携带IL-24基因的溶瘤腺病毒诱导黑素瘤细胞凋亡

目的 探讨携带IL-24基因的溶瘤腺病毒（ZD55-IL-24）诱导人黑素瘤A375细胞凋亡的作用。方法 用PCR方法鉴定ZD55-IL-24,并大量扩增、纯化和病毒滴度测定。将ZD55-IL-24感染人黑素瘤A375细胞。结晶紫染色观察细胞毒性,MTT法测定细胞存活率,Western印迹检测溶瘤腺病毒E1A、IL-24基因蛋白表达。结果 PCR鉴定表明ZD55-IL-24包含IL-24基因且没有野生型腺病毒污染;结晶紫染色结果表明ZD55-IL-24对A375细胞有明显的细胞毒性效应。MTT法结果显示,ZD55-IL-24对A375细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性效应。Western印迹结果表明ZD55-IL-24能在A375细胞内高效表达E1A、IL-24基因。结论 溶瘤腺病毒ZD55-IL-24能携带IL-24基因在黑素瘤A375细胞中高效表达,抑制细胞增殖并诱导其凋亡。     

荷载白介素24的溶瘤腺病毒联合达卡巴嗪对裸鼠黑素瘤的抑制作用

目的 研究荷载白介素24（IL-24）的溶瘤腺病毒ZD55-IL-24联合达卡巴嗪抑制裸鼠黑素瘤的作用。方法 建立裸鼠恶性黑素瘤A375细胞移植瘤模型后,分别给予ZD55-IL-24联合达卡巴嗪、ZD55-IL-24、达卡巴嗪、磷酸盐缓冲液（PBS）干预。Western印迹法检测A375细胞移植瘤组织IL-24、E1A蛋白表达。测量裸鼠肿瘤生长体积。结果 Western印迹结果表明,ZD55-IL-24联合达卡巴嗪作用的裸鼠黑素瘤高效表达IL-24、E1A蛋白。接种30 d后,ZD55-IL-24联合达卡巴嗪组肿瘤平均体积为（2346.5 ± 576.0） mm3,ZD55-IL-24组为（4141.6 ± 1348.2） mm3,达卡巴嗪组为（5230.1 ± 922.8） mm3,PBS组为（7135.1 ± 1002.3）mm3,ZD55-IL-24联合达卡巴嗪组与各组之间差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。结论 荷载IL-24基因的溶瘤腺病毒ZD55-IL-24联合达卡巴嗪有抑制黑素瘤增殖的作用。     

溶瘤腺病毒介导IL-24增强黑素瘤细胞MV3放疗敏感性的研究

目的:研究溶瘤腺病毒介导IL-24(ZD55-IL-24)对黑素瘤细胞MV3放疗敏感性的影响。方法:将对数生长的MV3细胞分为ZD55-IL-24联合放疗组、ZD55-IL-24组、放疗组、PBS对照组。应用免疫细胞化学法检测黑素瘤MV3细胞中Bax和Bcl-2凋亡相关蛋白的表达:应用Western blot法检测E1A蛋白及Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡相关蛋白的表达。结果:免疫细胞化学法检测联合治疗组Bax染色强度最大,Bcl-2染色强度最小。ZD55-IL-24联合放疗作用的MV3细胞高效表达E1A,较其它组Bax的表达量增加,Bcl-2的表达量降低,Caspase-3活化更明显。结论:ZD55-IL-24联合放疗有明显的协同杀伤黑素瘤细胞的作用。     

皮肤科学基础

20121457荷载白介素24的溶瘤腺病毒联合达卡巴嗪对裸鼠黑素瘤的抑制作用/蒋冠(徐州医学院附属医院皮肤科),李鹤,魏志平…∥中华皮肤科杂志.-2012,45(4).-282～283建立裸鼠黑素瘤A375细胞移植瘤模型,分别给予荷载白介素24的溶瘤腺病毒ZD55-IL-24联合达卡巴嗪、ZD55-IL-24、达卡巴嗪、磷酸盐缓冲液(PBS)干预。Western印迹结果表明:ZD55-IL-24联合达卡巴嗪作用的裸鼠黑素瘤高效表达IL-24和E1A蛋白。接种30d后,ZD55-IL-24联合达卡巴嗪组肿瘤体积增长受到明显抑制,与各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。认     

携带IL-18基因的溶瘤腺病毒对裸鼠恶性黑素瘤移植瘤的抗肿瘤作用

目的 探讨携带IL-18基因的溶瘤腺病毒（ZD55-IL-18）对裸鼠恶性黑素瘤移植瘤的抗肿瘤效果。方法 取A375细胞2 × 106个接种于BALB/c裸鼠腋下组织内,建立裸鼠黑素瘤模型,当移植瘤体积达100 ~ 150 mm3时将其随机分为3组,每组8只,分别于瘤体内注射ZD55-IL-18、Ad-IL-18和磷酸盐缓冲液（PBS）。通过定期测量肿瘤体积观察肿瘤生长抑制情况,并切取肿瘤进行HE染色,观察肿瘤细胞生长形态;激光共聚焦显微镜下观察移植瘤组织IL-18表达水平、E1A蛋白的表达情况。免疫组化检测荷瘤裸鼠肿瘤组织CD34染色标记测定的肿瘤组织微血管密度;TUNEL法检测移植瘤组织细胞凋亡情况。结果 肿瘤生长曲线表明,ZD55-IL-18处理组肿瘤生长速度较PBS组明显减慢,接种44 d后ZD55-IL-18组肿瘤平均体积为（1039.378 ± 29.67） mm3,Ad-IL-18组为（2900.46 ± 62.65） mm3,PBS组为（3980.24 ± 63.78） mm3,各组间差异有统计学意义（P < 0.01）。HE染色发现,ZD55-IL-18处理组细胞核深染,很少见核仁,显示肿瘤组织生长抑制。激光共聚焦结果表明,ZD55-IL-18处理组IL-18的表达阳性率比Ad-IL-18处理组明显增强（P < 0.01）,并可以在肿瘤组织中表达E1A蛋白;免疫组化检测显示,ZD55-IL-18治疗组肿瘤微血管密度明显低于PBS组（P < 0.05）。不同处理组移植瘤细胞凋亡阳性率ZD55-IL-18处理组（86.28% ± 3.25%） ＞ Ad-IL-18处理组（43.67% ± 3.46%） ＞ PBS处理组（10.73% ± 2.48%）,各组之间差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。结论 携带IL-18基因的溶瘤腺病毒ZD55-IL-18对裸鼠恶性黑素瘤移植瘤的生长及转移有抑制作用,并探讨了其可能的作用环节。     

黑素瘤MIA启动子介导的CD/TK双自杀基因重组腺病毒系统选择性杀伤黑素瘤细胞

目的:探讨黑素瘤抑制蛋白(melanoma inhibitory activity,MIA)启动子介导的CD/TK双自杀基因重组腺病毒系统,对黑素瘤细胞A375的选择性杀伤作用。方法:构建腺病毒穿梭质粒pAdrMIA-CD/TK,在293细胞内包装、扩增、纯化后,体外转染人表皮黑素细胞HeMa-LP、黑素瘤细胞A375和人宫颈癌细胞HeLa,RT-PCR检测基因CD和TK片段,加入前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或丙氧鸟苷(GCV),用MTT法测定该体系对细胞株的杀伤效应。结果:制备的病毒滴度为1×1011pfu/L,用100m.o.i.重组腺病毒感染细胞后,发现目的基因CD和TK片段可在黑素瘤细胞中表达,转染目的基因的黑素瘤细胞A375对5-FC和GCV具有一定的敏感性,细胞存活率较对照组显著下降(P<0.05),联合应用两种药物对A375细胞的杀伤作用较单用一种显著增强(P<0.05)。对人表皮黑素细胞HEMa-LP和人宫颈癌细胞HeLa无显著杀伤作用。结论:构建的黑素瘤MIA启动子介导的CD/TK双自杀基因重组腺病毒系统,在体外可选择性杀伤黑素瘤细胞A375。     

Ki67启动子调控增殖腺病毒对人黑素瘤裸鼠移植瘤的生长抑制作用

目的:评价携带Ki67启动子的条件增殖型腺病毒Ki67 - ZD55对人A375细胞恶性黑素瘤裸鼠移植瘤模型的疗效.方法:将裸鼠黑素瘤移植瘤模型鼠随机分为3组,每组10只,分别给予PBS、ZD55- EGFP、Ki67- ZD55治疗后,测量肿瘤生长体积,免疫印迹法检测肿瘤组织E1A蛋白的表达,TUNEL法检测肿瘤组织凋亡,免疫组化法检测EIA、Bcl -2、BAX蛋白的表达.结果:Ki67- ZD55组的肿瘤生长速度明显慢于PBS组和ZD55- EGFP组,肿瘤生长曲线显示Ki67 - ZD55具有抑制肿瘤生长的效果(P＜0.05);TUNEL检测显示Ki67- ZD55治疗组的凋亡指数明显高于PBS组(P＜0.05)和ZD55-EGFP组(P＜0.05);免疫组化显示Ki67 - ZD55组可以上调BAX、下调Bcl -2的表达.结论:Ki67 -ZD55可以明显抑制人A375黑素瘤细胞裸鼠移植瘤的生长.     

Ki67启动子调控的肿瘤增殖腺病毒对黑素瘤细胞的杀伤作用

目的：研究Ki67启动子调控增殖腺病毒Ki67-ZD55对黑素瘤A375细胞的杀伤作用。方法：将PBS、ZD55-EGFP和Ki67-ZD55分别作用于A375细胞。FIT—PCR法检测Ki67-promotermR—NA的表达;荧光显微镜观察Ki67-ZD55增殖过程;MTr法检测细胞存活率;WesternBlot法检测E1A蛋白及线粒体途径凋亡相关蛋白BAX、Bcl—XL、MCL-1和Caspase-3的表达。结果：RT—PCR检测结果显示Ki67-ZD55能够在A375细胞中表达Ki67-promoter序列;荧光显微镜观察结果显示Ki67-ZD55增殖明显;MTT结果表明Ki67-ZD55组对A375细胞的增殖具有明显抑制作用,抑制效果大于ZD55-EGFP组（P〈0．05）;WesternBlot法检测结果表明E1A、BAX的表达量增加,Bcl—XL、MCL-1的表达量均降低,Procaspase-3发生了明显剪切。结论：Ki67-ZD55能够明显抑制A375细胞增殖,促进A375细胞凋亡。     

RNAi沉默c-Met基因对黑素瘤A375细胞生物学行为的影响

目的探讨c-MetshRNA表达载体对人黑素瘤A375细胞增殖、侵袭能力的影响。方法以pGenesil-1质粒为载体,以c-Met为靶基因,构建shRNA表达载体,并将其转染至体外培养的人黑素瘤A375细胞中。倒置相差显微镜下观察经干扰后瘤细胞的形态学变化;采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法分别检测转染细胞c-Met基因和蛋白的表达水平;四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测转染后细胞的生长活力;Transwell小室法测定转染细胞体外侵袭能力。结果构建了pGenesil-1-c-MetshRNA重组质粒,并成功转染A375细胞。转染后A375细胞缩小,变圆。RT-PCR显示转染后c-Met mRNA的表达显著降低,以48h为著,下降近64%;Western blot证实转染后蛋白的表达下降近65%;MTT法显示细胞的活力降低为(68.25±4.4)%;Transwell小室测定转染细胞体外侵袭能力明显下降。结论 pGenesil-1-c-MetshRNA重组质粒明显下调c-Met在黑素瘤细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞增殖及其侵袭能力。     

BRAFV600E突变基因对人黑素瘤细胞侵袭能力影响的研究

目的 探讨BRAFV600E突变基因对黑素瘤细胞侵袭能力的影响。方法　用构建成功的质粒载体转染人黑素瘤细胞株A375，在体外干扰BRAFV600E突变基因，用Transwell小室检测肿瘤细胞侵袭能力，用明胶酶法检测基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的变化，采用RT-PCR和Western印迹检测MMP-2和血管内皮细胞生长因子（VEGF）mRNA和蛋白表达。结果　特异性短发卡RNA抑制人黑素瘤细胞MMP-2和VEGF mRNA和蛋白的表达，MMP-2 mRNA和蛋白表达分别减少35%和80%，VEGF则减少45%和14%。转染特异性质粒的黑素瘤细胞穿过Metrigel的数目下降69%。结论 BRAFV600E突变增强黑素瘤细胞的侵袭能力，特异性shRNA可以使瘤细胞的侵袭性下降。     

PKCI-1/HINT1表达质粒的构建及其对黑素瘤A375细胞凋亡及自噬影响的初步研究

目的 构建人PKCI-1/HINT1基因的真核表达质粒,研究其在人黑素瘤A375细胞株中的表达并检测其对A375细胞凋亡及自噬的影响.方法 以人黑素瘤细胞A375的总RNA为模板,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增PKCI-1/HINT1基因序列,将PKCI-1/HINT1基因克隆到真核表达载体PCDNA3.1(+)中,构建PCDNA3.1(+)-PKCI-1/HINT1重组体.将PCDNA3.1(+)-PKCI-1/HINT1表达载体瞬时转染黑素瘤A375细胞,RT-PCR及Western印迹检测PKCI-1/HINT1在细胞内的表达,并以PCDNA3.1(+)空载体转染细胞作为相应对照组.噻唑蓝(MTT)检测PKCI-1/HINT1转染后细胞的增殖变化,Hoechest 33258染色检测细胞凋亡,采用绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3(GFP-LC3)标记结合激光共聚焦显微镜法检测PKCI-1/HINT1对细胞自噬的的影响,并通过Western印迹检测PKCI-1/HINT1对细胞内caspase 3及自噬相关蛋白beclin1蛋白表达的影响.结果 PCDNA3.1 (+)-PKCI-1/HINT1真核表达载体经酶切及测序鉴定构建成功,并能够在细胞内有效表达.MTT检测发现PKCI-1/HINT1能够明显抑制A375细胞的增殖,与PCDNA3.1(+)对照组相比,在48 h,72 h及96 hPCDNA3.1 (+)-PKCI-1/HINT1组活细胞数分别减少17.0％,25.6％、29.4％,差异有统计学意义(均P＜0.05).Hoechest 33258染色显示PKCI-1/HINT1可促进A375细胞内凋亡小体形成.激光共聚焦显微镜发现PKCI-1/HINT1的过表达可使A375细胞内GFP-LC3B的点状聚集增加.Western印迹发现,PKCI-1/HINT1可促进细胞内caspase 3及beclin1蛋白表达.结论 成功构建真核表达载体PCDNA3.1 (+)-PKCI-1/HINT1并在细胞内有效表达PKCI-1/HINT1.PKCI-1/HINT1的高表达可以抑制A375细胞增殖,促进其凋亡,同时可引发A375细胞的自噬过程.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.