菌株的16S rRNA基因、mdh基因、rpo B基因和sdh A基因序列进行NCBI BLAST分析,获得与实验菌株遗传关系接近的近缘菌种信息。Java 8运行环境,Ortho ANI软件对实验菌株和近缘菌种进行全基因组序列NCBI BLAST搜索和全基因组平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)分析。结果测得的弗朗西斯菌Wenzhou1的基因组大小为1.96×10~6bp,含74个重叠群(contigs)。基因组G+C mol%为32.1%,与其他弗朗西斯菌和另弗朗西斯菌一致。Gen Bank数据库NCBI BLAST分析结果显示,Wenzhou1的16S rRNA基因、mdh基因、rpo B基因和sdh A基因序列与西班牙弗朗西斯菌FSC454和"土拉弗朗西斯菌新凶手亚种"3523最为近缘。ANI分析显示,实验菌株Wenzhou1与西班牙弗朗西斯菌FSC454的ANI为97.8%,与"土拉弗朗西斯菌新凶手亚种"3523的ANI在97.5%~97.6%之间,而与土拉弗朗西斯菌的4个亚种的ANI在91.3%~91.5%之间。结论基于全基因组序列的ANI分析是一种准确和有效的菌种鉴定方法。Wenzhou1可明确鉴定为西班牙弗朗西斯菌。     

dndC基因在脉冲场凝胶电泳基因组降解中的作用及降解处理方法

  目的  了解大肠埃希菌和弗格森埃希菌dndC基因的携带情况,以及该基因与脉冲场凝胶电泳（PFGE）基因组降解表型之间的关系,探讨PFGE中菌株基因组降解的原因及处理方法。  方法  使用PFGE对450株大肠埃希菌和弗格森埃希菌进行分析,设计引物检测dndC基因的携带情况并进行序列测定。 通过dndC基因序列比对和进化树的构建,获得dndC基因型别以及其在不同型别大肠埃希菌中的分布。 通过添加硫脲和消毒电泳仪研究基因组降解的处理方法。  结果  450株大肠埃希菌和弗格森埃希菌中,降解的菌株为40株（8.89%）。 dndC基因阳性菌株33株（7.33%）,均出现了降解。 大肠埃希菌携带的dndC基因可分为8个群。 不同型别大肠埃希菌中均存在dndC基因阳性菌株,且阳性率存在差异。 添加硫脲可以有效缓解PFGE分析中dndC基因导致的降解,电泳仪消毒可以缓解全胶降解的情况。  结论  dndC基因会导致大肠埃希菌和弗格森埃希菌PFGE分析中基因组降解,添加硫脲可以缓解此降解。     

1株LpsB突变致多黏菌素B耐药鲍曼不动杆菌的全基因测序分析*

摘要:目的研究1 株多黏菌素B高水平耐药的多重耐药鲍曼不动杆菌的全基因组测序的分子特点。方法将1株分离自脑脓肿患者脑脊液标本的多黏茵素高水平耐药鲍曼不动杆菌Z198株作为目标研究菌，通过Nanopore PromethION和llumina No- vaSeq PE150测序平台对其进行全基因组测序,再通过各数据库进行比对分析检测菌株的多位点序列分型(MLST)、抗菌药物耐药基因、毒力基因,同时采用Circos软件对样品基因组组装和注释结果进行可视化分析。Z198基因组上交NCBI数据库。结果全基因组测序发现该菌株含有1 个染色体、1个固有质粒,11个基因岛、4个前噬菌体。通过数据库比对,本菌为ST2型,共携带高达34种抗菌药物耐药基因,主要为IpsB、blaoxA.23、blaox.6、blaxDc-.-3等,同时含有OmpA、磷脂酶C、包膜、溶血素、 生物膜调控系统等19 种主要毒力因子。结论本研究检出 1例LpsB四点突变导致多黏菌素B耐药的鲍曼不动杆菌。该菌株同时携带多重耐药基因及毒力因子。多黏菌素耐药鲍曼不动杆菌外膜脂质修饰的耐药机制及分子流行病学需高度持续关注。     

利用基因芯片技术分析空肠弯曲菌的遗传特征

目的 为分析我国弯曲菌遗传特征,本研究根据已发表多株弯曲菌的全基因组测序特征及比对结果自行设计基因芯片,利用芯片对我国不同宿主来源菌株进行遗传特异性分析。方法 根据前期基因组水平比对分析的结果,利用Combimatrix tilingCustomArrayTM 90K芯片,设计DNA芯片。芯片包含已测序菌株 ICDCCJ07001、269.97、NCTC11168、81-176、81-116和RM1221共3384个CDS的探针序列,以及空肠弯曲菌耐药及致病性相关2个质粒共80个CDS的探针序列,与脂寡糖的合成相关基因簇16种共219个CDS的探针序列、荚膜多糖合成相关基因簇7种共160个CDS的所有序列。对我国不同宿主来源27株分离菌株提取DNA,利用芯片进行杂交,获得杂交信息并分析不同菌株CDS分布特征分析及聚类特点。结果 中国菌株的主要变异区域主要存在于与脂寡糖、荚膜多糖合成相关的基因簇、鞭毛修饰相关的基因簇、DNA限制/修饰相关的基因簇以及空肠弯曲菌Mu样噬菌体基因簇。基因组水平不同来源菌株CDS分布的聚类结果没有发现显著的宿主归因特点,但GBS相关菌株脂寡糖合成相关基因组成具有共性特征。结论 通过验证以及与过去研究的比较,本次研究中的基因芯片技术结果准确可信,本研究所用基因芯片在分析空肠弯曲菌基因多态性方面具有很好的优势,可用于弯曲菌遗传特征和重要毒力因子的分析和检测。     

河弧菌可移动遗传元件的预测与分析

  目的  研究河弧菌中可移动遗传元件的种类和分布，探究其对河弧菌适应性进化的意义。  方法  从公共数据库中获取170株河弧菌的基因组数据，使用MGEfinder软件识别河弧菌中的可移动遗传元件，并对其种类、插入活性、分布及毒力因子进行研究。  结果  170株河弧菌基因组中共识别到1 227个可移动遗传元件。 这些元件可归类为完整噬菌体、不完整噬菌体、插入序列、含有第二类内含子的元件、含有丝氨酸/酪氨酸重组酶的元件、含有末端重复序列和编码基因的元件、只含有编码基因的元件以及不含任何开放读码框的元件共8类。 317个代表性元件序列簇中有307个转座活性都较低，但高转座活性的可移动遗传元件在河弧菌中分布更广泛。 可移动遗传元件携带的编码基因的功能主要涉及基因复制、重组、修复，以及基因转录等。 可移动遗传元件在环境分离株和临床分离株的分布没有差异。 在插入序列、含有丝氨酸/酪氨酸重组酶的元件、含有末端重复序列和编码基因的元件以及只含有编码基因的元件这4种可移动遗传元件中识别到多种毒力因子，且不同的可移动遗传元件携带的毒力因子不同。  结论  河弧菌含有多种类型、多种功能的可移动遗传元件，表现出以高转座活性可移动遗传元件为主导的适应性进化特征。     

浙江省近年甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因序列分析

目的 分析浙江省2009 2013年初甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因(NA)序列进化特征。 方法 提取浙江省2009 2013年初29株甲型H1N1流感病毒基因组RNA,反转录－聚合酶链反应(RT-PCR)扩增NA基因,测序并拼接出ORF。以浙江省不同年份与地域15份代表性毒株NA序列和GenBank数据库中选取的22株2009 2012年国内外甲型H1N1流感病毒NA基因序列,采用MEGA 5.1软件对其进行序列比对并构建种系发生树。 结果 扩增并测序获得29株甲型H1N1流感病毒的NA基因ORF的全长序列,与国内外甲型H1N1流感病毒NA序列比对后显示序列的同源性较高,浙江省毒株与北美早期甲型H1N1流感病毒典型代表株A/California/04/2009(H1N1)的同源性为98.20％~99.50%,其中采集于2012年末和2013年初的4份病毒NA与A/California/04/2009(H1N1)的同源性为98.63%~99.14%。在1株采集于2010年1月的甲型H1N1流感病毒NA的基因序列中发现可导致奥司他韦耐药的H275Y突变基因型。 结论 虽然浙江省后期的甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因累积了更多的变异,但所有毒株之间基因同源性仍然较高,所有毒株的神经氨酸酶基因同源性达到98.20％及以上,序列分析结果证实1份毒株携带奥司他韦耐药基因型突变。     

规律成簇的间隔短回文重复序列中间隔序列的噬菌体来源研究

目的 发现在现有的全基因组测序完成的原核生物中规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)系统中间隔序列分布规律以及间隔序列中噬菌体来源情况. 方法 整理现有CRISPR数据库中2762株细菌基因组中的CRISPR系统和其中的间隔序列数据,整理GenBank数据库中发表的1444个噬菌体基因组数据.利用BLASTN软件对间隔序列数据与噬菌体基因组进行相似性比较,计数资料比较使用2检验. 结果 在2762个细菌基因组中整理出1940个基因组存在确定或可能的CRISPR结构和90 096条间隔序列,多数基因组具有1~50条间隔序列(1414/1940,72.9%),间隔序列数量250条的仅有58个基因组(58/1940,3.0%).其中古细菌13株(13/150,8.6%),真细菌45株(45/2612,1.7%),差异有统计学意义(2=29.98,P 0.01).相似性比较结果共发现245个细菌基因组的1055条间隔序列,成功比对上363个噬菌体,比对成功率仅为0.12%. 结论 细菌基因组中的CRISPR系统中间隔序列数量存在较大差异,古细菌基因组中CRISPR系统存在更多的间隔序列.相似性比较中噬菌体来源的间隔序列所占比例低,提示与细菌和噬菌体基因组发现较少相关,进一步深入研究可以大幅度提高成功率.     

Development of a 5' nuclease assay to detect ciprofloxacin resistant isolates of the biowarfare agent Yersinia pestis

The detection of antibiotic resistance in agents of biowarfare is extremely critical in order to start appropriate therapy in a timely manner. We have developed a 5' nuclease assay to detect ciprofloxacin resistance (Cip(r)) in Yersinia pestis. Two groups of fluorogenic probes were developed. The first group included a probe homologous to the wild type Y. pestis gyrA sequence with two corresponding probes that were homologous with two different mis-sense mutations in codon 81 of GyrA. The second group of probes included a wild type probe and two corresponding probes that recognized mis-sense mutations in codon 83 or gyrA. These probes specifically reacted only with the homologous DNA sequences. The 5' nuclease assay was sensitive to 1 pg (approximately 1 colony forming unit) of starting template and could be used on semi-purified DNA. We tested our optimized assay against a group of 38 Cip(r) Y. pestis isolates and demonstrated that it was accurate at determining the gyrA allele encoded by these strains. The 5' nuclease assay performed on the LightCycler proved to be sensitive, rapid and accurate at identification of Cip(r) Y. pestis and thus should be useful in characterization of this organism in the event of a future act of bioterrorism.     

Genomic characteristics of Streptococcus agalactiae based on the pan-genome orthologous group analysis according to invasiveness and capsular genotype

ObjectiveFollowing the construction of a bacterial pan-genome from the whole genome sequences on a web-based pipeline, all coding DNA sequences (CDSs) can be clustered into pan-genome orthologous groups (POGs), which is a similar approach to comparative genome hybridization on glass microscope slides. We aimed to clarify the genomic characteristics of Streptococcus agalactiae based on the POG analysis.MethodsSixty-six S. agalactiae isolates obtained from invasive specimens (blood and cerebrospinal fluid) and non-invasive specimens (urine and vaginal discharge) between 2010 and 2017 in Korea were subjected to whole genome sequencing (WGS). Based on the WGS data, we conducted the POG analysis and constructed a phylogenetic tree along with capsular polysaccharide (CPS) genotyping. We compared the genomics of invasive vs. non-invasive isolates, as well as CPS III vs. non-CPS III genotypes.ResultsPredicted pan- and core-genome sizes were 3416 and 1658 genes, respectively. We found four clusters consisting of CPS genotypes (III, VIII, Ib/VI, and Ia) in the phylogenetic tree. There were significant differences in two metabolic pathways specific to invasiveness, and in six metabolic pathways specific to CPS III type produced by CDSs.ConclusionOur observations reveal the pan- and core-genome sizes, four clusters of genomes distributed by CPS genotypes, and unique CDS features of S. agalactiae by comparative genomics in terms of invasiveness and CPS genotype.     

ARG-ANNOT,a New Bioinformatic Tool To Discover Antibiotic Resistance Genes in Bacterial Genomes

ARG-ANNOT (Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation) is a new bioinformatic tool that was created to detect existing and putative new antibiotic resistance (AR) genes in bacterial genomes. ARG-ANNOT uses a local BLAST program in Bio-Edit software that allows the user to analyze sequences without a Web interface. All AR genetic determinants were collected from published works and online resources; nucleotide and protein sequences were retrieved from the NCBI GenBank database. After building a database that includes 1,689 antibiotic resistance genes, the software was tested in a blind manner using 100 random sequences selected from the database to verify that the sensitivity and specificity were at 100% even when partial sequences were queried. Notably, BLAST analysis results obtained using the rmtF gene sequence (a new aminoglycoside-modifying enzyme gene sequence that is not included in the database) as a query revealed that the tool was able to link this sequence to short sequences (17 to 40 bp) found in other genes of the rmt family with significant E values. Finally, the analysis of 178 Acinetobacter baumannii and 20 Staphylococcus aureus genomes allowed the detection of a significantly higher number of AR genes than the Resfinder gene analyzer and 11 point mutations in target genes known to be associated with AR. The average time for the analysis of a genome was 3.35 ± 0.13 min. We have created a concise database for BLAST using a Bio-Edit interface that can detect AR genetic determinants in bacterial genomes and can rapidly and easily discover putative new AR genetic determinants.