报告基因系统的研究进展

综述氯霉素转乙酰酶（CAT），β-半乳糖苷酶（β-gal),β-葡萄糖苷酸酶（p-GUS)，分泌型碱性磷酸酶（SEAP），荧光素酶（luc)，绿荧光蛋白（GFP）等报告基因系统研究与应用进展；简要介绍主要报告基因分析系统商品化试剂盒的研制及其应用范围和优缺点。     

新型内源性磁共振报告基因——小鼠铁蛋白基因的构建

目的 应用pcDNA3.1(-)质粒载体系统构建携带小鼠铁蛋白重链全基因质粒,并探讨铁蛋白基因作为一种新型内源性磁共振分子影像报告基因的可行性和优越性.方法 从来源于小鼠肌肉的mRNA,应用一对含有限制性内切酶Not Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的引物进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增出铁蛋白重链全基因(Fth)片断.通过限制性内切酶Not Ⅰ和BamH Ⅰ酶切和T4连接酶的作用,将铁蛋白重链全基因插入到载体pcDNA3.1(-)中,构建铁蛋白重链全基因质粒pcDNA3.1(-)-Fth.结果 质粒pcDNA3.1(-)-Fth成功构建,符合酶切和测序鉴定结果.结论 初步构建的小鼠铁蛋白重链质粒,为进一步探讨铁蛋白基因作为一种新型内源性磁共振分子影像报告基因在细胞示综和基因显像中的应用奠定了基础.     

生物发光细菌lux基因系统的研究进展

发光细菌lux基因系统作为报告基因因其快速、无伤害、灵敏和简便而在分子生物学、临床微生物、以及生化检验中具有潜在重大应用价值，本文就lux基因系统的组成、构建以及特性进行综述，并就其研究发展方面展开讨论。     

生物发光细菌lux基因系统的研究进展

发光细菌ｌｕｘ基因系统作为报告基因因其快速，无伤害，灵敏和简便而在分子生物学，临床微生物、以及生化检验中具有潜在重大应用价值，本文就ｌｕｘ基因系统的组成，构建以及特性进行综述，并就其研究发展方面展开讨论。     

通过生物信息学方法筛选和初步鉴定小鼠Trim30α的人同源基因

目的 通过生物信息学方法寻找小鼠Trim30α的人同源基因,观察候选人Trim蛋白对TAB2诱导的NFκB荧光素酶报告基因活化的影响. 方法 用MEGA4.0软件对具有RBCC和SPRY结构域的Trim分子进行进化树分析,用DNAMAN6.0软件对候选人Trim与小鼠Trim30α进行氨基酸序列比对,比较Trim30α相毗邻基因在小鼠和人染色体上的排列分布规律,以筛选出小鼠Trim30α的人同源基因,并将其构建成真核表达载体,用双萤光素酶报告基因系统检测其对TAB2诱导的NFκB报告基因活化的影响. 结果 生物信息学分析显示,Trim30α与人Trim5α、Trim6、Trim22、Trim34α来自进化树的同一分支节点；Tim22、Trim5α与Trim30α的氨基酸序列同源性分别为42.51％、45.47％; Trim22可以抑制TAB2诱导的NFκB报告基因的活化. 结论 Trim22对TAB2诱导的NFκB报告基因活化有负向调节作用,可能与Trim30α具有相类似的生物学功能.     

牛珀至宝微丸对蛋白激酶C调控内毒素诱导iNOS基因表达的影响

目的 :探讨牛珀至宝微丸对蛋白激酶 C(PKC)调控 (L PS)诱导单核巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(i NOS)基因表达的影响。方法 :用 PKC活性测定法观察 L PS对 PKC的激活作用 ,用 Griess还原法测定一氧化氮 (NO)的生成 ,用基因重组技术构建 i NOS荧光素酶报告基因载体 ,用基因转染及报告基因检测等方法研究牛珀至宝微丸调控 L PS刺激 RAW2 6 4 .7细胞对 i NOS启动子活性的诱导作用及其与 PKC的关系。结果 :牛珀至宝微丸可负调节 L PS刺激 RAW2 6 4 .7细胞引起的 PKC磷酸化激活和膜移位 ,并可延长 PKC抑制剂 H 7下调 NO作用时间。荧光素酶报告基因实验结果显示 ,牛珀至宝微丸可抑制 L PS刺激诱导的 i NOS启动子的转录活性 ,并可增强 H 7和钙离子通道阻滞剂维拉帕米的作用。结论 :牛珀至宝微丸抑制 L PS刺激 RAW2 6 4 .7细胞所致的 NO生成增加 ,其机制之一是量效与时间两方面抑制 PKC激活和细胞内钙增加 ,从而影响 i NOS启动子的转录活性     

Blimp1基因突变影响其编码蛋白转录抑制功能的体外研究

目的:探讨Blimp1基因突变在弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)发病中的作用。方法:应用基因测序方法检测1例DLBCL患者Blimp1基因的突变情况;用PCR扩增其Blimp1全长编码基因,并通过定点突变获得野生型Blimp1的全长编码基因。分别将野生型、突变型Blimp1的全长编码基因亚克隆至含有Flag标签的Flag-CMV4真核表达载体中,将重组质粒分别命名为Flag-Blimp1-wt和Flag-Blimp1-mut;采用PCR扩增获得人CIITA启动子,并将扩增片段插入PGL3-Basic荧光报告基因载体中,所有重组质粒均通过酶切鉴定并测序验证序列正确;将Flag-Blimp1-wt/mut分别与PGL3-CIITA-promoter共转染293T细胞,用荧光素酶报告基因系统检测报告基因载体的活性及Blimp1基因对其表达的调控,采用蛋白印迹法检测融合蛋白Flag-Blimp1-wt与Flag-Blimp1-mut的蛋白表达差异。结果:成功构建野生型、突变型Flag-Blimp1融合蛋白表达载体及PGL3-CIITA-promoter报告基因载体;经荧光素酶报告基因检测系统证实,构建的报告基因载体具有启动子活性,野生型Blimp1蛋白对其表达具有抑制作用,且该抑制作用与Blimp1的转染剂量呈正相关,而突变型Blimp1对其抑制功能明显减弱;蛋白印迹检测结果显示,突变型Blimp1蛋白明显低于野生型。结论:该例患者中Blimp1的突变影响了其转录抑制功能,可能是由基因突变导致Blimp1蛋白表达量的减少所引起。     

慢病毒表达双报告基因载体系统的构建及病毒制备

本研究旨在构建萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,FLUC)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)双基因表达的慢病毒载体,并转染特定细胞系(HeLa),观察双基因的表达。采用PCR技术分别扩增FLUC和RFP报告基因,再将报告基因连接到慢病毒表达载体pLenti-Bi-cistronic中,获得具有双报告基因的慢病毒重组质粒pLenti-FLUC-RFP。然后,用脂质体将该慢病毒重组质粒转染293T细胞,收集纯化慢病毒颗粒。最后,测定病毒滴度,并用所获慢病毒感染HeLa细胞,采用荧光显微镜和荧光素酶报告基因检测试剂盒检测RFP和FLUC的表达。结果表明,酶切和测序证明RFP和FLUC基因成功连入目的载体,所构建的pLenti-FLUC-RFP慢病毒重组质粒序列符合预期。经纯化获得的慢病毒滴度为1×107TU/ml。将pLenti-FLUC-RFP转染HeLa细胞系后,在荧光显微镜下可见大量细胞表达RFP,荧光发光检测仪也检测到转染细胞具有较高的荧光素酶活性。结论:本研究成功构建了具有双报告基因的慢病毒重组质粒pLenti-Ⅲ-FLUC-RFP,经纯化获得了高滴度的慢病毒颗粒,该病毒颗粒具有很好的感染活性,为研究间充质干细胞在体内的动态分布奠定了基础。     

趋磁细菌磁小体及其相关MRI报告基因分子影像学研究

趋磁细菌受基因调控形成纳米Fe₃O₄颗粒——磁小体,自带天然脂性包膜,其独特结构与特性受到分子影像学研究的重视,特别是纯化磁小体在磁性粒子成像中的应用和磁小体相关调控基因在MRI报告基因的分子影像学中的应用。相关研究逐年增多,但有关MRI报告基因的研究尚处于初级阶段。本文对趋磁细菌磁小体及其相关基因在MRI报告基因的分子影像学研究进行综述。     

报告基因在超声成像中的应用研究进展

报告基因是超声成像基础研究中的一种重要工具,具有便捷、可靠、灵敏度高等优点,可对多种不同的生物学和分子遗传学过程进行显像。本文对多种报告基因在超声成像中的基础应用进展进行了综述,为该技术的进一步拓展生物医学应用提供新方法和思路。     

超声微泡促进肿瘤细胞报告基因转染

目的探讨超声破坏微泡造影剂后对β-半乳糖苷酶报告基因在人肝癌细胞(QGY)中转染的影响。方法将培养QGY细胞转于24孔培养板后,分为5组,分别为单纯加入质粒组(D);质粒 微泡组(D M);质粒 超声组(D U);质粒 超声 微泡组(D U M);脂质体 质粒组(L D);进行β-半乳糖苷酶质粒DNA的转染。2d后,进行β-半乳糖苷酶染色,测定各组细胞转染率。结果单纯质粒组细胞转染率为4．92％;质粒 微泡组转染率为6．742％;质粒 超声组转染率为29．73％;质粒 超声 微泡组转染率为50．88％;脂质体 质粒组转染率为12．15％;结论超声破坏微泡造影剂可促进报告基因β-半乳糖苷酶质粒在QGY细胞的转染,为肿瘤基因治疗提供一种新型基因转移系统。     

稳定表达报告基因脂肪间充质干细胞的培养与分子影像鉴定

背景:研究显示分子影像技术可以在活体细胞和分子水平对干细胞进行定性和定量研究,对干细胞长程监测具有独特优势。目的:构建稳定表达报告基因的脂肪间充质干细胞,并运用报告基因成像等方法实现其体外和移植后的评价与鉴定。方法:繁殖与筛选携带β-actin-luc报告基因小鼠后,采用改良胶原酶消化法分离培养其脂肪间充质干细胞,取第3代细胞行表面标志鉴定;将脂肪间充质干细胞(1×106)植入BALB/c裸鼠后肢肌肉内,采用萤火虫荧光素酶(fluc)生物发光成像进行体外和体内移植后脂肪间充质干细胞的示踪和定量评价。结果与结论:转基因小鼠稳定携带β-actin-luc报告基因,分离培养出的脂肪间充质干细胞高表达CD90及CD44,而CD45、CD34和CD31呈现低表达,其细胞数与fluc报告基因生物发光信号强度呈显著直线相关(r2=0.96)。细胞活体肌肉移植24h后存活,并显示较强的生物发光信号,在底物荧光素腹腔注射后0～42min内先迅速增强后平缓减弱,21min时最强,达(6.92×106±4.11×105)Photons·s-1·cm-2·sr-1。提示由携带β-actin-luc报告基因小鼠脂肪组织分离的脂肪间充质干细胞高表达间充质干细胞表面标志,可在体外和肌肉组织移植后稳定表达该报告基因并实现细胞的分子影像示踪与定量。     

分子影像学报告基因显像的研究进展

报告基因显像技术是分子影像学中重要的显像技术,其可对多种不同的生物学和分子遗传学过程进行显像,有望更快地应用于临床.本文综述分子影像学中报告基因显像的一般原则、分类、相关影像学技术及潜在的临床应用.     

临床分离碳青霉烯类耐药肠杆菌科分布及其酶的表型分析

〖HT5"H〗摘要 目的 了解医院碳青霉烯类耐药肠杆菌科(CRE)临床分布及其酶的表型。方法 采用回顾性调查方法，对某医院临床分离CRE菌株分布及其碳青霉烯类药物的耐药表型进行分析和评估。结果 从住院患者送检标本中共分离到CRE 98株，其中肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和阴沟肠杆菌分居前3位，构成比依次为72.45%、10.20%和7.14%。mCIM试验阳性的CRE菌株90株，其中产金属β 内酰胺酶菌株26株，产丝氨酸碳青霉烯酶菌株64株。肺炎克雷伯菌中，以产丝氨酸酶表型为主(95.38%)，大肠埃希菌和阴沟肠杆菌均以产金属β 内酰胺酶为主，分别占88.89%和100.00%。结论 该医院临床分离CRE(头孢他啶-阿维巴坦)菌株主要为肺炎克雷伯菌|碳青霉烯酶表型以丝氨酸碳青霉烯酶为主|不同菌种的酶类型差异明显。     

血管内皮生长因子质粒载体的构建

[目的]构建携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒.[方法]采用PCR 技术,以pIRES2-VEGF质粒为模板扩增VEGF基因全长,采用PCR产物的粘端克隆法,将VEGF定向克隆入EGFP的多克隆位点,构建pIRES2-EGFP-VEGF重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定.[结果]PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF正确连接至EGFP的多克隆位点.[结论]成功构建了携带人VEGF及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,为进一步研究VEGF基因治疗缺血性心血管疾病奠定了实验基础.     

人β—神经生长因子基因重组真核表达载体的构建

目的　构建 β 神经生长因子 (β NGF)基因重组真核表达载体 ,为 β NGF基因治疗和临床实验诊断研究打下良好的基础。方法　将质粒PGEM β NGF进行酶切获得 β NGF基因片段 ,用T4连接酶将其插入真核表达载体PcDNA3;以T7、P2为引物进行PCR ,论证插入片段的方向 ;经测序和酶切对插入片段进行分析和进一步鉴定。结果　PCR产物琼脂糖电泳结果显示 :在预期位置有阳性条带 ;序列分析和酶切结果证实插入片段序列正确。结论　β NGF基因重组真核表达载体PcDNA3 β NGF构建成功 ,为进一步开展 β NGF基因治疗神经系统疾病和临床实验诊断奠定了基础。     

端粒酶hTERT亚单位启动子靶向性慢病毒对肿瘤活体实时显像的实验研究

目的构建一种含优化型人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的慢病毒,结合小动物活体光学成像系统,研究该启动子对端粒酶阳性肿瘤的特异性活体成像作用。方法将文献报道的优化型hTERT启动子克隆到pGL-Basic质粒,对优化型hTERT启动子进行功能检测。确定其驱动活性之后,构建一种含该启动子和GFP的第3代慢病毒表达系统,以含CMV启动子的慢病毒作为对照。采用小动物荧光成像系统体内外研究优化型hTERT启动子在肿瘤实时诊断中的作用。结果启动子功能检测发现hTERT启动子具有严格的端粒酶阳性肿瘤细胞特异性,并且具有很高的报告基因报答水平。第3代慢病毒包装系统获得了高滴度的病毒颗粒并且能高效整合报告基因之宿主细胞。体外研究表明,含有优化型hTERT启动子的慢病毒体外感染细胞后,能够在端粒酶阳性肿瘤细胞内特异表达GFP,并且能维持长达40d的报告基因表达时间。体内实验发现,感染含优化型hTERT启动子的慢病毒之后24h,端粒酶阳性活体肿瘤能够被特异性的实时观察到,并且肿瘤内的GFP信号在存活裸鼠体内维持30d,随肿瘤增大而增强。结论优化后hTERT启动子对报告基因的调控具有严格的端粒酶特异性,第3代慢病毒系统可将该启动子和报告基因整合至细胞基因组,并实现在端粒酶阳性肿瘤细胞内的特异表达。结合小动物活体光学成像系统,荷瘤裸鼠内的端粒酶阳性肿瘤能够被无创的、实时的、特异性的成像,为肿瘤的特异性早期诊断提供新的实验理论基础。     

三维试验法检测鲍曼不动杆菌产超广谱β内酰胺酶和AmpC酶

为了解我院鲍曼不动杆菌对β 内酰胺类抗生素耐药原因,我们采用三维试验法对临床分离的菌株进行超广谱β 内酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶检测。一、材料和方法1.菌株来源及鉴定　 60株菌株均分离自我院 2000年 6月~2002年 12月住院患者临床标本,分别为痰液 33份、创伤伤口分泌物 13份、烧伤创面分泌物 10份、气管切开口分泌物 2份、中段尿和血液各 1份,采用法国生物梅里埃公司API20NE鉴定菌种。标准菌株为大肠埃希菌(ATCC25922)和铜绿假单胞菌 (ATCC27853);肺炎克雷伯菌(ATCC700603) (产SHV 18型ESBLs)和阴沟肠杆菌(029M) (去阻…     

利用果蝇细胞研究基因表达转录后调控的双报告基因系统的建立

目的 构建能够在果蝇S2＊细胞中检测转录后调控元件对基因表达调控影响的双报告基因系统.方法 首先利用pAc5.1/V5-His c,pGL3-basic和pRL-SV40载体,构建能在果蝇体系中表达萤火虫荧光素酶的报告基因质粒pAc-Fluc,以及用作内参照表达海洋腔肠荧光素酶的质粒pAc-Rluc.将TNF-α基因mRNA的3＇UTR连接至pAc-Fluc的Luc编码区下游构建pAc-Fluc-TNF-α质粒,并与pAc-Rluc共转至果蝇S2＊细胞,检测两种荧光素酶的相对活性.结果 成功构建了能够在果蝇S2＊细胞中组成型表达的双报告基因系统;在TNF-α mRNA 3＇UTR控制下表达的荧光素酶活性比对照有显著下降.结论 可以利用该双报告基因系统在果蝇细胞中研究转录后调控元件对基因的表达调控.     

经日立-罗氏检测系统量值传递后的新鲜混合血清作临时酶校准品的可行性

目的分析经日立-罗氏检测系统(A系统)量值传递后的新鲜混合血清作临时酶校准品的可行性。方法先用日立-罗氏检测系统将c.f.a.s的酶的量值传递给新鲜混合血清作临时酶校准品,然后用A系统、Roche Modular P分析仪与科华-东菱试剂(B系统)、Dade Dimension RxL分析仪与配套试剂(C系统)、Dade Dimension RxL分析仪与科华-东菱试剂(D系统)、Beckman CX9分析仪与配套试剂(E系统)、Hitachi 7170A分析仪与Randox试剂(F系统)、Olympus 640分析仪与北京中生试剂(G系统)测定50份新鲜血清和临时酶校准品的ALT,AST,CK,LDH,ALP,γ-GT活性,最后用临时酶校准品标示值与测定值之比作为校正因子,校正50份新鲜血清的测定结果,并进行校正前后的结果比较和临时酶校准品互通性分析。结果校正前各检测系统测定结果间有较大的差异(CV4.99%~13.98%),校正后差异变小(CV1.30%~10.34%),其中B,C,E,F系统中ALT,AST,CK,LDH,ALP,γ-GT和D,G系统中ALT,AST,CK与A系统结果偏差明显变小,并且仪器与试剂配套的C,E系统间为各检测系统间最小;但D,G系统中LDH,ALP,γ-GT差异改变不明显。结论采用新鲜混合血清作临时酶校准品有一定的应用价值,但使用前必须进行酶校准品互通性检验,才能保证每项酶的测定结果的准确和可靠。