肌肉生长抑制素前肽融合蛋白的重组表达及其抗萎缩活性的初步鉴定

目的:探讨“白蛋白-突变型肌肉生长抑制素前肽”融合蛋白在抗肌萎缩中的作用.方法:首先将肌肉生长抑制素前肽基因第76位天冬氨酸对应的碱基突变为丙氨酸对应的碱基,获得了“突变型肌肉生长抑制素前肽”基因.再将该基因与大鼠白蛋白基因片段连接,克隆至酵母表达载体.利用酵母表达系统,重组表达“白蛋白-突变型肌肉生长抑制素前肽”融合蛋白.纯化的重组蛋白用于尾悬吊大鼠的治疗实验.结果:大鼠经过21天的尾悬吊,后肢骨骼肌发生了明显的萎缩.注射“白蛋白-突变型肌肉生长抑制素前肽”融合蛋白的尾悬吊大鼠,其后肢骨骼肌未发生萎缩.结论:重组表达的“白蛋白-突变型肌肉生长抑制素前肽”     

ETO转录抑制结构域的分析与鉴定

目的 进一步确定ETO抑制基因转录的区域及其与组蛋白脱乙酰化酶之间的关系。方法 以位点诱变法使ETO的两个锌指结构分别突变。使用聚合酶链反应扩增ETO突变体。克隆入真核细胞表达质粒pEA-CMV中，通过基因转染，报告基因转录活性分析。确定ETO的不同区段对基因转录调节的作用。结果 成功构建出锌指突变和不同区段的ETO表达载体。并发现ETO存在两个抑制转录的区域。分别位于羧基末端的两个锌指结构和第275-487位氨基酸残基。结论 ETO通过2个区域抑制转录。并且与组蛋白脱乙酰化酶密切相关，后可能会用作急性髓系白血病M2b的治疗靶点。     

血型A抗原的模拟多肽的表达及功能研究

目的融合表达血型A抗原的模拟多肽，初步鉴定融合蛋白结合抗A抗体的能力。方法PCR克隆扩增血型A抗原模拟多肽（P5）和谷胱苷肽S-转移酶（GST）编码基因，并连接成P5-GST。双酶切后克隆入原核表达质粒pET28b，经E．coil DH5a扩增后纯化并酶切、测序鉴定。以BL21（DE3）为表达菌，在IPTG诱导下表达P5-GST融合蛋白．Ni-NTA柱纯化蛋白。红细胞凝集抑制实验分析融合蛋白模拟血型A抗原的能力。ABO-EIJSA初步分析P5．GST融合蛋白检测血型抗体的效能。结果成功构建P5基因和GST基因融合的原核表达质粒pET28b-P5-GST，目的基因可以高效表达，纯化的融合蛋白具有良好的模拟血型A抗原的能力。基于P5-GST融合蛋白的ABO—ELISA具有一定的检测血浆抗A抗体的能力。结论血型A抗原的模拟多肽序列与GST的融合表达蛋白具有特异性结合抗A抗体的特性，本融合蛋白具有替代血型A多糖抗原潜能，为发展新型的抗A抗体检测方法提供依据。     

乙型肝炎病毒前C区及基本核心启动子变异检测方法的比较研究

目的 建立错配聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（mPCR-RFLP）检测乙型肝炎病毒（HBV）前C区A1896、基本核心启动子（BCP）T1762/A1764双变异的方法,与直接测序法比较,评估其应用价值.方法 利用错配PCR的原理扩增HBV前C区长194 bp、C启动子区长184 bp的基因片段,扩增产物分别经限制性内切酶Bsu36I、BclI酶切,琼脂糖凝胶电泳,根据酶切图谱多态性,建立检测HBV前C A1896、BCP T1762/A1764双变异的方法,对127份HBsAg、HBV DNA阳性的HBV感染者血清进行分析,酶切同时测序.2份标本用克隆测序以验证酶切鉴定变异株、野株混合感染的准确性.结果 127份血清中125（98.42%）份能用酶切、121（95.21%）份能用测序分析HBV前CA1896、BCP T1762/A1764状况.酶切与测序均成功的119份血清中,16份为前C区A1896变异株,34份为BCP T1762/A1764双变异株,21份为前C区A1896、BCP T1762/A1764联合变异株,48份为前C区G1896、BCP A1762/G1764野株,酶切与测序的结果完全一致.1份酶切鉴定为前C区A1896、G1896混合感染标本的5个克隆子中,1个为前C区A1896变异株,另外4个为前C区G1896野株;另1份酶切鉴定为单纯前C区A1896变异标本的5个克隆子均为前C区A1896变异株,酶切分析结果与克隆测序结果完全相符.结论 与测序法相比,本方法较简便、特异性强,能区分野毒株、变异株混合感染,适合较大样本分析,可用于流行病学调查及临床筛查.     

奈瑟氏淋球菌DNA的AFLP指纹图谱

目的 :评价扩增片段长度技术 (AFLP)分析对淋球菌分离株进行基因分型的能力。方法 :2 6株淋球菌分离株基因以EcoRI和MesI酶切及AFLP分析。结果 :同一地区的淋球菌分离株之间存在相当大的DNA多态性。性伙伴之间分离的淋球菌菌株同源性大于 95 % ,无性关系患者中分离的淋球菌菌株同源性为 70 %～ 95 % ,而不同地点分离株、WHO参考株均不能和本地区分离株聚类。结论 :AFLP是鉴别淋球菌临床分离株有用而敏感的分子技术 ,有助于了解菌株来源、菌株间的克隆相关性及抗生素耐药性的传播     

抗甲硝唑人源scFv抗体筛选与鉴定

目的 筛选甲硝唑人源单链可变区（scFv）抗体,为研究快速检测试剂盒奠定基础.方法 采用噬菌体表面展示技术,以甲硝唑作为抗原,固相包被于Nunc板,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术,从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮＂吸附-洗脱-扩增＂筛选过程,随机挑选抗甲硝唑的90个克隆,利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应及竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定,获得与甲硝唑结合活性较强的scFv阳性克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经酶切鉴定SfiⅠ/NotⅠ后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XL1-Blue,提取质粒进行酶切鉴定分析.结果 经过筛选90个克隆中有16株克隆ELISA的490 nm波长吸光度（A490nm）值较高,将这些噬菌体上清与牛血清清蛋白（BSA）进行交叉反应,确定有4株交叉反应较弱,结合3次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株阳性克隆.亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌感受态细胞XL1-Blue.结论 提取质粒酶切片段与目的相符,为下一步研究其特异性亲和力的研究创造了条件.     

结核分枝杆菌去乙酰化酶2的克隆及酶学研究

目的构建结核分枝杆菌去乙酰化酶2(Sir2)原核表达载体,并进行表达纯化及酶学研究。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,聚合酶链反应扩增Sir2基因,构建pET-28a-Sir2重组质粒,在E.coli BL2(DE3)中诱导表达蛋白,经Ni 2+-NTA柱纯化,最后通过去乙酰化酶试验测定Sir2酶活的最适反应温度和pH值,以及吡嗪酰胺对其酶活的影响。结果成功构建了Sirt2原核表达载体,并能在E.coli BL21(DE3)中高效表达。随后对纯化的Sir2蛋白进行依赖于NAD+的去乙酰化活性研究,得到该酶的最适反应温度是25℃,最适反应pH值是9.0。在偏酸性环境中,吡嗪酰胺对酶活有抑制,而在偏碱性环境中,没有抑制作用。结论利用分子克隆技术,获得了高纯度的Sir2蛋白并获得其酶活最适反应温度和最适pH值,及吡嗪酰胺对其有抑制效果,为研究抗结核药物吡嗪酰胺的抑菌机制提供一定基础。     

人胰激肽释放酶基因的克隆及表达载体的构建

目的 :克隆中国人胰组织激肽释放酶基因 ,构建原核、真核表达载体 ,为开发生产人源激肽释放酶基因工程产品及人源激肽释放酶基因药物奠定基础。方法 :提取人胰腺组织总RNA ,逆转录后琼脂糖电泳初步鉴定PCR产物。将激肽释放酶cDNA回收、补平后插入克隆质粒KS ,酶切鉴定后 ,对激肽释放酶基因进行序列测定分析。用双酶切法 ,插入原核表达载体PET 2 8b ,真核表达载体pBacPAK9质粒中。酶切鉴定后 ,进行序列测定分析。结果 :本实验克隆的激肽释放酶基因与GenBank报告的激肽释放酶基因相比 ,碱基序列相同。测序分析表明人胰组织激肽释放酶基因经酶切 ,正确插入到原核表达载体PET 2 8b ,真核表达载体pBacPAK9质粒中。结论 :克隆并构建成功中国人组织激肽释放酶基因的原核、真核表达载体 ,可用于基因工程产品及基因药物的深入研究工作     

利用亲和层析法检测乙酰化蛋白的研究

目的 建立一种快速、相对定量检测乙酰化蛋白方法,并初步应用其检测药物作用后Jurkat细胞乙酰化总蛋白水平.方法 用不同浓度的曲古菌素A(TSA)诱导Jurkat细胞蛋白高乙酰化后,利用抗乙酰化赖氨酸抗体亲和层析柱富集纯化乙酰化总蛋白,经酸洗脱后固定于酶标板,ELISA法检测乙酰化蛋白相对总量,并用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF)分析验证其成分;同法检测不同浓度的没食子酸、大黄素、单乙酰化大黄素A三种药物作用Jurkat细胞后乙酰化总蛋白水平的变化,筛查诱导Jurkat细胞蛋白乙酰化药物.结果 1μmol/L TSA作用于4×105Jurkat细胞24 h,乙酰化总蛋白相对水平最高.MALDI-TOF/TOF分析显示,TSA诱导Jurkat细胞产生的乙酰化蛋白共有22种,其中15种为乙酰化组蛋白.没食子酸、大黄素、单乙酰化大黄素A作用Jurkat细胞后所导致的乙酰化程度不同,以1μmol/L浓度TSA为阳性对照组,无药物为空白对照组,35.09 μmol/L和17.54 μmol/L大黄素处理的Jurkat细胞乙酰化蛋白相对水平分别为4.3％和14.2％;1.47 μmol/L和2.94 μmol/L没食子酸处理组乙酰化蛋白相对水平分别为28.7％和11.5％;152.91 μmol/L和30.58 μmoL/L单乙酰化大黄素组分别为22.0％和3.6％;其中1.47 μmol/L没食子酸所诱导的乙酰化蛋白水平最高.结论 初步建立了活细胞基础上纯化富集并检测乙酰化总蛋白水平的方法,该法可快速、简便的筛选以组蛋白去乙酰化酶为靶点的抗癌药物.     

人干燥综合征抗原A毕赤酵母分泌型表达载体的构建

目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体.方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,RCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提取质粒,双酶切鉴定并测序.结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确.结论:成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体,为下一步取代从动物胸腺中人工提取低纯度、低产量的SSA抗原,研制新型抗SSA诊断试剂盒打下基础.     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感，不同性别孤独感发生率无差异性，不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）；随年级增加，孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970，P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题，老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童，以减少其孤独感的发生。     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

The characteristics of interpretation of results of analysis of protein amount in urine of pregnant women

The adequacy of implementation of present proteinuria diagnostic thresholds under examination of pregnant women was examined. The analysis was applied to all urine samples of pregnant women from December 2009 to March 20010. The amount of protein in urine was concurrently evaluated by turbidimetric analysis with sulfosalicylic acid, colorimetric analysis with pyrogallol red, "dry chemistry" technology (the diagnostic strips). It is established that the mentioned techniques of analysis of protein in urine provide independent results. The results of colorimetric analysis are characterized by better precision and adequacy. However, in case of pregnant women the diagnostic threshold of protein concentration should be shifted from 0.120 to 0.150 g/l.     

超声评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响

目的 探讨超声在评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响的价值。方法 回顾性收集经病理学证实为头颈部肿瘤、放疗前后的颈动脉超声资料以及其他基线资料完整的患者93例,比较放疗前后放疗侧颈动脉和非放疗侧颈动脉粥样硬化斑块和溃疡斑块的总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积。结果 放疗前后颈动脉超声检查的平均间隔时间为（6.1±1.9）年;放疗前放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积与非放疗侧比较差异均无统计学意义（P均>0.05）;放疗后放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积均较非放疗侧加重,差异有统计学意义（P均<0.05）。结论 放疗可导致头颈部肿瘤患者颈动脉粥样硬化斑块的形成和进展,且斑块具有易损性特点。     

《中国内镜杂志》主编雷光华教授简介

雷光华男,1970年12月生,骨科学博士,一级主任医师,二级教授,博士生/后导师。国家"万人计划"领军人才,教育部"长江学者"特聘教授,科技部"中青年科技创新领军人才",国家卫生计生突出贡献中青年专家,享受国务院政府特殊津贴专家,国家临床重点专科骨科和运动医学学科带头人,全国青年岗位能手,湖南省"芙蓉学者"特聘教授,湖南省科技领军人才和骨科学科领军人才,湖南省普通高校学科带头人,湖南省首届"优秀科技工作者",中南大学"湘雅名医"。