大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖与多向分化的能力

背景:生理条件下机体内多数骨髓间充质干细胞增殖并不明显,然而在一定刺激下可表现出旺盛的有丝分裂活动,具有很强的增殖倍增能力,且体外实验表明其具有多向分化潜能.目的:进一步验证体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖与多向分化潜能.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,MTT法绘制细胞生长曲线,免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定.取传至第4代细胞,分别用成骨、成软骨、成脂肪和成神经诱导剂予以培养,通过碱性磷酸酶染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、油红O染色、NeuN抗体免疫组化染色进行分化能力鉴定.结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31 h,免疫细胞化学染色后CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.第4代骨髓间充质干细胞成骨诱导2周后出现钙盐沉积,成软骨诱导培养2周后Ⅱ型胶原检测呈阳性,成脂肪诱导培养2周后在细胞的胞浆内充满大量红色脂肪滴,成神经诱导6 h后细胞出现突起,类似神经元的轴突和树突纤维,NeuN免疫组化染色呈阳性.表明体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖能力旺盛,可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞方向分化.     

成人脂肪间充质干细胞体外长期培养后的成骨分化潜能

背景:获得足够数量的种子细胞需要在体外进行长期传代扩增,目前涉及体外长期培养对成人脂肪间充质干细胞的基本生物学性状及成骨分化潜能影响的报道甚少.目的:观察体外长期培养对成人脂肪间充质干细胞的基本生物学性状及其成骨分化潜能的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/06在解放军兰州军区兰州总医院骨科研究所完成.材料:成人腹部皮下脂肪组织来源于骨盆骨折患者,由解放军兰州军区兰州总医院创伤骨科提供.方法:Ⅰ型胶原酶消化法从成人脂肪组织中分离培养脂肪间充质干细胞,体外传代扩增.收集第2,5,10,15,20代细胞,加入成骨培养液进行成骨诱导分化.主要观察指标:脂肪间充质干细胞的超微结构、表面分子标志表达、生长曲线、成骨潜能.不同代数脂肪间充质干细胞成骨诱导后骨钙素及Ⅰ型胶原的吸光度值比较.结果:脂肪间充质干细胞成骨诱导第7天,由长梭形变为椭圆形、多角形,岛状分布,胞浆中出现黑色颗粒.细胞表面有较多伪足,有一两个核仁,有分叶,具备正常细胞器结构.表达CD44(96.31%),不表达CD34(1.15%).第2,5,10,15,20代脂肪间充质干细胞的生长曲线无明显差异,均呈反"S"形.上述各代细胞诱导7 d后开始表达碱性磷酸酶,且随诱导时间的延长阳性细胞数增多,至诱导28 d出现圆形不透明结节,诱导14 d骨钙素、Ⅰ型胶原均呈阳性表达.随传代次数的增加,骨钙素及Ⅰ型胶原的吸光度值均有所减低,至第20代时差异显著(P<0.05).结论:成人脂肪间充质干细胞经体外长期培养后,其一般生物学性状可保持稳定,但成骨分化潜能有所下降.     

人脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性

背景:脂肪来源间充质干细胞取材于吸脂手术所获得的脂肪抽吸物,可反复取材,原料来源充足。目的:建立一种体外分离培养人脂肪来源间充质干细胞的方法,并分析其生物学特性。方法:采用胶原酶消化法分离获取人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态;观察分析传代第3,7,10代细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测传代第5代细胞表面标志表达。取传代第4代细胞行体外成骨细胞诱导和成脂诱导,采用碱性磷酸酶染色及油红O染色鉴定。冻存传代细胞,分别于2,6个月后复苏,锥虫蓝染色计数复苏后细胞存活率。结果与结论:原代细胞3d贴壁,6d后开始快速增长并形成集落,11d左右达80%~90%融合,多呈纤维样;传代后细胞维持纤维样形态。传代细胞潜伏期24~48h,对数增殖期三四天,对数增殖期后第五六天进入平台期。间充质干细胞表面CD34、CD14、HLA-DR呈阴性表达,CD44、CD105、CD13呈阳性表达,HLA-ABC呈弱阳性表达。具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力,冻存复苏后细胞存活率达90%以上,且与未冻存传代细胞具有相同的生长特性。     

人脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性

背景：脂肪来源间充质干细胞取材于吸脂手术所获得的脂肪抽吸物,可反复取材,原料来源充足.目的：建立一种体外分离培养人脂肪来源间充质干细胞的方法,并分析其生物学特性.方法：采用胶原酶消化法分离获取人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态;观察分析传代第3,7,10 代细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测传代第5 代细胞表面标志表达.取传代第4代细胞行体外成骨细胞诱导和成脂诱导,采用碱性磷酸酶染色及油红O染色鉴定.冻存传代细胞,分别于 2,6 个月后复苏,锥虫蓝染色计数复苏后细胞存活率.结果与结论：原代细胞3 d 贴壁,6 d 后开始快速增长并形成集落,11 d左右达80%~90%融合,多呈纤维样;传代后细胞维持纤维样形态.传代细胞潜伏期24~48 h,对数增殖期三四天,对数增殖期后第五六天进入平台期.间充质干细胞表面CD34、CD14、HLA-DR 呈阴性表达,CD44、CD105、CD13呈阳性表达,HLA-ABC呈弱阳性表达.具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力,冻存复苏后细胞存活率达 90% 以上,且与未冻存传代细胞具有相同的生长特性.     

人脐带间充质干细胞体外成骨及其免疫学特征

背景:目前关于脐带源性干细胞的研究主要是针对其多向分化、组织修复方面,而对脐带干细胞的同种异体之间移植免疫学的报道较少.目的:观察体外培养的人脐带间充质干细胞生物学特性、成骨分化潜能及移植免疫学特征.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-11在吉林大学药学院病理学实验室完成.材料:脐带来源于健康产妇足月剖腹产的胎儿,靠近胎儿侧5cm,均征得孕妇同意.方法:应用组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞,胰酶消化传代.取传至第5代细胞,加入含地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的α-MEM完全培养基进行成骨诱导.另取传至第5代细胞,分别进行正常培养及应用γ-干扰素刺激48 h.主要观察指标:脐带间充质干细胞形态观察、生长曲线分析、免疫表型分析.碱性磷酸酶染色观察细胞成骨分化情况.流式细胞仪检测γ-干扰素刺激后细胞免疫表型变化.结果:培养7 d倒置显微镜下可见组织块边缘出现呈长梭形、多角形或三角形的贴壁细胞,且随时间延长组织块周围细胞数量逐渐增多.第2,5,9代细胞之间的生长曲线无明显变化,培养20代内未见细胞衰老及增殖速度减慢等现象发生.第2代贴壁细胞CD44,CD105均呈阳性表达,CD34,CD45均呈阴性表达.成骨诱导14 d后,碱性磷酸酶染色可见胞核染成均一的淡蓝色.第5代脐带间充质干细胞HLA-ABC呈弱阳性(40.50%),HLA-DR,CD80,CD86呈阴性表达;γ-干扰素刺激48 h后,HLA-ABC阳性率增加至87.44%,HLA-DR,CD80,CD86仍呈阴性表达.结论:人脐带间充质干细胞体外诱导成骨能力确切,具有类似骨髓间充质干细胞的特异性表面标记,且具有同种异体移植的低免疫原性.     

大鼠腹股沟脂肪间充质干细胞的分离、培养、鉴定及活体标记

背景:脂肪间充质干细胞具有来源丰富、取材方便、体外有较强增殖能力并具有多向分化的特点,有望成为骨组织工程、细胞治疗等的种子细胞。目的:培养扩增大鼠脂肪源间充质干细胞,以活体标记并鉴定其分化潜能。方法:无菌条件下取大鼠双侧腹股沟脂肪,Ⅰ胶原酶消化法分离培养脂肪源性干细胞,胰蛋白酶消化法传代扩增。取第 3 代脂肪干细胞进行流式检测 HCAM、CD106、CD29、CD49D 和 CD34,生长曲线测定,吉姆萨染色,菲立磁标记,成脂诱导后油红 O 染色及成骨诱导后茜素红染色钙结节。结果与结论:细胞呈长梭形漩涡样生长,第 3 代细胞流式鉴定 CD29 阳性,CD34、HCAM、CD49d、CD106 低表达,生长曲线测定有对数生长期,平台期,菲立磁标记阳性率达 80%,并且在一些诱导剂下分化为脂肪细胞及成骨细胞。提示,来源于大鼠腹股沟脂肪分离获得的脂肪源干细胞易于培养和传代扩增,并可活体标记且在特殊条件下可分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大.体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要.目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化.结果与结论:大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上.生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃.第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达.成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性.全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义.     

人脂肪来源间充质干细胞成骨及成软骨的潜能

背景:人脂肪来源间充质干细胞是种具有较强的体外增殖和多系分化能力的成体干细胞,可以从美容吸脂手术中获得,取材方便,原料来源丰富,在生物治疗应用方面蕴藏着巨大的价值。目的:体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,探讨其基本生物学特性及成骨成软骨的潜能。方法:取美容吸脂获得的脂肪组织,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养;观察细胞形态、测定细胞周期、流式细胞仪鉴定细胞表面标志;取第3代细胞,分别加入成骨诱导培养基及成软骨诱导培养基行体外成骨及成软骨诱导。结果与结论:体外培养人脂肪来源间充质干细胞呈纤维样形态,原代细胞24h内贴壁,培养5~7d后开始形成细胞集落;经细胞周期检测显示G0/G1,S和G2/M所占比例分别为(88±2)%,(12±2)%和0.03%。经流式细胞仪检测CD29和CD105呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达。RT-PCR检测显示,人脂肪间充质干细胞经成骨诱导分化后细胞中骨桥蛋白mRNA呈阳性表达,经软骨诱导分化后细胞中Ⅱ型胶原mRNA呈阳性表达。结果证实,实验成功体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,其具有向成骨细胞和软骨细胞分化的潜能。     

小鼠卵黄囊间充质干细胞培养及诱导成血管内皮细胞

目的:成体间充质干细胞发育分化接近终末状态后经过一段时间的体外培养,易衰老凋亡,而来自于早期胚胎的卵黄囊间充质干细胞具有更大的增殖潜能和可塑性。那么体外分离培养的小鼠卵黄囊间充质干细胞能否定向诱导分化为血管内皮细胞呢?方法:实验于2006-03/2007-01在首都医科大学组织学与胚胎学实验室完成。①实验方法:显微分离妊娠10d的ICR小鼠胚胎卵黄囊,经Ⅰ型胶原酶消化得到卵黄囊细胞,取贴壁细胞培养,于接近90%融合时按1∶2进行传代。②实验评估:取生长状态良好的第1代细胞,透射电镜观察细胞器超微结构,流式细胞仪检测其表面标志的表达;以血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子进行体外诱导,观察诱导后细胞形态及超微结构变化,免疫荧光法鉴定诱导后内皮细胞标志物的表达。结果:①体外分离培养可获得小鼠卵黄囊间充质干细胞,大多数呈梭形。透射电镜下卵黄囊间充质干细胞表面有微绒毛,胞浆中细胞器丰富,核大,形态不规则。流式细胞仪检测第1代卵黄囊间充质干细胞CD44、CD105均呈阳性,CD34亦有少量表达。②诱导后的细胞形态明显改变,透射电镜下可见内皮细胞特征性Weible-Palade小体,胞质中有大量吞饮小泡,同时内皮细胞标志物FLK1染色呈阳性。结论:体外可分离培养出小鼠卵黄囊间充质干细胞,并能够成功定向诱导分化为血管内皮细胞。     

豚鼠脂肪间充质干细胞向类神经元样细胞的分化

背景:目前关于耳科干细胞研究的动物实验大多是将其他动物种属的干细胞用于豚鼠模型,而对于豚鼠本身来源的干细胞研究报道极少.目的:探寻豚鼠脂肪间充质干细胞向神经细胞元样分化的潜能.方法:取豚鼠脂肪,分离脂肪间充质干细胞培养至第3代,cck-8试剂盒检测第1~10天细胞增殖A值,流式细胞仪检测细胞的免疫表型;成神经诱导并行巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白200免疫荧光染色.结果与结论:豚鼠脂肪间充质干细胞增殖的生长曲线近似"S"形,传代后经过3 d的潜伏期,3 d后进入对数生长期,8 d后进入平台期,其细胞的免疫表型CD29表达率86.3%,CD44表达率55.5%,CD45表达率为0.4%,成神经细胞诱导后细胞形态与神经细胞类似,巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白200染色均呈阳性.说明豚鼠脂肪间充质干细胞在体外易于分离、培养及扩增,具有向神经细胞元样分化的潜能.