介绍一种检测慢性粒细胞白血病外周血白细胞BCR/ABL融合蛋白的方法

目的建立一种检测外周血白细胞费城染色体编码融合基因产物(BCR/ABL)融合蛋白(P210)的方法,为临床提供特异、灵敏、快速诊断慢性粒细胞白血病(CML)的新方法。方法采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分离BCR/ABL融合蛋白,用包括蛋白电泳转膜与单克隆抗体结合显色等步骤,将分离的物质转移至硝酸纤维素薄膜(NC膜)上与特异的单克隆抗体结合形成抗原抗体复合物,用增强的免疫化学发光法(ECL)对区带进行处理。结果对68例符合法美英协会(FBA)分型的CML患者外周血白细胞的BCR/ABL融合基因表达产物进行检测,结果全部为阳性,而20例正常献血者全部阴性。结论外周血取材方便,患者无痛苦,该检测方法对诊断CML是一种特异性强、灵敏度高的方法。     

荧光原位杂交技术检测BCR/ABL融合基因

目的 建立荧光原位杂交（FISH）技术，直接原位检测间期细胞中BCR／ABL融合基因，辅助临床诊断和治疗慢性粒细胞性白血病（CML）。方法 应用FISH技术检测15例CML患者骨髓培养细胞BCR／ABL融合基因，其中5例CML患者同时取骨髓直接涂片检测，5例CML患者同时取外周血浓缩单个核细胞直接涂片检测。以5例非CML患者骨髓培养细胞为阴性对照。结果 15例患者骨髓标本成功培养10例，染色体分析检测到Ph1染色体8例。15例患者骨髓培养细胞FISH检测BCR／ABL融合基因阳性14例。5例CML患者同时做骨髓直接涂片FISH检测，结果阳性4例。5例CML患者同时做血标本浓缩单个核细胞FISH检测阳性2例。5例非CML患者FISH结果均阴性。结论 FISH技术能直接原位检测间期细胞中BCR／ABL融合基因，且快速、可靠、成功率高，是诊断和监测CML的一项有效新技术。     

EG5和BCR/ABL在慢性粒细胞白血病中表达及其临床意义

目的观察驱动蛋白EG5 mRNA在正常人外周血和骨髓中的表达情况,探讨其在各期慢性粒细胞白血病（CML）中的表达及与BCR/ABL mRNA表达的相关性,评估EG5 mRNA在CML诊断和预后分析中的应用价值。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测EG5 mRNA和筑巢式逆转录聚合酶链反应（Nested-RT-PCR）检测BCR/ABL mR-NA,分别对8例正常人外周血及骨髓样本和62例CML患者的外周血样本进行检测。结果正常外周血标本中未检测到EG5的表达,正常骨髓标本中可见EG5的低丰度表达;EG5辅助诊断CML的敏感度和特异性分别为89.6%（26/29）和84.8%（28/33）;BCR/ABL融合基因诊断CML的敏感度和特异性分别为96.5%（28/29）和90.9%（30/33）;CML中EG5和BCR/ABL表达的差异无统计学意义,且两者之间呈高度正相关。结论EG5和BCR/ABL在慢性粒细胞白血病疾病进展中的表达情况基本一致,EG5和BCR/ABL的联合检测及动态观察,可作为CML临床辅助诊断、疗效和预后判断的指标之一。     

慢性粒细胞白血病的基因治疗策略

BCR／ABL融合基因及其表达产物p210^BCR/ABL对慢性粒细胞白血病（CML）的发生具有决定性作用。近年来对CML分子发病机制的深入研究，为治疗CML提供了多种思路，涌现出了包括生物治疗在内的许多新疗法，有些已进入临床试验或临床治疗。本文概述了针对CML BCR／ABL信号转导途径的各种基因治疗策略，大致可分为以下四类：抑制癌基因表达，抑制BCR／ABL信号通路下游重要分子基因表达，阻抑BCR／ABL蛋白产物的功能，免疫治疗。     

慢性粒细胞白血病患者外周血BCR/ABL融合基因表达水平及意义

目的观察慢性粒细胞白血病(CML)初发和急变患者外周血BCR/ABL基因的表达变化。方法建立实时定量RT-PCR同时检测b2a2和b3a2两种融合基因亚型,检测25例CML初发和25例CML急变患者的外周血样本中BCR/ABL融合基因的表达。结果BCR/ABL及GAPDH标准曲线的相关系数均为1.0,灵敏度为2pgRNA,根据熔解温度的不同可以区分b2a2和b3a2两种融合基因亚型。CML急变患者外周血BCR/ABL融合基因的表达水平是初发患者的4.72倍。结论本法简便、敏感、特异,可以相对定量BCR/ABL融合基因表达水平,有助于反映白血病细胞负荷,评价疗效及判断预后。     

实时定量荧光PCR检测白血病融合基因

本研究旨在建立实时定量荧光PCR的方法并检测CML、ALL、APL患者中融合基因的拷贝数,观察患者体内融合基因转录水平的变化。构建质粒标准品,制作标准曲线。检测49例患者的骨髓及外周血标本130份,对个别患者连续监测融合基因转录表达水平,结果表明：在82．4％（28／34）的CML患者中检测到BCR—ABL^p210阳性（BCR—ABLP210／ABL比值为0．01～3．19）,其中在1例CML急淋变患者检测到BCR—ABL^p210。和BCR—ABL^p190双阳性;在66．7％（4／6）的ALL患者中检测到BCR—ABL阳性,其中2例BCR—ABL^p210阳性,2例BCR—ABL^p190阳性;在77．8％（7／9）的APL患者中检测到PML—RARa融合基因阳性（PML—RARa／ABL比值为0．0014～3．199）,其中3例为长型,3例为短型,1例为变异型,检测结果为阴性的患者处于缓解期;连续监测患者融合基因转录表达水平与临床缓解和复发的变化情况相吻合。结论：实时定量荧光PCR技术成熟、操作简便,检测白血病融合基因结果准确稳定,对于临床明确诊断、具体分型、动态观测肿瘤负荷、选择治疗方案、评估治疗效果和预后都有较大价值,值得推广应用。     

一步法RT-PCR检测慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因

目的：建立一步法RT-PCR检测CML患者BCR—ABL融合基因的实验方法。方法：Trizol试剂提取细胞RNA,用特异引物一步法RT—PCR检测BCR—ABL融合基因．并作灵敏度试验。结果：本方法的灵敏度可达到10pg水平。对25例CML患者检测BCR-ABL融合基因,阳性率为100％．并可检测出BCR—ABL融合基因各种融合方式。结论：一步法RT—PCR检测BCR-ABL融合基因有很好的灵敏度和特异性,操作简便、快速,特别适用于临床检测。     

慢性粒细胞白血病错配修复基因的研究

目的 探讨慢性粒细胞白血病（CML）错配修复（MMR）基因的表达水平及调控机制。方法 用半定量RT-PCR方法检测62例CML患者及K562细胞的5个MMR基因（hMSH2、hMSH3、hMSH6、hMLH1、hPMS2）mRNA的表达；用RT-PCR方法动态检测26例进行异基因外周血造血干细胞移植（allo-PBSCT）及4例使用伊马替尼治疗的CML患者ber-abl及MMR mRNA的表达水平；用伊马替尼体外作用于CML患者的单个核细胞（MNC）及K562细胞后，用Western blot方法检测BCR—ABL融合蛋白的酪氨酸磷酸化水平，RT-PCR方法检测MMR mRNA表达水平。结果 与正常人比较，CML患者及K562细胞的hMSH2、hMSH3、hMLH1 mRNA的表达明显降低（P〈0．05）；26例行allo—PBSCT及4例使用伊马替尼治疗的CML患者，其hMSH2、hMSH3、hMLH1 mRNA的表达随着bcr—abl mRNA的表达降低而升高；伊马替尼体外作用于CML患者MNC及K562细胞后，其hMSH2、hMSH3、hMLH1 mRNA的表达随着BCR—ABL融合蛋白酪氨酸磷酸化水平的降低而升高。结论 CML患者、K562细胞hMSH2、hMSH3、hMLH1 mRNA比正常人降低，bcr—abl融合基因抑制hMSH2、hMSH3、hMLH1 mRNA的表达。     

Lyn激酶在伊马替尼耐药的慢性髓系白血病中的作用

本研究探讨Lyn激酶在伊马替尼耐药的慢性髓系性白血病（CML）中的作用。76例CML患者分为初治组、伊马替尼耐药组和伊马替尼治疗有效组,用Western blot方法检测CML患者骨髓单个核细胞中Lyn蛋白的表达水平,比较各组患者Lyn的表达差异,分析Lyn与I临床特征、BCR／ABL融合基因和染色体的关系。结果表明,76例CML均表达Lyn;伊马替尼耐药组Lyn表达明显高于正常对照组、初治组及伊马替尼治疗有效组（P〈0．05）,初治组和伊马替尼治疗有效组的Lyn表达水平与正常对照组无明显差别（P〉0．05）。Lyn表达水平与性别、年龄、平均血红蛋白水平、平均血小板计数、外周血幼稚细胞比例和脾脏大小无明显相关（P〉0．05）,但与初诊时外周血白细胞计数增高相关（P〈0．05）。Lyn表达与BCR／ABL融合基因定量无明显相关性（P〉0．05）;10例伊马替尼耐药的CML中,1例患者存在t（6;22）和t（2;9）改变,与Ph染色体共存,其余9例患者仅存在Ph染色体改变。结论：CML患者和正常人骨髓细胞均表达Lyn,Lyn在伊马替尼耐药的CML中表达明显增高,Lyn高表达与CML患者初诊时白细胞计数明显增高相关。     

荧光原位杂交技术检测BCR/ABL融合基因

目的建立荧光原位杂交(FISH)技术,直接原位检测间期细胞中BCR/ABL融合基因,辅助临床诊断和治疗慢性粒细胞性白血病(CML)。方法应用FISH技术检测15例CML患者骨髓培养细胞BCR/ABL融合基因,其中5例CML患者同时取骨髓直接涂片检测,5例CML患者同时取外周血浓缩单个核细胞直接涂片检测。以5例非CML患者骨髓培养细胞为阴性对照。结果15例患者骨髓标本成功培养10例,染色体分析检测到Ph1染色体8例。15例患者骨髓培养细胞FISH检测BCR/ABL融合基因阳性14例。5例CML患者同时做骨髓直接涂片FISH检测,结果阳性4例。5例CML患者同时做血标本浓缩单个核细胞FISH检测阳性2例。5例非CML患者FISH结果均阴性。结论FISH技术能直接原位检测间期细胞中BCR/ABL融合基因,且快速、可靠、成功率高,是诊断和监测CML的一项有效新技术。     

荧光原位杂交技术检测BCR/ABL融合基因的临床应用

本研究探讨应用荧光原位杂交技术( FISH)检测BCR/ABL融合基因在临床中的应用价值.对初诊考虑为慢性骨髓增殖性疾病或骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病的患者、急性淋巴细胞白血病患者及异基因造血干细胞移植后的慢性髓系白血病(CML)患者,行骨髓细胞学检查并用FISH法检测BCR/ABL融合基因.结果表明:①46例在初诊时考虑为慢性骨髓增殖性疾病或骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病的患者中,有22例患者诊断为CML,应用FISH法检测BCR/ABL融合基因均为阳性(100％),骨髓细胞学检查显示CML者占86.4％ (19/22);另24例患者诊断为非CML的慢性骨髓增殖性疾病及骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病,FISH法检测BCR/ABL融合基因均为阴性(100％),而骨髓细胞学检查有3例支持CML诊断、1例支持MDS诊断;②7例急性淋巴细胞白血病患者,有3例FISH法检测BCR/ABL融合基因为阳性;③2例异基因造血干细胞移植后的CML患者,应用HSH法检测BCR/ ABL融合基因可检测到阳性细胞(分别为6.5％及1.2％).结论:FISH法检测BCR/ABL融合基因敏感、可靠,对慢性骨髓增殖性疾病及骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病的诊断及鉴别诊断有重要价值;可明确Ph+急性淋巴细胞白血病患者的诊断;在CML患者行异基因造血干细胞移植后监测微小残留病灶方面也有重要意义.     

伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病患者ABL激酶区点突变检测的意义

目的研究发生伊马替尼（IM）耐药的慢性粒细胞白血病（CML）患者BCR／ABL融合基因ABL激酶区发生点突变的情况。方法采集11例（血液学耐药7例，遗传学耐药4例）共计17份发生IM耐药的CML患者IM治疗前后的骨髓，采用半筑巢式扩增长片段逆转录-PCR（RT-PCR）的方法，应用分别位于BCR基因和ABL基因的引物进行2次PCR，扩增BCR／ABL基因ABL激酶区周围863bp碱基，进行纯化、测序序列同源性分析。结果本研究共发现3种突变，即G250E、E255K和1315I。其中，血液学耐药发生突变的频率为4／7，95％可信区间为18％-90％；而遗传学耐药发生突变的频率为1／4，95％可信区间为1％-81％。所有患者发生耐药前均未发生点突变。结论发生IM耐药的CML患者BCR／ABL基因ABL激酶区周围存在高频率的点突变。通过对影响与IM结合的突变情况进行早期检测，有利于在发生耐药前进行治疗干预，为患者提供更有效的治疗选择。     

Bcr/Abl融合基因阳性、Flk1+CD34-慢性粒细胞白血病细胞体内生物学特性的研究

目的体内研究慢性粒细胞白血病（CML）患者骨髓中BCR／ABL＋、Flk1＋CD34-细胞的白血病干细胞特性。方法取CML患者骨髓，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，常规接种培养，免疫磁珠分选CD45-、GlyA-及CD34-的贴壁细胞，流式细胞术鉴定其免疫表型，将其输入经亚致死量照射的NOD／SCID小鼠体内，检测人源细胞的植入及分化情况。结果植入的CML患者骨髓源BCR／ABL＋、Flk1＋CD34-细胞在受体小鼠体内分化为白血病细胞，受体小鼠骨髓细胞中存在Bcr／Ab1融合基因阳性细胞。结论Ber／Ab1融合基因阳性Flk1＋CD34-细胞具有白血病干细胞特性。     

慢性粒细胞白血病的基因治疗策略

BCR/ABL融合基因及其表达产物p210~(BCR/ABL)对慢性粒细胞白血病(CML)的发生具有决定性作用。近年来对CML分子发病机制的深入研究,为治疗CML提供了多种思路,涌现出了包括生物治疗在内的许多新疗法,有些已进入临床试验或临床治疗。本文概述了针对CML BCR/ABL信号转导途径的各种基因治疗策略,大致可分为以下四类:抑制癌基因表达,抑制BCR/ABL信号通路下游重要分子基因表达,阻抑BCR/ABL蛋白产物的功能,免疫治疗。     

BCR/ABL探针在骨髓增殖性疾病中的临床运用

本研究通过回顾分析荧光原位杂交(FISH)检测BCR/ABL融合基因结果,探讨其在慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)和Ph+急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)的鉴别诊断及治疗后微小残留病(MRD)动态监测中的运用价值。初诊和治疗后病例分别使用BCR/ABL(ES)和BCR/ABL(DF)探针检测BCR/ABL融合基因。结果表明:初诊CMPD 49例,形态学符合CML骨髓象28例,确诊CML 23例,形态符合率23/28(82.1%),BCR/ABL阳性23/23,敏感度、特异度均为100%。确诊病例BCR/ABL阳性细胞率为81.3%±17.7%;allo-HSCT 13例,9例长期无病生存,4例复发,经供者淋巴细胞输注(DLI)、伊马替尼或allo-HSCT治疗后多次监测BCR/ABL阴性;伊马替尼治疗16例,其中11例于1年后多次监测BCR/ABL阴性,5例分别于6、7、10年后监测BCR/ABL阳性,其中1例经allo-HSCT成功,BCR/ABL转阴。结论:FISH技术是一项敏感、特异的诊断技术,针对初诊和治疗后病例分别运用两种不同的探针检测BCR/ABL融合基因,有助于准确、快速鉴别诊断CML、Ph+ALL,动态监测酪氨酸激酶抑制剂治疗和allo-HSCT后MRD。     

我如何治疗初发慢性髓性白血病慢性期北大核心CSCD

慢性髓性白血病（CML）年发病率在欧美国家为0．4-1．6／10万,在中国为0．36／10万（约5470例／年）,85％以上的患者初诊时处于慢性期（CP）。2000年针对CML致病基因产物BCR—ABL融合蛋白的第一代酪氯酸激酶抑制剂（TKI）甲磺酸伊马替尼问世后,CML．CP患者的疾病进展率大为减低,生存期明显延长,生活质量显著改善,进展期[加速期（AP）和急变期（BP）]患者的疾病控制率也得以提高。     

As2O3对慢性粒细胞白血病原代细胞BCR-ABL蛋白水平及信号转导的影响

目的：阐述As2O3对慢性粒细胞白血病（CML）原代细胞BCR－ABL及信号转导的影响。方法：采用免疫沉淀、蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK)活性测定和Western印迹、实时定量PCR等方法。结果：1．0μmol/L和2．0μmol/L As2O3作用48h,CML患者骨髓单个核细胞BCR／ABL蛋白含量下调,0．5μmol/L时无明显改变。在0．5μmol/L As2O3作用下STAT1蛋白下调,1．5μmol/L和2．0μmol/L时下调更明显。P27蛋白无变化。As2O3作用60h,可使CML患者骨髓单个核细胞BCR－ABL蛋白PTK活性轻度下降。As2O3对bcr-abl融合基因的mRNA表达无明显影响。结论：As2O3下调BCR－ABL蛋白STAT1蛋白水平,减弱BCR－ABL信号的下传。As2O3下调PTK活性。     

RHBDD1基因在慢性髓系白血病患者骨髓细胞中的表达及临床意义

本研究旨在检测RHBDD1（Rhomboid domain containing 1）基因在慢性髓系白血病（CML）患者骨髓细胞中的表达水平并初步探讨其临床意义。采用实时定量PCR的方法检测RHBDD1在正常人和CML患者骨髓单个核细胞中的相对表达水平。结果表明,CML患者RHBDD1的表达水平明显高于正常人;BCR／ABL p210表达阴性的患者RHBDD1的表达水平显著高于BCR／ABLp210阳性的患者;≥50岁的患者RHBDD1表达水平低于〈50岁的患者;RHBDD1的表达水平与患者的性别无明显相关性。结论：RHBDD1基因可能参与了CML的发生与发展,尤其在BCR／ABL p210阴性患者的发病中可能发挥重要作用。     

慢性粒细胞白血病的细胞凋亡分子机制及临床治疗研究进展

慢性粒细胞白血病（CML）以染色体移位形成BCR／ABL融合基因为标志，编码的融合蛋白Pz，oBCR／ABL具有较强的蛋白酪氨酸激酶活性，可激活Ras—Raf-MAPK、STAT—Bcl—XL、P13K—AKT、NFκB等多条信号转导途径，直接或间接作用于细胞凋亡的开关——线粒体，使BCR／ABL阳性细胞耐受凋亡，导致肿瘤疾病发生。因此诱导凋亡是目前临床治疗慢性粒细胞白血病的重要方法之一，本文就慢性粒细胞白血病的细胞凋亡分子机制，以及在此基础上临床新近发展的一些治疗策略作一简述。     

慢性粒细胞白血病：从分子机制到靶向治疗

慢性粒细胞白血病（CML）是目前白血病研究最多的分子模型。BCR／ABL嵌合基因则是CML的分子病理学基础,其研究的深入为CML的靶向治疗提供了新的干预目标。本文就BCR、ABL结构和功能,BCR／ABL的分子生物学特征,CML发病的分子机制及靶向治疗等进行综述。