实时荧光定量PCR技术运用于肝癌患者基因检测

目的探讨实时荧光定量PCR SYBR Green I探针技术在研究肝癌患者中基因表达情况的可行性。方法运用实时荧光定量PCR SYBR Green I技术,检测肝癌患者癌组织及癌旁组织RAP1GAP基因表达情况。结果实验组和对照组有明显的统计学差异。结论Real-time PCR技术检测目的基因的表达是非常方便快捷准确的方法。     

荧光定量PCR检测TCR VγI-Jγ基因重排标准品质粒及标准曲线的构建

目的：构建荧光定量PCR检测TCR VγI-Jγ基因标准品重组质粒和标准曲线，为建立实时荧光定量PCR准确检测淋巴系肿瘤微小残留病奠定基础。方法：对TCR VγI-Jγ基因进行序列分析，利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针。提取急性淋巴细胞白血病患者的DNA，经PCR扩增，产物纯化后与pMD 18-T Vector连接，转化到大肠杆菌DH5α，筛选得到标准品的质粒。结果：重组质粒进行荧光定量PCR扩增出现强烈的荧光值增长，表明TCR VγI-Jγ基因已成功克隆。以10^0～10^-5不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增，Ct值分别为21．08、24．34、27．53、30．58和33．25。统计学分析显示Ct值与标准品浓度的对数存在良好线性关系，回归系数为0．998。结论：所构建的TCR VγI-Jγ基因荧光定量PCR检测标准品特异性和线性关系好，准确可靠，利于统一标准。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测survivin甲基化状态

目的建立SYBR Green Ⅰ实时荧光聚合酶链反应（PCR）检测survivin甲基化的方法。方法25例胃癌组织标本及与其配对的正常胃组织经甲基化敏感性限制性内切酶HpaⅡ和MspⅠ处理后，再用SYBR GreenⅠ实时荧光PCR对survivin外显子1进行检测。实时荧光定量PCR检测survivin基因内含子2，用于监测经限制性酶消化的基因组DNA浓度变化，10倍系列稀释的基因组标准物用于检验实时PCR的敏感度，PCR产物通过凝胶电泳分析证实。结果经Hpa Ⅱ酶切后，甲基化的目的基因PCR产物在熔解曲线上有Tm值为（91．5±0．5）℃的峰，电泳证实为338bp的条带。所有经酶消化的样本都能扩增出以Tm值（79．5±0．5）℃为特征的对照基因（survivin基因内含子2），表明基因组DNA未产生严重的非特异性降解。SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测甲基化目的基因的灵敏度为10^0拷贝／μL。用以上新建的体系检测25例胃癌标本，发现其survivin基因外显子1的去甲基化频率为96％。结论SYBR GreenⅠ荧光PCR法具有快速、准确、敏感、实时、简单和敏感的特点，是检测survivin外显子1甲基化状态的一种可靠的新方法。     

SYBR Green实时荧光PCR方法检测广谱人乳头瘤病毒的方法建立

目的建立实时荧光PCR方法以检测广谱人乳头瘤病毒。方法该实时荧光PCR方法利用了degenerate PCR引物与非特异性的SYBR Green染料替代通常使用的PCR特异性引物与探针,并与市售高危13型、低危6型试剂盒以及degener-ate PCR方法进行比较。结果对于用高危13型试剂盒及低危6型试剂盒检测的100例黏膜型人乳头瘤病毒阳性标本,用SYBR Green实时荧光PCR方法检出的阳性数为69例,敏感性为69%,相反,用SYBR Green实时荧光PCR方法检测出的40例皮肤型人乳头瘤病毒阳性标本,用高危13型试剂盒以及低危6型试剂盒检测均为阴性;对于用SYBR Green实时荧光PCR方法及degenerate PCR方法检测的90例黏膜型、60例皮肤型标本,其检测结果显示两种方法有高度一致性(Kappa=0.907)。结论与市售试剂盒相比,SYBR Green实时荧光PCR方法可以覆盖广谱的HPV型别(皮肤型与黏膜型),并且比degenerate PCR方法高效、快速和简便,不失为一个可用于临床与科研的良好检测手段。     

定量PCR诊断Down''''s综合征方法比较

目的 比较两种染料进行定量PCR检测Down’s综合征时的特点。方法 采用PCR方法同时扩增人肝型磷酸果糖激酶基因(PEKL—CH21)和人肌型磷酸果糖激酶基因(PEKM—CHI)，分别用SYBR Green I和银染两种染料处理扩增产物，琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳-银染后在凝胶成像系统进行分析，得出扩增产物的荧光强度对比值。以吸光度理论比值为标准，分别比较两种荧光染料的敏感性、特异性。结果 SYBR Green I和银染两种染料进行定量PCR诊断26例Downs综合征患者和20例正常人其敏感性、特异性均为100％，两种染料检测结果无差别。结论 SYBR Green I是一种敏感、特异、实用、低毒的荧光染料。     

原发性胆汁性肝硬化患者外周血TRAIL基因表达水平初探

目的建立检测人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)mRNA的实时荧光相对定量方法,探讨其基因表达与原发性胆汁性肝硬化(PBC)的相关性。方法基于TaqMan-MGB探针技术,以β-actin基因为内参照,通过目的基因与内参基因荧光强度达到一定阈值时的循环数之差,即△Ct值定量原始模板浓度,建立实时荧光逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)相对定量方法,检测30例PBC患者、25例乙型肝炎(简称乙肝)后肝硬化患者及30名正常人外周血单个核细胞(PBMC)TRAIL基因的表达,同时检测血浆γ-谷氨酰转肽酶(GGT)和碱性磷酸酶(ALP)浓度,并作相关性分析。结果PBC患者PBMC TRAIL基因检测的△Ct值为2.4±1.2,其相对表达量是正常对照组的6.96倍,差异有统计学意义(P<0.05),乙肝后肝硬化患者TRAIL基因△Ct值为3.3±1.7,其相对表达量是正常对照组的3.73倍,差异有统计学意义(P<0.05),而PBC组与乙肝后肝硬化组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。PBC患者TRAIL的△Ct值与GGT浓度的对数值呈显著相关(r=-0.396,P<0.05)。结论PBC患者及乙肝后肝...     

原发性胆汁性肝硬化患者外周血TRAIL基因表达水平初探

目的建立检测人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）mRNA的实时荧光相对定量方法,探讨其基因表达与原发性胆汁性肝硬化（PBC）的相关性。方法基于TaqMan—MGB探针技术,以B—actin基因为内参照,通过目的基因与内参基因荧光强度达到一定阈值时的循环数之差,即△Ct值定量原始模板浓度,建立实时荧光逆转录聚合酶链反应（FQ—RT—PCR）相对定量方法,检测30例PBC患者、25例乙型肝炎（简称乙肝）后肝硬化患者及30名正常人外周血单个核细胞（PBMC）TRAIL基因的表达,同时检测血浆γ－谷氨酰转肽酶（GGT）和碱性磷酸酶（ALP）浓度,并作相关性分析：结果PBC患者PBMCTRAIL基因检测的△Ct值为2．4±1．2,其相对表达量是正常对照组的6．96倍,差异有统计学意义（P〈0．05）,乙肝后肝硬化患者TRAIL基因△Ct值为3．3±1．7,其相对表达量是正常对照组的3．73倍,差异有统计学意义（P〈0．05）,而PBC组与乙肝后肝硬化组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。PBC患者TRAIL的△Ct值与GGT浓度的对数值呈显著相关（r=－0．396,P〈0．05）。结论PBC患者及乙肝后肝硬化患者PBMC TRAIL基因表达水平明显升高,提示TRAIL在自身免疫性肝病及肝脏病毒损伤中均具有重要作用。     

两种定量聚合酶链反应模式检测乳腺癌组织中缓激肽释放酶表达的比较

目的比较两种荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测乳腺癌组织中激肽释放酶6（KLK6）基因的表达。方法分别用TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料作为荧光指示剂,实时荧光定量PCR检测KLK6在乳腺癌中的相对表达水平,应用统计软件分析两种检测模式的差异。结果两种检测模式的检测结果均显示乳腺癌中KLK6的表达均高于正常组织,KLK6的相对表达水平无显著性差异。结论在扩增产物特异的条件下应用SYBR Green Ⅰ检测的效果同Taq Man探针,SYBR Green Ⅰ染料应用范围广泛,成拳低。     

实时逆转录PCR快速鉴别呼吸道合胞病毒亚型

目的：建立SYBR Green I实时RT-PCR快速检测呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）A、B亚型的方法。方法：根据RSVG蛋白编码基因的核苷酸序列设计三条引物，其中P1为RSV通用引物，P2、P3分别为A、B亚型特异性引物。使用SYBR Green I荧光染料结合熔解曲线分析进行检测，根据产物特征性熔解温度（melting temperatures Tm）鉴别RSVA、B亚型。结果：本法对RSV Long株（A亚型）和CHl8375株（B亚型）进行检测，其Tm值分别为84．06和89．06℃；与常见呼吸道病毒间无交叉反应；48例临床标本中检出RSV阳性29例，其中A亚型占72．4％（21／29），B亚型占27．6％（8／29）。结论：SYBR Green I实时RT-PCR结合熔解曲线分析检测RSV亚型具有快速、简便、特异等特点，可对临床标本直接分型。     

p53基因第8外显子实时荧光PCR方法的建立

[目的]建立实时荧光定黾PCR检测053基因第8外显子的检测方法。[方法]用酚-氯仿抽提法提取我院的常规体检病人的DNA，应用SYBR Green Ⅰ作荧光染料，通过检测PCR产物中荧光讯号的强度来定量p53基因，重复测定该标本20次，以此建立检测p53基因的实时荧光定量PCR方法。[结果]熔解曲线分析表明方法特异可靠。[结论]本研究建立了p53基因实时荧光定量PCR检测方法，该方法简便、特异、莺复性好、可信度高，为p53基因第八外显子的定蚤研究提供了理想的检测方法。     

检测气单胞菌属的SYBR Green荧光PCR方法的建立和评价

目的建立一种检测气单胞菌的SYBR Green荧光PCR方法。方法使用文献报道的气单胞菌属16S rRNA基因扩增引物,建立SYBR Green荧光PCR检测方法,评价其特异性、灵敏度和实际应用价值。结果SYBR Green荧光PCR方法的检测下限为10–7 ng/ml,检测的21株气单胞菌均为阳性,检测的弧菌、大肠埃希菌、沙门菌、小肠结肠炎耶尔森菌、志贺菌均为阴性。 针对104份健康人群粪便样本,8.65%的样本分离到气单胞菌,28.85%的样本SYBR Green荧光PCR方法检测阳性。 其中8份标本采用2种方法检测均为阳性。 样本核酸检测阳性后再进行病原菌的分离,会漏检1份样本（11.11%）,但可以减少71.15%（74/104）的分离培养及鉴定工作。结论SYBR Green荧光PCR方法具有很好的特异性和敏感度,用于大样本的早期筛查可以减少70%左右的工作量,适合应用于气单胞菌感染和携带的监测。     

大鼠脊髓Ⅰ型白细胞介素1受体mRNA定量检测方法的建立

目的：建立一种方便可靠的方法定量检测大鼠脊髓Ⅰ型白细胞介素1受体mRNA.方法：实验于2004-09/2005-01在南通大学基因诊断实验室和上海第二医科大学神经生物学实验室完成.雌性SD大鼠15只.随机分为5组,正常对照组3只,脊髓损伤4 h组3只,脊髓损伤4 h假手术组3只,脊髓损伤24h组3只,脊髓损伤24h假手术组3只.利用LightcCycler荧光定量聚合酶链反应仪和荧光染料SYBR green Ⅰ对聚合酶链反应条件进行优化后,对用重物坠落诱导的脊髓损伤模型大鼠的脊髓组织中Ⅰ型白细胞介素1受体mRNA进行实时荧光聚合酶链反应,通过标准曲线法进行绝对定量分析或通过比较Ct（△△Ct）法进行相对定量分析.结果：15只大鼠均进入结果分析.①聚合酶链反应特异性：熔点曲线分析和琼脂糖凝胶电泳表明每个聚合酶链反应都获得了特异性的扩增产物.②聚合酶链反应扩增线形与效率：该方法能够检测到最低100个拷贝的模板,对含有1 000或更多拷贝模板的常规检测可获得较好的定量数据.Ⅰ型白细胞介素1受体和次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶的扩增效率分别是0.962,0.973.③定量计算公式的有效性：以cDNA稀释倍数对数值为X轴,以相应目的基因和看家基因的△Ct为Y轴得到直线的斜率为0.084,可以应用公式2-△△Ct.④初步应用：脊髓损伤4 h,24 h后其Ⅰ型白细胞介素1受体mRNA表达水平分别有2.6倍（P＜0.05）和7.8倍的增加（P＜0.01）.结论：应用SYBRgreen Ⅰ实时荧光定量方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点,非常适合于对表达低水平Ⅰ型白细胞介素1受体mRNA的组织进行定量分析.     

乙型肝炎病毒SYBR Green I 实时荧光定量PCR方法的建立及临床应用

目的 建立SYBR Green I实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的快速方法,并探讨其临床应用价值。方法 根据GenBank公布的Hepatitis B virus gp1基因序列设计引物,建立SYBR Green I实时荧光定量PCR,并对反应体系和扩增程序进行优化。定量标准品通过基因克隆方法获得,同时以浙江省夸克公司HBV DNA定量检测试剂盒作对照,应用于随机选取的100份乙型肝炎患者血清检测。结果 SYBR Green I实时荧光定量PCR检出限范围为5×10²copies/ml～5×10⁸copies/ml,HBV DNA浓度与CT值有良好线性关系,无交叉反应,整个过程仅需2.5 h。在随机抽取的100份临床标本应用中,与浙江省夸克公司的HBV荧光定量PCR检测试剂相比,建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR体系灵敏度100%,特异度92.5%。结论SYBR Green实时荧光定量PCR快速、简便、灵敏度高、特异度强,可用于乙型肝炎患者病情监测,有效指导临床用药,准确评价HBV感染者的病情。     

p53基因第8外显子实时荧光PCR方法的建立

目的建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测p53基因第8外显子的方法。方法用酚-氯仿抽提法提取云南省中医院的常规体检患者的DNA,应用SYBR GreenⅠ作荧光染料,通过检测PCR产物中荧光讯号的强度来定量p53基因,重复测定该标本18次,以此建立检测p53基因的实时荧光定量PCR方法。结果融解曲线分析表明该方法特异可靠。结论该研究建立了p53基因实时荧光定量PCR检测方法,该方法简便、特异、重复性好、可信度高,为p53基因第8外显子的定量研究提供了理想的检测方法。     

西尼罗河病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用研究

建立特异、敏感、快速检测西尼罗河病毒(WNV)的SYBR Green实时荧光定量PCR方法.方法:针对西尼罗河病毒囊膜蛋白(E)的保守序列设计引物,建立WNV的实时荧光定量检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性以及稳定性.对保存的54例WNV感染者的血清样本进行检测,分析其检测的准确性.结果:建立的SYBR Green实时荧光定量PCR方法对WNV的检测具有高度的特异性,而对日本脑炎病毒(JEV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)等均无交叉反应,检测的灵敏度可达到100 pg.标准曲线具有较好的线性关系,相关系数为0.995,实时荧光定量PCR效率为100％.对54例WNV感染样本进行检测,准确率高达98.15％.结论:实时荧光定量PCR技术检测WNV具有较高的特异性、敏感性和稳定性,可作为临床诊断WNV的手段.     

血液中检测人巨细胞病毒的荧光定量PCR方法建立及评估

目的建立2种实时荧光定量PCR方法,用于在血液样本中检测有可能威胁血液安全的人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)。方法根据Gen Bank中HCMV的MIE基因保守序列的分析结果,分别建立基于SYBR Green和Taq Man探针的2种实时定量PCR检测方法,同时用这2种方法对来自血液制品厂的血浆进行检测。结果基于SYBR Green的实时定量PCR检测方法,得到的熔解曲线峰单一,建立的2种实时定量PCR方法对于HCMV的DNA具有高度特异性和灵敏度,检测下限均为50 copies/m L,并且具有较好的批间和批内重复性。结论应用本研究建立的实时荧光定量PCR方法对献浆人群血浆样品进行HCMV检测,2种方法检测结果一致,证明该方法可用于在血液样本中检测HCMV。     

核因子kB在低氧诱导因子1α基因修饰神经干细胞上调血管内皮生长因子表达中的桥接作用

背景:很多研究发现,在脑缺氧损伤区域核因子kB与血管内皮生长因子表达呈正相关.因此,作者大胆假设,核因子kB是否处于低氧诱导因子1α上调血管内皮生长因子作用通路上并起桥接作用.目的:以低氧诱导因子1α修饰的神经干细胞为载体,观察核因子kB在低氧诱导因子1α上调血管内皮生长因子表达通路中的作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在佳木斯大学神经科学研究所完成.材料:新生24 h内的Wistar大鼠,雌雄不拘.方法:扩增腺病毒载体低氧诱导因子1α-绿色荧光蛋白后转染神经干细胞,荧光检测神经干细胞中低氧诱导因子1α-绿色荧光蛋白及空载体Ad-绿色荧光蛋白表达,分别提取基因转染后神经干细胞、空载体转染神经干细胞、正常神经干细胞蛋白.然后低氧诱导因子1α基因修饰的神经干细胞中按50,150,300 μmol/L浓度梯度加入核因子KB特异性抑制剂二硫氨基甲酸酞吡咯烷,Westem Blot法检测其中血管内皮生长因子的表达变化.主要观察指标:各组神经干细胞中低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子和核因子kB的表达;给予梯浓度核因子kB特异性抑制剂后神经干细胞中血管内皮生长因子的表达.结果:腺病毒低氧诱导因子1α-绿色荧光蛋白转染神经干细胞后基因表达强弱与MOI及转染时间有关;转染低氧诱导因子1α-绿色荧光蛋白后的神经干细胞中低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子和核因子kB的表达呈正相关;给予梯浓度核因子kB特异性抑制剂后腺病毒低氧诱导因子1α-绿色荧光蛋白修饰的神经干细胞中血管内皮生长因子的表达呈抑制剂浓度依赖性下调,各浓度组之间血管内皮生长因子表达差异有显著性意义(P<0.05～0.01).结论:核因子kB位于低氧诱导因子1α上调血管内皮生长因子表达的信号通路上并起桥接作用.     

癌-睾丸抗原基因在神经胶质瘤干细胞中的表达

背景：癌-睾丸抗原基因在胶质瘤干细胞表达还不甚清楚。目的：检测癌-睾丸抗原基因在神经胶质瘤干细胞中的表达。方法：通过神经球培养的方法而分离干细胞。以半定量PCR及实时荧光定量PCR检测癌-睾丸抗原基因在母细胞、干细胞与分化细胞中的表达。结果与结论：以神经球培养方式从胶质瘤细胞系中可分离出肿瘤球,将肿瘤球培养在含血清的培养基中,它的形态呈贴壁分化,且与母细胞没有区别。半定量PCR及实时荧光定量PCR检测发现与母细胞和分化细胞相比,癌-睾丸抗原基因在干细胞中的表达最高。提示癌-睾丸抗原基因可能为肿瘤干细胞的表面抗原。     

实时定量聚合酶链反应检测石蜡包埋B细胞淋巴瘤组织克隆性IgH基因重排

我们利用SYBR Green Ⅰ荧光染料，应用实时定量PCR（RQ-PCR）检测了15例B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）患者免疫球蛋白重链（IgH）基因重排情况，以探讨克隆性IgH基因重排在B-NHL诊断和鉴别诊断上的价值。     

IgH重排的实时定量PCR检测及反应参数研究

为了探讨以通用引物应用PCR技术扩增克隆性免疫球蛋白重链基因（IgH）重排的最佳实验条件及SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测该基因的可行性，以通用引物对克隆性IgH重排进行扩增，对影响PCR扩增的退火温度、引物浓度、Taq酶用量、dNTP浓度、镁离子浓度、循环次数等实验因素进行了系统研究，找出最佳反应参数。并以通用引物进行了SYBR greenⅠ实时定量PCR对IgH重排基因的检测，测定了该法检测IgH重排基因的敏感性。结果表明：最佳退火温度为60℃，最佳引物浓度为0．8μmol／L，0．5U的Taq酶量效果满意，最适dNTP浓度为100μmol／L，最适镁离子浓度为3．0mmol／L，最佳循环次数为40次。SYBR GreenⅠ实时定量PCR可以实现对克隆性IgH重排的扩增和荧光信号的检测分析，其对IgH重排基因检测的敏感性为10^4／ml。结论：确定了应用PCR技术检测克隆性IgH重排的最适反应条件，实现了用通用引物对克隆性IgH重排稳定、特异的扩增，初步实现了以通用引物和应用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR对IgH重排的检测。