人胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒的构建及其稳定表达细胞株的建立

目的构建胰岛素样生长因子1(insulin growth factor1,IGF-1)的真核细胞表达质粒,转染神经胶质瘤细胞(C6细胞),建立hIGF-1稳定表达细胞株,为进一步观察胰岛素样生长因子1基因体内转染后对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响打下基础。方法实验于2004-05/09在吉林大学公共卫生学院放射生物实验室进行。用聚合酶链反应方法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出IGF-1cDNA,然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的hIGF-1基因序列;使用C6细胞株,用脂质体方法转染C6细胞。经G418筛选,形成阳性细胞克隆。继续培养4周,进行W estern blot检测。结果重组的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-hIGF-1所含的IGF-1cDNA序列和插入方向均正确。W estern blot检测结果证实转染的hIGF-1基因在C6细胞内成功表达。结论实验所构建的重组真核细胞表达载体pcDNA3.1-hIGF-1能够稳定表达有活性的hIGF-1,实验结果对进一步观察脊髓损伤后胰岛素样生长因子1抑制神经细胞凋亡的作用有一定意义。     

胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒构建及在大鼠脊髓内的表达

目的:构建胰岛素样生长因子1的真核细胞表达质粒,分析pcDNA3.1-hIGF-1体内转基因的可行性。方法:实验于2004-06/09在吉林大学基础医学院动物实验室完成。①选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只,随机数字表法分为胰岛素样生长因子1组、模型对照组、正常对照组,4只/组。②聚合酶链法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出胰岛素样生长因子1cDNA,然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的人源性胰岛素样生长因子基因序列。③胰岛素样生长因子1组应用直接注射法将阳离子脂质体和pcDNA3.1-hIGF1混合后转染至大鼠胸段脊髓组织中;模型对照组注射等剂量pcDNA3.1和阳离子脂质体混合液。正常对照组未作任何处理。1周后应用免疫组化法观察人源性胰岛素样生长因子在大鼠脊髓中的表达。结果:实验选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只,全部进入结果分析。①聚合酶链反应片段鉴定结果:琼脂糖电泳显示,扩增带大小与预期的人源性胰岛素样生长因子cDNA相同。②重组的真核表达质粒的鉴定结果:酶切鉴定显示,重组的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-hIGF-1所含的IGF-1cDNA序列和插入方向均正确。③基因转染后各组胰岛素样生长因子1免疫组化测定结果:基因转染1周后,胰岛素样生长因子1组脊髓组织内阳性细胞数明显高于模型对照组和正常对照组(48.2±5.3,29.3±4.2,23.8±8.3,P<0.01)。结论:阳离子脂质体介导pcDNA3.1-hIGF1体内转基因的方法是可行的。     

胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒构建及在大鼠脊髓内的表达

目的：构建胰岛素样生长因子1的真核细胞表达质粒，分析pcDNA3．1-hIGF-1体内转基因的町行性。方法：实验于2004—06／09在吉林大学基础医学院动物实验室完成。①选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只，随机数字表法分为胰岛素样生长因子1组、模型对照组、正常对照组，4只／组。②聚合酶链法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出胰岛素样生长因子1cDNA，然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3．1中，酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的人源性胰岛素样生长因子基因序列。③胰岛素样生长因子1组应用直接注射法将阳离子脂质体和pcDNA3．1-hIGF1混合后转染至大鼠胸段脊髓组织中；模型对照组注射等剂量pcDNA3．1和阳离子脂质体混合液。正常对照组未作任何处理。1周后应用免疫组化法观察人源性胰岛素样生长因子在大鼠脊髓中的表达。结果：实验选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只，全部进入结果分析。①聚合酶链反应片段鉴定结果：琼脂糖电泳显示，扩增带大小与预期的人源性胰岛素样生长因子cDNA相同。②重组的真核表达质粒的鉴定结果：酶切鉴定显示，重组的真核细胞表达质粒pcDNA3．1-hOGF-1所含的IGF—1cDNA序列和插入方向均正确。③基因转染后各组胰岛素样生长因子1免疫组化测定结果：基因转染1周后，胰岛素样生长因子1组脊髓组织内阳性细胞数明显高于模型对照组和正常对照组（48．2&;#177;5.3,29．3&;#177;4．2，23．8&;#177;8．3，P〈0．01）。结论：阳离子脂质体介导pcDNA3．1-hIGF1体内转基因的方法是可行的。     

纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达

目的：构建增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced-green fluorescent protein，EGFP）标记的人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor，hIGF-1）真核表达载体，转染至兔骨髓间充质干细胞，为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞。方法：实验于2005—03／2006—01在重庆医科大学儿科研究所完成。根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物，从质粒pcDNA3．1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1，亚克隆至pMD-T18载体，测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中，构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞，通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达。结果：成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达。结论：新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法，经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择。     

胰岛素样生长因子1基因转染兔脂肪间质干细胞的增殖

背景:基因工程是目前软骨修复的主要方法,脂肪间质干细胞以其来源丰富、取材容易、免疫相容性良好、体外培养可以较长时间保持分化表型、有较强的向软骨细胞转化的能力而成为理想的种子细胞.目的:探讨胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间质干细胞增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学基因转染体外观察,于2006-03/2007-03在中国医科大学细胞生物实验室完成.材料:成年新西兰大白兔3只,由中国医科大学实验动物中心提供.含有全长人胰岛素样生长因子1 cDNA片段的质粒pcDNA3.1-hIGF-1由吉林大学徐莘香教授惠赠.方法:取兔颈后皮下脂肪,Ⅰ型胶原酶消化法体外分离培养兔脂肪间质干细胞.取传至第2代细胞,以0.5× 106/孔密度接种于6孔板,细胞融合至90%～95%时随机分为未转染组、转染空载体pcDNA3.1组、转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组,采用脂质体介导基因转染法进行质粒pcDNA3.1-IGF-1转染,经G418筛选后培养4周.主要观察指标:采用RT-PCR及Western blot方法检测胰岛素样生长因子1的表达情况,MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖情况.结果:转染pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞内有大量胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白表达,未转染组及转染空载体pcDNA3.1组无表达.细胞增殖曲线显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞增殖速度较其他2组细胞明显加快.流式细胞仪检测显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞较其他2组细胞的S期比例显著增加(P<0.05),G1期比例显著下降(P＜0.05).结论:质粒pcDNA3.1-IGF-1转染兔脂肪间质干细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进脂肪间质干细胞的增殖.     

纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced-green fluorescent protein,EGFP)标记的人胰岛素样生长因子(human insulin-like growth factor, hIGF-1)真核表达载体,转染至兔骨髓间充质干细胞,为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞.方法:实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成.根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T18载体,测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞,通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达.结果:成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达.结论:新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法,经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择.     

小鼠Atrogin-1基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的：构建小鼠Atrogin-1基因真核表达载体,研究其功能,并探讨其在癌性恶液质骨骼肌萎缩中的作用机制。方法：提取小鼠C2C12细胞RNA,反转成cDNA,PCR合成含有酶切位点的Atrogin-1 cDNA全长,酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,经鉴定及测序证实cDNA片段大小和序列正确,然后用其转染293T细胞,Western blot法检测Atrogin-1蛋白的表达。结果：pcDNA3.1-Atrogin-1含大小、序列正确的Atrogin-1cDNA片段,转染pcDNA3.1-Atrogin-1的293T细胞裂解液中能检测到Atrogin-1蛋白高表达。结论：成功构建了Atrogin-1基因真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,并在真核细胞中表达了目的蛋白,其是研究癌性恶液质的重要工具。     

肌腱愈合及粘连形成机制的研究：胰岛素样生长因子1基因真核表达载体的构建及表达

目的：探讨真核表达载体介导外源性胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染肌腱细胞的可能性。方法：组织块法培养原代肌腱细胞，体外重组真核表达载体pcDNA3．1(+)-IGF-1，并以脂多胺DOGS为介导转染培养的肌腱细胞，反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测IGF-1mRNA的表达，ELISA法检测IGF-1活性蛋白表达。结果：成功构建真核表达载体pcDNA3．1(+)-IGF-1；RT-PCR检测显示转染后的肌腱细胞成功表达IGF-1mRNA；ELISA结果显示转染组IGF-1蛋白表达较对照组明显增高(t=-2．873，P&;lt;0．05)。结论：重组的真核表达载体pcDNA3．1(+)-IGF-1能够将IGF-1cDNA成功导入肌腱细胞并表达。     

构建血红素氧合酶1基因真核表达质粒及在大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达

目的：克隆血红素氧合酶1基因并构建其真核表达重组质粒，进一步检测血红素氧合酶1基因转染大鼠主动脉平滑肌细胞及其表达目的蛋白的效果。 方法：实验于2007-02／12在泸州医学院中心试验室完成。取雄性健康成年SD大鼠1只，腹腔注射氯化汞（1mg／kg）24h后，麻醉状态下取肾脏，从大鼠肾组织中提取总RNA，通过反转录-聚合酶链反应扩增大鼠血红素氧合酶1基因片段，并将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，运用脂质体将重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1转染主动脉平滑肌细胞，通过反转录-聚合酶链反应和Western blot分析血红素氧合酶1基因细胞转染及表达的效果。 结果：经双酶切及测序鉴定证明，正确克隆了血红素氧合酶1基因并成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。反转录-聚合酶链反应及Western blot分析显示血红素氧合酶1基因能成功转染主动脉平滑肌细胞并在mRNA水平和蛋白水平有效表达。 结论：①成功构建血红素氧合酶1基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。②脂质体包裹重组质粒瞬时成功转染到体外培养的主动脉平滑肌细胞并得到有效表达。     

SPACR原核表达载体的构建和表达

目的构建Sialoprotein associated with cones and rods（SPACR）原核表达载体并高效表达。方法根据基因文库中SPACR基因的cDNA序列设计引物,采用PCR方法扩增SPACR cDNA片段,并克隆进原核表达载体pGEX-6P-1中,转化于大肠杆菌BL21,测序鉴定后,用IPTG诱导表达出目的蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖柱柱层析纯化,收获表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果 PCR后扩增得到的目的片段,经酶切鉴定及DNA序列测定,证实重组载体pGEX-6P-1-SPACR构建正确,表达蛋白分子量约为分别为21.2、22.6、36.2及20.8kDa。结论在大肠杆菌中获得了SPACR片段的高效表达,为研究其蛋白功能奠定了基础。     

人Regucalcin cDNA真核表达载体的构建及表达

目的构建人regucalcin（RGN）全长cDNA的真核表达载体，观察其在人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2细胞）中表达。方法用RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA，将扩增的产物连接入pMD18-T克隆载体上。将重绢质粒转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，再用双酶切方法将RGN基因定向连接到真核表达载体DECFP-NI中，构成pEGFP-RGN，将pEGFP-RGN转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确。再用双酶切方法将RGN基因与EGFP定向连接到真核表达载体pcDNA3．1（＋）-zeocin中，构建真核表达pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo的重组体。将pcDNA3．1-RGN．EGFP-zeo转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，用脂质体转染入HK-2细胞。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo表达情况。结果RGNcDNA全长是897bp。以此构建的pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo真核表达载体，经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察到pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。结论本实验成功构建了pcDNA3．1-RGN．EGFP．zeO真核表达质粒，并在HK-2细胞中表达。     

Stathmin特异性siRNA表达质粒抑制stathmin的表达

目的:构建微管解聚蛋白stathmin基因的特异性siRNA质粒表达载体,以便研究stathmin在鼻咽癌中的生物学作用。方法:合成stathmin特异性DNA片段,退火形成的双链DNA片段克隆于质粒表达载体pGenesil-1.3;载体经扩增后,进行酶切和测序鉴定;采用QIAGEN公司脂质体(effectenetransfectionreagent)将鉴定后的重组质粒转入鼻咽癌CNE2细胞;RT-PCR与Westernblot检测stathmin基因表达。结果:酶切和测序分析表明,插入siRNA质粒表达载体中的DNA片段,其碱基序列和插入方向正确。表达分析证实特异性siRNA质粒表达载体能有效抑制鼻咽癌CNE2细胞中stathmin的表达。结论:构建的siRNA质粒表达载体对stathmin的表达有很好的抑制作用。     

人regucalcin cDNA高表达重组质粒的构建及其在原核细胞中的表达

目的原核表达获得大量人regucalc in(RGN)蛋白。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)中扩增RGN全长cDNA,将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T,测序鉴定准确后,进行酶切,将正确的RGN全长cDNA与原核表达载体pET42b( )构建成重组质粒pET42b( )-RGN。将pET42b( )-RGN先转化入大肠杆菌DH5α,提取质粒经双酶切鉴定正确后,再转化入表达宿主大肠杆菌DE3菌株。对转化菌株进行诱导、破菌,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析,鉴定RGN融合蛋白质表达的正确性。RGN重组融合蛋白经N i2 亲和层析纯化,达电泳纯。结果构建了重组质粒pET42b( )-RGN并获得高效表达,RGN重组融合蛋白经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后以包涵体形式存在,表达的蛋白质相对分子质量为34 000。结论人RGN蛋白在pET42b( )原核表达载体可获得高效表达,为进一步了解RGN蛋白质的结构、功能及其抗体的制备等奠定了基础。     

人regucalcin cDNA高表达重组质粒的构建及其在原核细胞中的表达

目的 原核表达获得大量人regucalcin（RGN）蛋白。方法 用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术从人。肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）中扩增RGN全长cDNA，将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T，测序鉴定准确后，进行酶切，将正确的RGN全长cDNA与原核表达载体pET42b（＋）构建成重组质粒pET42b（＋）-RGN。将pET42b（＋）-RGN先转化入大肠杆菌DH5α，提取质粒经双酶切鉴定正确后，再转化入表达宿主大肠杆菌DE3菌株。对转化菌株进行诱导、破菌，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）与免疫印迹分析，鉴定RGN融合蛋白质表达的正确性。RGN重组融合蛋白经Ni^2＋亲和层析纯化，达电泳纯。结果 构建了重组质粒pET42b（＋）-RGN并获得高效表达，RGN重组融合蛋白经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导后以包涵体形式存在，表达的蛋白质相对分子质量为34000。结论 人RGN蛋白在pET42b（＋）原核表达载体可获得高效表达，为进一步了解RGN蛋白质的结构、功能及其抗体的制备等奠定了基础。     

SARS病毒M蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并检测其在Vero细胞中的表达.方法 在PCR引物下游引入Flag序列,以PCR从质粒pGEX-6P-1-SARS-M中扩增M蛋白编码基因片段,将酶切后的PCR产物克隆至pcDNA3.1(+)中,构建并鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-SARS-M.重组质粒经Superfect转染Vero细胞,Western blot检测基因表达情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和基因测序显示构建正确;Western blot检测表明重组M蛋白片段在Vero细胞中获得正确表达.结论 成功构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并在Vero细胞中获得正确表达,为进一步研究M蛋白的功能奠定了基础.     

Ecdysone-controlled expression of transgenes

Inducible expression systems show great potential for use in human gene therapy and systems based on insect ecdysone receptors are particularly promising candidates. This article describes such systems and reviews actual and potential uses of ecdysone-controlled transgenes in vitro and in vivo. The ligand specificity of ecdysone receptor-based systems is considered, along with the safety and efficacy of the ecdysteroid and non-steroidal compounds used to activate them.     

肥胖合并胰岛素抵抗患者 TNF-α基因的表达及其意义

目的研究大网膜脂肪组织中TNF-α转换酶基因和TNF-α基因的表达及其在肥胖和胰岛素抵抗发病机制中的作用.方法用半定量RT-PCR方法研究肥胖合并胰岛素抵抗患者和正常人大网膜脂肪组织中TNF-α转换酶基因和TNF-α基因的表达.结果(1)实验组中TNF-αRNA水平显著高于正常对照组(P<0.01);(2)实验组中TNF-α转换酶基因RNA水平显著高于正常对照组(P<0.01).结论(1)肥胖患者中可能存在TNF-α限制脂肪堆积作用减弱,从而产生肥胖;(2)TNF-α转换酶可能通过TNF-α在肥胖和胰岛素抵抗发病机制中起作用.