超声辐照携TIMP-1siRNA微泡对大鼠肝纤维化的影响

目的 探讨携TIMP-1 siRNA的造影剂微泡在超声辐照条件下对肝纤维化大鼠组织学改变的影响。方法二甲基亚硝胺建立肝纤维化模型，6周后分组并静脉质粒注射，2天后观察肝、肾、肺、脑、心肌组织内基因荧光表达；12天后检测肝组织内TIMP-1 mRNA、蛋白表达及胶原纤维变化。结果2天后，超声照射微泡组基因荧光表达明显增强，较其他组织差异显著，P〈0．001；12天后，其TIMP-1 mRNA及蛋白表达、胶原含量均较单质粒组及对照组减低，P〈0．001。结论超声辐照携TIMP-1 siRNA超声微泡有将目的基因定位释放作用，TIMP-1 siRNA转染肝纤维化大鼠可改善肝纤维化结构，为肝纤维化的基因治疗提供了新的思路及方法。     

超声辐照微泡介导肝细胞生长因子基因逆转大鼠肝纤维化

目的 探讨超声辐照载肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)基因的超声微泡造影剂逆转大鼠肝纤维化的可行性. 方法 将成模后的40只Wistar大鼠随机分为5组,即(1)超声+载基因超声微泡造影剂组(HGF+ US/MB),(2)超声+单纯质粒组(HGF+ US),(3)质粒+超声微泡造影剂组(HGF+MB),(4)单纯质粒组(HGF),(5)单纯模型组(MA).经股静脉注入超声微泡造影剂,同时超声基因转染治疗仪辐照肝区,辐照条件为300 kHz,2 W/cm2,辐照10 s,间隔10 s,共20 min.于超声辐照后14 d行磁共振弥散加权成像(diffusion weighted imaging,DWI)检查;然后处死各组大鼠,取肝组织HE染色,观察肝纤维化恢复情况;Western Blot检测HGF蛋白在大鼠肝脏中的表达. 结果 HGF+ US/MB组的表观弥散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)值明显高于其他各组;相反地,指数表观弥散系数(exponential apparent diffusion coefficient,EADC)低于其他各组;病理组织片可见HGF+ US/MB组汇管区纤维结缔组织增生,但肝小叶结构完整,其余各组纤维组织增生程度强于HGF+US/MB组.同时,HGF+US/MB组的HGF蛋白的表达均高于其他各组(P＜0.05). 结论 超声靶向破坏微泡能够介导HGF基因在肝组织内高效表达,并产生抗纤维化效应,为肝纤维化的基因治疗提供一种新的基因转移途径.     

超声造影剂促进野生型p53基因转染抑制大鼠卵巢癌生长的实验研究

目的 探讨超声辐照造影剂微泡促进野生型p53基因转染进而抑制大鼠卵巢癌生长的有效性。方法构建野生型p53真核质粒表达载体pcDNA3．1＋／p53，将40只卵巢癌荷瘤大鼠分成4组。第1组瘤体内注入造影剂微泡和野生型p53质粒混合物，并用超声辐照大鼠腹部瘤区；第2组注入裸质粒后予以超声辐照瘤体；第3组注射超声造影剂和基因混合物后无超声辐照；第4组仅注入裸质粒而无超声辐照。每组进行基因转染每周1次，共进行8次。2月后用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测野生型p53 mRNA在卵巢癌组织中的表达，Western Blot检测野生型p53基因蛋白表达。结果成功构建野生型p53真核质粒表达载体pcDNA3．1＋／p53，埋线法建立卵巢癌动物模型；用超声波辐照微泡促进基因转染后见p53基因转录及表达。第1组p53 mRNA的表达明显增强，高于其他3组，约是第2组的2．65倍，第4组的5．95倍。第2组高于未行超声辐照组，是第4组的2．23倍。第3、4组基因表达差异无统计学意义；Western Blot分析示p53基因蛋白表达的差异模式基本同mRNA，即第1组p53 mRNA的表达增强，高于其他3组，约是第2组的1．75倍，第4组的3．13倍；第2组高于未行超声辐照组，是第4组的1．79倍；第3、4组基因表达差异无统计学意义。结论瘤体内注射造影剂微泡和野生型p53质粒混合物后行超声辐照，可明显增加质粒基因在癌瘤组织中的导人及表达，超声联合造影剂微泡可作为卵巢癌基因治疗中促进基因转移的辅助方法。     

微泡造影剂及超声促进绿色荧光蛋白质粒在人肝癌细胞HepG2内表达的实验研究

目的研究微泡造影剂与超声辐照是否能提高绿色荧光蛋白质粒在人肝癌细胞HepG2中的转染率。方法将培养的HepG2细胞分为四组：第一组为对照组；第二组以脂质体转染；第三组加入微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照；第四组加入脂质体和微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照．将合有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人肝癌细胞HepG2，24小时后以荧光显微镜观察人肝癌细胞HepG2中的绿色荧光蛋白表达情况，并用流式细胞仪测算转染率。结果脂质体转染组与微泡造影剂＋超声辐照组有显著性差异（P〈0．05）。脂质体＋微泡造影剂＋超声辐照组与微泡造影剂＋超声辐照组有显著性差异（P〈0．01）结论微泡造影剂和超声辐照协同脂质体能提高目标基因在肝癌细胞内的转染率。     

超声作用下CTGF-siRNA对大鼠肝纤维化基因治疗的实验研究

目的探讨利用超声微泡造影剂介导携带结缔组织生长因子-小干扰RNA(CTGF-siRNA)真核表达质粒转染大鼠肝细胞的有效性。方法 (1)构建CTGF-siRNA真核表达质粒;(2)将40只实验大鼠随机分为7组:正常组,实验对照组,CTGF-siRNA质粒组,超声联合微泡组,超声联合微泡介导基因低、中、高剂量组;(3)建立肝纤维化模型,基因治疗4周后处死大鼠,超声及病理切片HE染色评价肝纤维化程度,masson染色观察胶原纤维含量,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝组织中CTGF、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达。结果 (1)CTGF-siRNA基因治疗后超声及病理切片显示干预组纤维化程度降低;(2)masson染色显示超声介导微泡基因组胶原纤维含量表达量随着剂量增高而降低(P<0.05);(3)RT-PCR显示超声介导微泡基因组CTGF、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达明显低于其他组,且随着质粒剂量增大而减少(P<0.05)。结论超声微泡作用下CTGF-siRNA基因能特异地作用于靶位点,有效抑制肝纤维化进程,提高对肝纤维化干预的特异度。     

超声联合SonoVue微泡介导NET-1siRNA转染人肝癌细胞

目的探讨超声联合微泡造影剂介导NET-1siRNA在人肝癌细胞中的转染效果。方法将培养的HepG2细胞分为5组:A组为空白对照;B组培养瓶中仅加入NET-1siRNA;C组为加入脂质体及NET-1siRNA;D组为加入造影剂及NET-1siRNA并给予超声辐照;E组为加入脂质体、造影剂、NET-1siRNA,并给予超声辐照。之后以荧光显微镜检测NET-1siRNA转染率,RT-PCR法检测各组细胞NET-1 mRNA的基因表达,Western-Blotting法检测各组细胞NET-1表达情况,MTT检测HepG2细胞生长情况。结果与C组、D组相比,E组NET-1siRNA转染率明显提高(P<0.05);D组和E组细胞内NET-1mRNA及NET-1蛋白的表达抑制率均高于其他各组(P均<0.01),而转染后24～72hHepG2细胞增殖受到明显抑制。结论超声联合微泡造影剂能有效促进NET-1siRNA在肝癌细胞中的表达,并抑制肝癌细胞的增殖。     

超声微泡造影剂介导pEGFP-N1转染小鼠角膜的实验研究

目的 探讨微泡造影剂声诺维联合超声介导绿色荧光蛋白质粒转染小鼠角膜的转染效率和安全性.方法 小鼠眼前房分别注射生理盐水、质粒+生理盐水、质粒+造影剂、脂质体+质粒等,以50 Hz,2 W/cm2的脉冲波超声辐照质粒+生理盐水和质粒+造影剂眼10 min.术后第1 d、第3 d、第7 d、第14 d和第21 d荧光体视镜观察眼表EGFP表达出现情况,冰冻切片荧光显微镜观察阳性细胞的分布,病理切片观察组织有无损伤.结果 造影剂联合超声辐照组小鼠眼表出现绿色荧光蛋白的弥漫性表达,明显高于单纯超声辐照组和脂质体转染组,其余对照各组眼表均未见绿色荧光.第3 d时的病理切片各组均无异常.结论 声诺维联合超声辐照在体能安全、有效地介导基因转染眼组织.     

DMN肝纤维化模型肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原和TIMP-1 mRNA表达及复方861的干预作用

目的研究二甲基亚硝胺(DMN)肝纤维化模型Ⅰ型胶原(CoL-1)、Ⅲ型胶原(CoL-Ⅲ)和基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1) mRNA表达以及复方861的干预作用.材料和方法采用1%DMN 1ml/kg腹腔注射模型组大鼠,复制DMN诱导的大鼠肝纤维化模型,同时复方861灌胃3g/kg,共8周,以RT-PCR法观察肝纤维化模型肝组织CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ及TIMP-1 mRNA表达水平.结果DMN大鼠肝纤维化模型组CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ及TIMP-1 mRNA分别为0.827±0.094、0.953±0.033及0.924±0.110,明显高于正常对照组(P＜0.01);复方861治疗组CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ及TIMP-1 mRNA为0.497±0.057、0.851±0.065和0.648±0.107,明显低于模型对照组(P＜0.01或P＜0.05).结论DMN肝纤维化模型肝组织CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ及TIMP-1 mRNA表达水平增高,复方861能够抑制肝组织CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ及TIMP-1 mRNA的表达,从而发挥其抗肝纤维化的作用.     

高强度聚焦超声联合超声造影剂消融兔肝后细胞凋亡和增殖细胞核抗原表达的研究

目的：探讨高强度聚焦超声（HIFU）联合超声造影剂消融技术对兔肝组织细胞凋亡和增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响。方法：40只新西兰纯种大白兔分为A、B组，A组兔肝接受HIFU辐照前，经耳缘静脉注射生理盐水；B组接受辐照前注射超声造影剂SonoVue。A、B组均在辐照后5min、1d、3d、7d、14d分别处死4只动物，将肝取出体外观察，取靶区及周围组织（距靶区边缘5mm以内），HE染色观察组织病理学改变，原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡，免疫组织化学方法检测细胞PCNA表达。结果：HIFU辐照后3d、7d、14dB组辐照区域边缘纤维包裹带宽度大于A组（P〈0．05）。HIFU辐照后1d、3d、7d、14dB组靶区周围组织（距靶区边缘5mm以内）凋亡细胞数和PCNA阳性细胞指数较A组增高（P〈0．05）。结论：与单纯HIFU相比，HIFU联合超声造影剂促进了消融后坏死区域机化包裹，增加了HIFU靶区周围细胞凋亡，提高了细胞增殖能力，为进一步增强HIFU消融作用提供了实验数据。     

共聚物P85联合超声微泡介导基因转染的体外实验研究

目的 探讨共聚物P85与黏附增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresent protein,EGFP)质粒的微泡造影剂(microbubble,MB)结合后联合一定强度的超声(ultrasound,US)辐照,是否增强人肝癌细胞(HepG2)的质粒转染及表达.方法 以人肝癌细胞(HepG2)为研究对象,质粒DNA是可表达绿色荧光蛋白的pEGFP,添加微泡造影剂或共聚物P85后进行脉冲多普勒超声辐照(频率1 MHz,声强1 W/cm2,工作周期20%,时间20 s).24 h后台盼蓝染色评价细胞存活率,荧光显微镜和流式细胞仪评价细胞的基因转染率.结果 有超声辐照组的pEGFP转染率明显高于无超声辐照组(P＜0.01),有超声辐照组中pEGFP+30%MB+P85+US组转染效率(22.14±3.06)%优于单独使用微泡组(11.34±2.2)%或P85组(9.72±1.21)%(P＜0.01).结论 微泡造影剂与共聚物P85结合同时给予超声辐照可增强基因转染效率,在基因治疗上有待于进一步关注和研究.     

微泡造影剂联合超声辐照介导的绿色荧光蛋白质粒转染小鼠肝癌的实验研究

目的探讨微泡造影剂SonoVue联合超声辐照在介导体内基因转染中的作用。方法建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型，尾静脉注入绿色荧光蛋白质粒（pEGFP），添加或不添加SonoVue，脉冲多普勒超声辐照（1MHz，2W／cm^2）瘤组织。持续时间1、5、10min，7d后流式细胞仪、荧光显微镜评价pEGFP转染率。HE染色行肿瘤病理学检查。结果SonoVue联合超声辐照组pEGFP的转染率显著高于单纯超声辐照组（P〈0．01）；仅SonoVue与单纯pEGFP2组间转染率无显著差异（P〉0．05）；辐照时间5、10min时pEGFP表达明显高于1min（P〈0．05）。5与10min组间pEGFP表达无显著差异（P〉0．05）。HE染色肿瘤组织无坏死灶出现。结论微泡造影剂联合超声辐照可明显提高基因转染率，且对组织无损害。     

超声引导下瘤体内注入超声造影剂和P53基因治疗大鼠肝癌的初步研究

目的　探讨超声引导下将超声造影剂和人野生型 p5 3基因直接注入瘤体内对大鼠肝癌基因表达的影响。方法　采用免疫抑制法建立大鼠原位肝癌模型。 2 4只实验Wistar大鼠随机分成 4组。第 1组 :超声引导下将基因直接注入瘤体内并不用超声照射 ;第 2组 :注入基因后用超声照射瘤体 ;第 3组 :注入造影剂和p5 3基因后不行超声照射 ;第 4组 :用超声照射注入造影剂和基因的瘤体。 48h后用半定量逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)测定肝癌细胞内 p5 3mRNA的表达情况。 结果　超声引导下可准确地将基因注入肝癌内 ,4组肝癌细胞内均有 p5 3mRNA的表达 ,第 4组的表达量最高 ,明显高于其他三组 ( P <0 .0 0 1)。第 2组的基因表达量次之 ,高于另外两组 (P <0 .0 5 )。第 1、3组间在外源基因表达上的差异没有显著性意义 (P >0 .0 5 )。结论　超声引导下瘤体内注射超声造影剂和p5 3基因后用超声照射 ,既可有效地控制肝癌基因治疗的靶向性 ,又能提高外源基因的表达量。     

外周静脉注入超声造影剂介导p53基因治疗大鼠肝癌的实验研究

目的 :研究超声参数和超声造影剂对人野生型 p5 3基因导入大鼠肝癌细胞效果的影响 ,以探讨一种新型、高效的基因导入方法。方法 :采用免疫抑制法建立大鼠原位肝癌模型。将一定体积造影剂和一定数量的 p5 3质粒经股静脉注入后 ,立刻用二次谐波模式的超声经体表照射瘤区 ,并选用不同的时间和机械指数。 2 d后用半定量 RT-PCR法检测大鼠肝癌细胞内 p5 3m RNA的相对表达量。结果 :未导入 p5 3质粒的肝癌细胞内没有 p5 3m RNA的表达 ,随着质粒注入量的增加 ,基因表达量明显增多。造影剂能明显促进基因表达 ,与未注入者相比有显著性差异 (P<0 .0 0 1) ,并与造影剂的体积有关。超声照射可提高基因的转化率 ,并与照射时间和机械指数有关。结论 :经外周静脉注入超声造影剂和基因后用超声照射靶组织 ,是一种新型的基因导入方法 ,既可控制肝癌基因治疗的靶向性 ,又能提高外源基因的表达水平。     

高机械指数超声造影对肿瘤肝转移影响的实验研究

目的 观察高机械指数超声造影对结肠癌肝转移的影响.方法 经大鼠脾注入结肠癌Lovo细胞,制备肝微小转移灶动物模型,分为对照组、微泡+超声辐照组、单纯超声辐照组和单纯微泡组.使用超声造影剂SonoVue(1 ml/kg),经大鼠尾静脉注射后,进行超声间歇辐照2 min(频率1.5 MHz,机械指数1.7),10 d后处死大鼠,观察肝转移肿瘤数目、大小、病理学改变及其超微结构的改变.结果 对照组、单纯辐照组及单纯微泡组之间的转移率差异无统计学意义(P＞0.05);透射电镜可见单纯辐照组及单纯微泡组肿瘤细胞核大,胞浆和胞核比例减小,线粒体较多,未见肿胀,与对照组无明显差异.而微泡+超声辐照组肿瘤的数目及大小明显低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01),肿瘤周围脾组织微血管有大量血栓形成;透射电镜可见肿瘤细胞线粒体明显肿胀,内皮细胞间缝隙连接增宽.结论 高机械指数超声造影对结肠癌肝转移有明显抑制作用.     

声学造影剂联合野生型P53质粒治疗大鼠肝癌的实验研究

目的　探讨超声破坏造影剂微气泡介导裸质粒DNA治疗大鼠肝癌的有效性。方法　将 2 4只肝癌模型Wistar大鼠分成 4组。第 1组 ,瘤体内直接注入造影剂和野生型P5 3质粒的混合物 ,立刻用超声照射 ;第2组 ,注射混合物后不用超声照射 ;第 3组 ,注入裸质粒后用超声照射瘤体 ;第 4组 ,仅注入裸质粒而不行超声照射。 2d后 ,用半定量逆转录 -聚合酶链式反应法检测野生型P5 3mRNA在肝癌组织中的表达。结果　第 1组的P5 3mRNA表达明显增强 ,高于其他 3组 (P <0 .0 0 1) ,是第 4组的 6.88倍。第 3组高于未行超声照射组 (P<0 .0 5 ) ,是第 4组的 2 .16倍。第 2组与第 4组在基因表达上的差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。结论　瘤体内直接注射造影剂和野生型P5 3质粒混合物后行超声照射 ,可明显增加裸质粒DNA的转录 ,是一种高效、安全的基因治疗方法。     

二甲基亚硝胺肝纤维化过程中金属蛋白酶组织抑制因子1基因表达的动态变化

目的：观察肝纤维化过程中TIMP－1基因表达的动态变化，探讨肝纤维化的发生发展机理，以及中药复方861的抗纤维化机制。方法：100只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组和复方861预防组。模型组用二甲基亚硝胺（DMN）腹腔内注射诱导大鼠发生肝纤维化，共计6周，第1周注射3次，其它周均注射2次，观察8周；复方861预防组大鼠则在用DMN腹腔注射的同时，每天接受中药灌胃1次，直至实验结束；政党对照组以生理盐水代替DMN腹腔内注射。分别于第1、4、10、17、28、42、56天分批处死动物，取出肝脏，以半定量RT－PCR法检测肝组织中TIMP－1 mRNA。结果：从动态发展来看，正常对照组大鼠肝组织TIMP－1 mRNA的表达水平基本稳定不变；模型组大鼠肝组织TIMP－1 mRNA的表达从第4天开始升高，10天后一直维持高水平表达直至动物实验结束；复方861预防组TIMP－1 mRNA的表达变化不大。从组间比较来看，模型组肝组织TIMP－1 mRNA的表达水平从第4天开始即比正常对照组明显增高，此后升高更显直至实验结束；861预防组从第10天开始比正常对照组有所增高，但比模型组明显低，从28天开始以后则比模型组降低越发显。结论：TIMP－1的表达在肝纤维化的发展过程中逐渐增高。它以抑制纤维胶原降解，因而在促进肝纤维化发展的进程中起重要作用。中药复方861具有抑制TIMP－1表达的作用，这是其抗纤维化的机制之一。     

Wistar大鼠肝脏超声声像图表现及相关应用

目的明确Wistar大鼠肝脏声像图表现,探讨大鼠肝脏在超声医学实验研究中的应用。方法Wistar大鼠40只,利用高频探头观察肝脏二维图像;将大鼠随机分为2组,每组20只,超声监视下经皮将美蓝溶液(0.05~0.1ml/只)注入肝左外叶(组1)或右侧各分叶(组2);尾静脉团注超声造影剂观察肝脏造影过程;处死动物,检查肝叶间有无美蓝溶液渗出;摘除肝脏,测量各分叶。结果在高频探头下隐约可见大鼠肝脏各叶的纤细分界;组1无美蓝渗出,组2有5例发生渗出;所有病例可清晰显示肝脏微泡造影的动脉相、门静脉相和延迟相。结论高频探头可以区分Wistar大鼠肝脏的部分分叶,肝左外叶易于在超声下辨认,对之进行穿刺操作时,不易发生刺透现象;大鼠肝脏可用于微泡造影剂成像等超声实验研究,但其动脉相和门静脉相持续时间短,针对这两个时相的研究可能会受到一定的影响。     

超声量化指标与肝静脉波形分型在评价乙肝患者肝纤维化程度中的临床意义

目的探讨超声量化指标与肝静脉波形分型在评价乙肝患者肝纤维化程度中的临床意义。方法回顾性分析本院110例乙肝患者的临床资料,作为研究组;选取同期到本院体检的25例健康人,作为对照组。研究组入院确诊时、对照组体检时均分别行超声检查,评估超声量化指标、肝静脉波形分型。以肝穿刺病理结果为金标准,判断超声量化指标、肝静脉波形分型对肝纤维化程度诊断价值。结果研究组S1、S2、S3、S4期患者超声量化指标评分高于对照组(P<0.05);随着肝纤维化分期增加,研究组超声量化指标评分呈增高趋势(P<0.05);研究组S4期HVⅠ型+HVⅡ型率高于S0、S1、S2期及对照组,S3期HVⅠ型+HVⅡ型率高于S0、S1、S2期及对照组(P<0.05);ROC曲线显示肝静脉波形分型灵敏度、特异度较超声量化指标评分高。结论乙肝患者肝纤维化程度评估中超声量化指标与肝静脉波形分型均具有一定价值,且后者灵敏度、特异度更高。