抑癌基因DKK3过表达抑制人皮肤黑素瘤细胞迁移和侵袭的机制探讨

目的 探讨DKK3 在人皮肤恶性黑素瘤细胞及组织中的表达及转染DKK3对人黑素瘤细胞A375迁移与侵袭的影响。方法 通过Western印迹法分析DKK3在人黑素瘤细胞系（HM、A375、WM451、SK?MEL?1、Hs?695T、MDA?MB?435s、WM35）及色素痣细胞中的表达,实时荧光定量PCR检测2014 年8月至2017年6月在重庆市中医院皮肤科收集的58例恶性黑素瘤（包括原发性黑素瘤与转移性黑素瘤）和30例色素痣组织中DKK3 mRNA的相对表达水平。分别转染pcDNA3.1（+）?Flag?Vector质粒（对照组）和pcDNA3.1（+）?Flag?DKK3 质粒（转染组）至恶性黑素瘤 A375 细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western印迹法验证 DKK3 的过表达,及DKK3过表达对黑素瘤细胞迁移和侵袭相关的分子表达水平的影响;通过细胞平板划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验分析DKK3对A375细胞迁移及侵袭的影响。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,两独立样本间的比较采用t检验;多组数据的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD?t检验。结果 DKK3蛋白在人黑素瘤细胞系中表达缺失或低表达,在色素痣组织中高表达。原发性黑素瘤、转移性黑素瘤与色素痣中DKK3 mRNA表达水平（2?ΔΔCt）分别为（0. 325 ± 0.150） × 10?3、（0. 142 ± 0.210） × 10?3、（0. 634 ± 0.120） × 10?3,差异有统计学意义（F = 46.57,P < 0.05）,转移性黑素瘤表达水平低于原发性黑素瘤和色素痣 （LSD?t分别为2.48、3.12,均P < 0.05）。A375 细胞转染DKK3后,细胞划痕迁移率（22.11% ± 5.11%）低于对照组（54.36% ± 23.22%）（t = 2.36,P < 0.001）;迁移及侵袭实验中,转染组穿出小室细胞数（265 ± 33、76 ± 18）低于对照组（429 ± 41、135 ± 21）,差异有统计学意义（t值分别为1.24、1.35,均P < 0.001）。转染组A375细胞过表达DKK3后,上皮钙黏着蛋白和mRNA表达上升,神经钙黏着蛋白、波形蛋白、基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP7、MMP11蛋白和mRNA的表达下降。结论 DKK3在黑素瘤细胞系和组织中表达下调,DKK3过表达后A375 细胞的迁移和侵袭受到明显抑制,DKK3可能是抑制皮肤恶性黑素瘤转移的靶点。     

淫羊藿素联合达拉菲尼抑制黑素瘤增殖和转移

目的探讨淫羊藿素联合达拉菲尼对人黑素瘤A375细胞增殖和转移的抑制作用及可能的机制。方法采用不同浓度淫羊藿素和达拉菲尼单独及联合作用于A375细胞;CCK-8法检测细胞生长抑制率,进行协同性分析;Transwell和划痕实验检测细胞迁移和侵袭能力;qPCR及Westernblot检测MMP-2、MMP-9、Vimentin和E-cadherin的表达情况。结果淫羊藿素和达拉菲尼均能下调A375细胞MMP-2、MMP-9和Vimentin的表达,上调E-cadherin的表达,抑制其增殖、迁移和侵袭,且两药低浓度联合具有协同效应。结论淫羊藿素能协同达拉菲尼抑制A375细胞MMP-2、MMP-9和Vimentin的表达,促进E-cadherin的表达,抑制黑素瘤细胞的增殖和转移。     

过表达Beclin1可促进黑色素瘤A375细胞的自噬并抑制其上皮间质转化

 目的 探讨Beclin1的过表达对黑色素瘤A375细胞自噬及EMT过程的影响。方法 采用脂质体转染法将人恶性黑色素瘤细胞A375分为3组,分别为空白组（只转染试剂,无质粒）、NC组（转染空质粒）、转染组（转染携带Beclin1质粒）,3组细胞分别接种于3组裸鼠皮下,观察成瘤后21 d各组移植瘤的生长情况。采用RT-PCR和Western blotting分别检测各组肿瘤组织中Beclin1、LC3Ⅱ、Vimentin、N-cadherin和E-cadheirn mRNA及蛋白表达水平。结果 3组接种A375细胞的裸鼠成瘤率100%,转染组肿瘤生长速度低于空白组和NC组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;RT-PCR结果显示,空白组与NC组比较,各基因mRNA的表达无明显差异（P＞0.05）;相对于空白组与NC组,转染组Beclin1、LC3Ⅱ和E-cadherin的mRNA表达均升高,Vimentin和N-cadherin的mRNA表达均降低,差异具有统计学意义（均P＜0.05）。Western blotting结果显示,空白组与NC组比较,各基因蛋白的表达无明显差异（P＞0.05）;相对于空白组与NC组,转染组Beclin1、LC3Ⅱ和E-cadherin蛋白表达均明显升高,Vimentin和N-cadherin蛋白表达均明显降低,差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。结论Beclin1的过表达可促进黑色素瘤细胞发生自噬,并抑制其EMT过程。     

肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞A375生物学行为的影响

目的 探讨肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。 方法 取对数生长期人单核细胞株U937,采用佛波酯诱导48 h后,分为3组, Mφ组（继续用佛波酯诱导48 h）、M1组（用25 mg/L LPS诱导48 h）、M2组（用15 μg/L IL-4诱导48 h）。酶联免疫吸附试验检测各组巨噬细胞上清中IL-12p70和IL-10表达水平。建立巨噬细胞与恶性黑素瘤A375细胞体外共培养体系,分别设单独培养组、Mφ组（A375细胞和Mφ巨噬细胞共培养）、M1组（A375细胞和M1型巨噬细胞共培养）、M2组（A375细胞和M2型巨噬细胞共培养）,分别运用噻唑蓝法、Transwell小室法观察不同激活途径的巨噬细胞对A375细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的影响。 结果 增殖实验显示,共培养48、72 h后Mφ巨噬细胞、M2型巨噬细胞显著促进A375细胞的增殖,M1型巨噬细胞抑制A375细胞的增殖,各处理组间两两比较,差异有统计学意义（均P < 0.05）,共培养24 h后各组间两两比较A375细胞增殖率差异无统计学意义（P > 0.05）。侵袭实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（147.00 ± 7.92、113.22 ± 8.15）较单独培养组（84.11 ± 6.07）明显增加（P < 0.05）,M1组穿膜细胞（56.44 ± 7.55）明显减少（P < 0.05）。迁移实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（198.33 ± 8.22、156.00 ± 8.83）较单独培养组（123.89 ± 7.01）明显增加（均P < 0.05）,M1组穿膜细胞（97.11 ± 6.75）明显减少（P < 0.05）。 结论 IL-4激活的M2型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起促进作用;脂多糖激活的M1型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起抑制作用。佛波酯诱导的巨噬细胞更倾向于M2型巨噬细胞表型。     

过表达RhoD对人黑素瘤A375细胞骨架和迁移侵袭的影响

目的：探讨RhoD对人黑素瘤细胞株A375细胞骨架、迁移和侵袭能力等的影响及作用机制。方法实验分为A375?RhoD组和A375?增强型绿色荧光蛋白（EGFP）组，分别用携带RhoD的慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体转染。罗丹明标记鬼笔环肽染色观察细胞骨架，Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力，流式细胞仪检测细胞周期，Western印迹法检测丝切蛋白、磷酸化丝切蛋白、Diaph2和RhoD的表达。结果与A375?EGFP组细胞相比，A375?RhoD组细胞体积增大，应力纤维变细，软弱无力，黏着斑增多；丝状伪足形成增加；皱褶缘和板状伪足无明显变化。Transwell迁移实验显示，A375?EGFP组和A375?RhoD组平均每200倍视野下穿膜细胞数分别为152.67±11.23和72.67±5.03，两组间差异有统计学意义（t =11.25，P <0.05）。Transwell人工基底膜侵袭试验显示，A375?EGFP组和A375?RhoD组平均每200倍视野下穿膜细胞数分别为78.33±12.34和9.00±1，两组间差异有统计学意义（t=9.70，P<0.05）。A375?EGFP和A375?RhoD两组间G1期、S期和G2期细胞所占百分比差异均无统计学意义（P>0.05）。Western印迹结果显示，A375?RhoD组细胞可在RhoD的刺激下激活下游信号效应分子Diaph2，促进其表达，而A375?EGFP组未能激活，两组间丝切蛋白和磷酸化丝切蛋白表达差异不显著。结论 RhoD过表达可能通过下游效应分子Diaph2调节细胞骨架进而抑制A375细胞的迁移和侵袭能力。     

丹参酮ⅡA对雷帕霉素诱导自噬M2巨噬细胞共培养的皮肤黑素瘤A375细胞EMT的影响

 

目的 通过建立肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）自噬水平改变对与之共培养的A375细胞的体系,进一步明确TAMs自噬在调控A375细胞上皮间质转化（EMT）及迁移侵袭过程中的作用。 方法 用PMA和IL-4相继作用于人单核细胞THP-1 72 h诱导其成M2型,流式细胞术及免疫荧光检测鉴定M2表面CD68、CD204、CD206等标志性分子表达情况,鉴定TAMs极化效率。用自噬调节剂雷帕霉素干预TAMs（M2） 24 h,去除自噬调节药物的干预48 h后,通过蛋白免疫印迹方法以及免疫荧光检测各组细胞LC3-Ⅱ和Beclin-1表达,确定药物干预后的TAMs自噬水平。将雷帕霉素干预后的TAMs与人黑素瘤A375细胞进行非接触共培养,48 h后加入不同浓度TanⅡA 1 mg/L（低浓度）组、4 mg/L(高浓度）组,继续培养48 h后,Western blot检测A375细胞EMT相关因子的表达,并通过transwell检测A375细胞的侵袭和迁移能力。 结果 人单核细胞THP-1经PMA和IL-4先后作用共72 h后,细胞状态由半悬浮变为贴壁,经流式细胞术、免疫荧光检测发现M2表面CD68、CD204、CD206的表达较M0组明显增强,差异具有统计学意义(均P<0.05)。用自噬调节剂雷帕霉素干预TAMs 24 h后,免疫荧光、Western blot检测显示,LC3-Ⅱ及Beclin-1的表达明显上调,差异具有统计学意义(均P<0.05)。TAMs和A375细胞非接触共培养48 h后,不同浓度的TanⅡA作用于细胞,Western Blot检测显示,相对于空白组,TanⅡA低浓度组和高浓度组Beclin1、LC3-Ⅱ和E-cadherin蛋白表达均显著升高,N-cadherin蛋白表达均显著降低,组间差异均具有统计学意义（均P<0.05）。transwell实验显示,TanⅡA低浓度组和TanⅡA高浓度组处理后的A375细胞,其迁移、侵袭能力均有所下降,组间差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论 雷帕霉素可以诱导TAMs发生自噬,TanⅡA可以抑制自噬TAMs与之共培养的黑素瘤A375细胞的EMT过程,从而抑制其侵袭和转移。

     

丹参酮ⅡA对黑素瘤细胞侵袭迁移能力的抑制作用及机制

目的 探讨丹参酮ⅡA对黑素瘤A375细胞侵袭转移的作用及趋化因子受体7(CXCR7)基因与蛋白表达的影响.方法 体外培养黑素瘤A375细胞,经1、2、4mg/L丹参酮ⅡA处理48 h后,细胞划痕实验和Transwell细胞体外侵袭实验分别测定细胞迁移和侵袭能力,实时荧光定量PCR和Western印迹分别检测A375细胞CXCR7 mRNA和蛋白的表达水平.结果 1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA处理A375细胞48 h后,Transwell细胞体外侵袭实验显示,每高倍(×200)视野下迁移穿过聚碳酸酯膜的细胞数分别为71.00±4.00、51.00±2.00、37.00±3.61,而细胞划痕实验显示,细胞迁移数分别为301±3.00、253.00±3.61、126.00±7.00,均显著低于对照组(105.33±6.51、332.00±6.24,均P＜0.05),且丹参酮ⅡA对A375细胞侵袭、迁移能力的抑制作用随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强(均P＜0.05).实时荧光定量PCR及Western印迹显示,1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA组CXCR7 mRNA的相对表达量分别为0.63±0.04、0.44±0.02、0.31±0.01,蛋白表达水平分别为0.573±0.015、0.416±0.011、0.260±0.055,均显著低于对照组(1.00±0.02、0.9000±0.010,均P＜0.05),且丹参酮ⅡA对A375细胞CXCR7 mRNA和蛋白表达的抑制能力随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强(均P＜0.05).结论 丹参酮ⅡA可通过下调CXCR7表达抑制黑素瘤A375细胞的侵袭迁移能力.     

沉默ATAD3A对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制研究

【摘要】 目的 探讨沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法 2019年8 - 12月在重庆市渝北区人民医院收集经病理确诊的3例黑素瘤患者的黑素瘤组织及癌旁组织 ，应用Western印迹检测ATAD3A在上述组织中的表达。分别采用沉默ATAD3A慢病毒和空载慢病毒感染黑素瘤A375细胞系，构建沉默ATAD3A（shATAD3A）实验组和空载对照（shCtrl）组，经实时荧光定量聚合酶链反应（qRT?PCR）和Western印迹验证干扰效率。采用CCK?8实验、克隆形成实验比较两组细胞的增殖能力和克隆形成能力，采用Transwell细胞侵袭实验、划痕实验比较两组细胞的侵袭、迁移能力，采用Western印迹检测两组细胞自我更新相关蛋白（NANOG、SOX2、OCT4）和侵袭、迁移相关蛋白［基质金属蛋白酶2（MMP2）、波形蛋白、SLUG］的表达水平。两组间各指标的比较采用独立样本t检验。结果 Western印迹显示，相对于癌旁组织，ATAD3A在3例黑素瘤组织中高表达（t = 10.825，P < 0.001）。qRT?PCR和Western印迹显示，shATAD3A组A375细胞ATAD3A mRNA为0.230 ± 0.073，shCtrl组为1.000 ± 0.244，两组比较，t = 9.461，P < 0.001，蛋白表达水平分别为0.279 ± 0.267和0.867 ± 0.115，t = 8.595，P = 0.002， 表明成功构建沉默ATAD3A的黑素瘤A375细胞系。克隆形成实验和CCK?8实验显示，shATAD3A组克隆形成率低于shCtrl组（22.667% ± 2.510%比43.667% ± 5.030%，t = 6.464，P = 0.003），且细胞增殖活性自第2天开始直至第4天均显著低于shCtrl组。划痕实验及Transwell细胞侵袭实验显示，与shCtrl组相比，shATAD3A组划痕愈合减慢，划痕愈合率自第12 h开始（32.920% ± 4.642%比49.302% ± 1.448%，t = 5.835，P = 0.004）至24 h明显降低，通过Transwell小室下室的侵袭细胞数减少（68.330 ± 13.050比234.330 ± 19.139，t = 12.411，P < 0.001）。Western印迹显示，shATAD3A组细胞NANOG、SOX2、OCT4、MMP2、波形蛋白、SLUG的表达水平均显著下降（P < 0.05或0.001）。结论 ATAD3A在黑素瘤组织中高表达，沉默ATAD3A能抑制黑素瘤A375细胞的增殖、侵袭和迁移能力。     

lncRNA DLX6-AS1通过靶向miR-16-5p/NUCKS1调控皮肤鳞状细胞癌细胞A431增殖、迁移和侵袭

【摘要】 目的 研究长链非编码生长停滞特异性蛋白6反义RNA1（lncRNA DLX6-AS1）对皮肤鳞状细胞癌细胞A431增殖、迁移和侵袭的影响及潜在机制。方法 以双荧光素酶报告系统实验验证lncRNA DLX6-AS1与miR-16-5p、miR-16-5p与核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1（NUCKS1）mRNA的靶向结合。通过单独或联合转染lncRNA DLX6-AS1抑制物（si-DLX6-AS1）、miR-16-5p抑制物（anti-miR-16-5p）、NUCKS1抑制物（si-NUCKS1）和相应对照（DLX6-AS1-NC、anti-miR-NC、NUCKS1-NC）调控A431细胞目的基因的表达，采用qRT-PCR 检测A431细胞lncRNA DLX6-AS1、miR-16-5p、NUCKS1 mRNA的表达；Western印迹检测NUCKS1、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）抗体、基质金属蛋白酶（MMP）2和MMP9蛋白水平；CCK8实验检测细胞存活率；Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。两组间比较采用独立样本t检验。结果 双荧光素酶报告系统实验显示，lncRNA DLX6-AS1靶向结合miR-16-5p，miR-16-5p靶向结合NUCKS1。si-DLX6-AS1组A431细胞miR-16-5p表达水平（3.01 ± 0.31）高于DLX6-AS1-NC组（1.02 ± 0.10，t = 18.33，P < 0.001）；NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对水平均低于DLX6-AS1-NC组（均P < 0.05），细胞存活率、迁移和侵袭细胞数亦低于DLX6-AS1-NC组（均P < 0.05）。si-NUCKS1组A431细胞NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对水平均低于NUCKS1-NC组（均P < 0.05），细胞存活率、迁移和侵袭细胞数亦低于NUCKS1-NC组（均P < 0.05）。低表达lncRNA DLX6-AS1后，anti-miR-16-5p组A431细胞miR-16-5p表达（0.34 ± 0.04）低于anti-miR-NC组（1.00 ± 0.12，t = 15.65，P < 0.05），Cyclin D1、MMP2和MMP9相对表达水平均高于anti-miR-NC组（均P < 0.05），细胞存活率、迁移和侵袭细胞数均高于anti-miR-NC组（均P < 0.05）。低表达lncRNA DLX6-AS1、敲减miR-16-5p后，si-NUCKS1组A431细胞NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对水平均低于NUCKS1-NC组（P < 0.05），细胞存活率、迁移和侵袭细胞数均低于NUCKS1-NC组（P < 0.05）。结论 lncRNA DLX6-AS1可通过靶向miR-16-5p/NUCKS1调控A431细胞增殖、迁移和侵袭，lncRNA DLX6-AS1可能是治疗皮肤鳞状细胞癌的潜在分子靶点。     

CXCR7在常见皮肤恶性肿瘤及其细胞株中的表达及意义

目的 探讨趋化因子受体CXCR7在皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌、侵袭性皮肤黑素瘤及其细胞株中的表达及其意义。方法 收集30例皮肤鳞状细胞癌、25例基底细胞癌、30例皮肤黑素瘤的癌组织,采用免疫组织化学方法,检测CXCR7蛋白表达水平。采用RT-PCR、细胞免疫组化方法检测CXCR7在A375、M14、A431、HaCaT细胞株中mRNA及蛋白水平。结果 CXCR7在侵袭性皮肤黑素瘤中表达明显,高表达率为80%（24/30）,皮肤鳞状细胞癌及基底细胞癌分别为26.67%（8/30）、8%（2/25）;皮肤黑素瘤CXCR7高表达率与鳞状细胞癌、基底细胞癌比较,差异均有统计学意义（χ2值分别为17.16和28.36,P值均 < 0.05）。CXCR7 mRNA在A375、M14、A431细胞株中均可检出,其中A375表达最强,而HaCaT细胞不表达;细胞免疫组化显示,仅在A375细胞见棕黄色颗粒着色。结论 皮肤黑素瘤及其细胞株A375高表达CXCR7,其可能参与了其恶性侵袭与转移。     

全反式维A酸对恶性黑素瘤A375细胞上皮-间质转化相关分子表达的影响

【摘要】 目的 研究全反式维A酸（ATRA）对人恶性黑素瘤A375细胞中上皮-间质转化（EMT）相关分子表达的影响。方法 用含10 μmol/L ATRA的DMEM培养基和DMEM培养基分别处理A375细胞24和48 h作为ATRA-1组和ATRA-2组、对照1组和对照2组,采用实时定量PCR法检测EMT相关基因上皮钙黏着蛋白、神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白mRNA的表达。Western印迹法检测ATRA-1组、ATRA-2组、对照1组中上述蛋白的相对表达量,直接免疫荧光法检测上皮钙黏着蛋白和波形蛋白的荧光强度。统计分析采用两因素方差分析、单因素方差分析及LSD-t检验。结果 ATRA-1组和ATRA-2组分别与对照1组和对照2组相比,上皮钙黏着蛋白mRNA的表达均显著增加（F = 13.148、31.529,P < 0.05）,而神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白mRNA的表达均显著降低（均P < 0.05）;ATRA-2组上皮钙黏着蛋白mRNA的表达显著高于ATRA-1组（F = 13.148,P < 0.05）,而其他3种蛋白mRNA的表达显著低于ATRA-1组（均P < 0.05）;对照1组与对照2组上述蛋白的mRNA表达差异无统计学意义（均P > 0.05）。Western印迹法显示,与对照1组相比,ATRA-1组和ATRA-2组上皮钙黏着蛋白表达上调,而神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达均下调（均P < 0.05）;与ATRA-1组相比,ATRA-2组上皮钙黏着蛋白表达上调（P < 0.05）,神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达下调（均P < 0.05）。直接免疫荧光显示,ATRA-1组、ATRA-2组上皮钙黏着蛋白的荧光强度（6.23 ± 0.08、10.37 ± 0.13）显著高于对照1组（2.37 ± 0.14,均P < 0.05）,而波形蛋白的荧光强度（15.17 ± 0.18、10.29 ± 0.03）显著低于对照1组（50.16 ± 0.26,均P < 0.05）,抑制上皮向间质转化。结论 ATRA可上调A375细胞中上皮钙黏着蛋白的表达,降低神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白的表达,可能抑制A375细胞发生EMT现象。     

内皮素3对恶性黑素瘤A375细胞上皮基质转化的影响

目的 研究内皮素-3（ET-3）对人恶性黑素瘤（MM）A375细胞上皮基质转化（EMT）的影响。方法 体外培养A375细胞,分别设立3组：空白对照组、100 nmol/L ET-3组、100 nmol/L ET-3和100 μmol/L BQ788（内皮素受体B阻断剂）组。采用Transwell小室检测细胞转移,细胞爬片技术检测细胞形态变化,实时PCR和Western印迹检测上皮基质转化相关分子上皮细胞钙黏蛋白、波形蛋白及转录因子（Twist、 Slug）表达情况,使用方差分析及Scheffe法对结果进行分析。结果 各干预条件中,与空白对照组比较,ET-3可以促进A375细胞的转移,BQ788可阻断该效应（3组穿膜细胞数分别为4.200 ± 0.837、9.400 ± 0.548、3.400 ± 0.894,F = 88.44,P < 0.01）;ET-3 可以促进A375细胞由上皮型向成纤维细胞样形态转变,促进A375上皮细胞钙黏蛋白表达下调（3组分别为0.330 ± 0.002、0.280 ± 0.007、0.420 ± 0.008,F = 329.98,P < 0.01）,波形蛋白表达上调（0.830 ± 0.014、1.160 ± 0.003、0.750 ± 0.030,F = 262.94,P < 0.01）,而BQ788可阻断这种效应。ET-3可以促进上皮基质转化相关转录因子Slug mRNA（F = 376.94,P < 0.01）及Twist mRNA（F = 215.62,P < 0.01）及其蛋白水平（FSlug = 288.87,P < 0.01;FTwist = 156.96,P < 0.05）上的表达上调。结论 ET-3/ETRB通过上调波形蛋白,下调上皮细胞钙黏蛋白的表达,并上调转录因子（Twist、 Slug）的表达,促进黑素瘤A375细胞上皮基质转化。     

罗格列酮对人黑素瘤细胞株A375体外侵袭能力的抑制及相关机制

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）配体罗格列酮对人黑素瘤细胞体外侵袭能力的影响及机制。方法 体外培养人黑素瘤细胞株A375;噻唑蓝法（MTT）检测罗格列酮对A375细胞的增殖抑制率;RT-PCR、Western印迹检测罗格列酮对黑素瘤侵袭相关基因基质金属蛋白酶2（MMP2）、组织金属蛋白酶抑制剂2（TIMP2）表达的影响。Matrigel侵袭实验检测罗格列酮对黑素瘤细胞体外侵袭能力的影响。结果 MTT结果显示,在24 h干预点,罗格列酮浓度为10、25 μmol/L 时,对A375细胞增殖抑制率分别为（4.86 ± 0.31）%、（5.15 ± 0.52）%,细胞毒性作用不明显。罗格列酮能在mRNA和蛋白水平下调MMP2的表达（P < 0.01）,并上调TIMP2 mRNA的表达（P < 0.01）。侵袭实验显示,对照组、10 μmol/L罗格列酮组、25 μmol/L罗格列酮组穿过Transwell小室膜的A375细胞数依次为210.7 ± 14.9,154.1 ± 7.7,87.3 ± 8.1,差异有统计学意义（P < 0.01）。结论 罗格列酮能抑制人黑素瘤细胞株A375的转移,可能与其下调MMP2的表达有关。     

泛素结合酶2S在恶性黑素瘤中的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响

【摘要】 目的 探讨恶性黑素瘤（MM）组织中泛素结合酶2S（UBE2S）的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响。方法 应用免疫组化检测UBE2S在128例原发性MM、64例转移性MM、16份非瘤组织（8份瘤旁组织、8份正常表皮组织）芯片中的表达。实时定量PCR检测A375、MUM?2B及MUM?2C黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。将黑素瘤A375及MUM?2B细胞株分别分为两组,干扰组使用含有UBE2S RNA干扰序列的慢病毒转染,对照组使用含有对照序列的慢病毒转染, 72 h后实时定量PCR检测 A375和MUM?2B黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。用试剂盒检测各组细胞caspase3/7活性,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率及周期分布;应用Transwell法及Western印迹分别检测敲减UBE2S对A375细胞迁移侵袭能力及N-钙黏蛋白表达的影响。使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,正态分布数据组间比较采用独立样本t检验,计数资料采用卡方检验,非正态分布数据比较采用Mann?Whitney U检验,通过Spearman系数评估UBE2S表达水平与T分期的相关性。结果 UBE2S在98例（51.0%）MM组织中高表达,16例非瘤组织中均低表达,两组间高表达率差异有统计学意义（χ2 = 11.905,P＜0.01）;UBE2S表达水平与肿瘤T分期呈负相关（ρ = -0.210,P = 0.043）。A375、MUM?2B、MUM?2C细胞间UBE2S mRNA相对表达量差异有统计学意义（F = 817.228,P＜0.01）。Caspase3/7活性在干扰组A375细胞（t = 17.572,P＜0.01）与干扰组MUM?2B细胞（t = 24.552,P＜0.01）分别较相应对照组明显增加;干扰组A375细胞较对照组G1期细胞比例明显升高（t = 7.365,P＜0.01）,而S期比例明显降低（t = -9.190,P＜0.01）,G2/M期无明显变化（t = -0.227,P＞0.05）;干扰组MUM?2B细胞G1期（t = 12.676,P＜0.01）、G2/M期（t = 13.045,P＜0.01）细胞比例高于对照组,但S期比例低于对照组（t = -15.718,P＜0.01）。Transwell实验显示,干扰组较对照组A375细胞迁移（t = -35.727,P＜0.05）及侵袭（t = -125.000,P＜0.01）能力降低。Western印迹检测显示,干扰组较对照组A375细胞N-钙黏蛋白表达下调。结论 UBE2S在黑素瘤组织过表达,其表达水平与肿瘤分期相关;敲减UBE2S对黑素瘤细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移及侵袭能力均有影响,并且可能通过调控N-钙黏蛋白表达促进MM细胞转移。     

基质金属蛋白酶7在恶性黑素瘤中的表达

目的 探讨基质金属蛋白酶7（MMP7）的表达与恶性黑素瘤浸润、转移的关系。方法 采用免疫组化SP法研究MMP7在恶性黑素瘤（30例）、交界痣（30例）、正常人皮肤（15例）组织中的表达，并观察其在恶性黑素瘤A375细胞株和不同浓度乙酰肝素酶反义寡核苷酸转染的裸鼠体内恶性黑素瘤移植瘤中的表达情况。结果 MMP7在恶性黑素瘤组、交界痣组及正常人皮肤组中的阳性表达率分别为83.33%（25/30）、6.67%（2/30）和0，恶性黑素瘤组与交界痣组MMP7的阳性表达率比较，χ2 = 35.62，P < 0.01；交界痣组与正常人皮肤组比较，差异无统计学意义。10、20、30 μmol/L乙酰肝素酶反义寡核苷酸对裸鼠体内恶性黑素瘤移植瘤MMP7表达表现出不同程度的抑制作用，30 μmol/L组的抑制作用最强，与其他2个组相比，差异均有统计学意义（P < 0.05）。MMP7在A375细胞株中呈强阳性表达。结论 MMP7在恶性黑素瘤中的表达明显高于其在交界痣和正常人皮肤；乙酰肝素酶反义寡核苷酸对裸鼠体内恶性黑素瘤移植瘤中MMP7的表达有显著抑制效应；MMP7在A375细胞株中呈强阳性表达。     

整合素β8在恶性黑素瘤细胞增殖及侵袭中的作用

目的:明确整合素β8(ITGB8)在恶性黑素瘤侵袭转移中的作用。方法:Transwell侵袭实验在黑素瘤细胞系A375中获得侵袭性癌细胞和相对静止性癌细胞,RT-PCR比较两者整合素家族的表达。流式分选ITGB8细胞,比较其侵袭能力的差异。使用siRNA敲除技术敲低ITGB8,敲低效率分别为:si1组50%,si2组70%,si3组80%,比较其增殖、侵袭能力的变化。Western bolt检测细胞周期蛋白、基质金属蛋白酶及EMT相关分子的表达变化,提取细胞核蛋白比较细胞核内β-catenin的变化。利用TCF4的启动子报告质粒检测Wnt/β-catenin信号通路的激活情况。结果:ITGB8在侵袭性癌细胞中高表达,是静止性癌细胞的5倍(P0.01);ITGB8阳性组侵袭细胞数为516±45,阴性组为120±22,差异有显著性(P0.01);与Mock组细胞相比,si2和si3组细胞的增殖速度明显减弱(P0.01),敲低后细胞阻滞在S期。与Mock细胞相比Cyclin D1、MMP2、MMP9、MMP7、Ncadherin、Vimentin在si2和si3细胞中的表达明显减少,Ecadherin明显增加。si2、si3细胞核内β-catenin相比Mock组明显减少(P0.05)。敲低ITBG8后TCF4的启动子活性明显降低。结论:ITGB8对恶性黑素瘤的增殖及侵袭转移具有重要作用,可能是通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。     

长链非编码RNA 068在黑素瘤细胞迁移中的功能研究

目的:探索长链非编码RNA（lncRNA）068对黑素瘤细胞系A375迁移的影响及潜在机制。方法:2015年12月至2020年11月在南通大学附属医院皮肤科门诊收集经病理确诊的皮肤黑素瘤患者21例,采用定量PCR（qPCR）检测其黑素瘤组织与相邻癌旁组织中lncRNA 068的表达。通过慢病毒转染在A375细胞中过表达...