Wnt/β-catenin信号通路对哮喘大鼠气道平滑肌细胞迁移能力的影响

目的探讨Wnt/β-catenin信号通路在哮喘大鼠气道平滑肌细胞中的表达及其对细胞迁移能力的影响。方法建立哮喘大鼠模型,原代培养大鼠气道平滑肌细胞(ASMC),采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot方法分别检测正常大鼠平滑肌细胞和ASMC中β-catenin信号通路mRNA和蛋白表达水平;采用Transwell迁移实验检测ASMCs的迁移能力,并分析应用β-catenin siRNA对其迁移能力的干预作用。结果 RT-PCR和Western blot结果显示哮喘大鼠ASMCs中β-catenin的mRNA和蛋白表达水平较对照组显著升高;β-catenin特异性siRNA能够降低ASMCs中β-catenin mRNA和蛋白表达水平;沉默β-catenin能够显著降低ASMCs的迁移能力。结论哮喘大鼠模型ASMCs的迁移能力显著增强,β-catenin信号通路的异常激活可能参与了这一生物学事件。     

HDAC1调控Wnt/β-catenin信号通路对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的:研究组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1)对乳腺癌细胞凋亡的影响及机制。方法:RT-qPCR和Western blot法分别测定正常乳腺上皮细胞系MCF-10A和乳腺癌细胞系BT549、MCF-7和MDA-MB-231中HDAC1的m RNA和蛋白水平。在MDA-MB-231细胞中转染HDAC1 si RNA,RT-qPCR和Western blot测定HDAC1的表达水平,MTT法测定细胞活力,流式细胞术测定凋亡,Western blot测定细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、c-Myc、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和cleaved caspase-3的蛋白水平。用Wnt/β-catenin信号通路激活剂处理下调HDAC1表达后的乳腺癌细胞,测定细胞活力和凋亡。结果:乳腺癌细胞系BT549、MCF-7和MDA-MB-231中HDAC1的m RNA和蛋白水平均明显高于正常乳腺上皮细胞系MCF-10A(P 0. 01),并且MDA-MB-231细胞中的HDAC1水平最高。HDAC1 si RNA可以降低乳腺癌细胞中HDAC1的m RNA和蛋白水平。敲减HDAC1表达后的MDA-MB-231细胞活力降低,细胞凋亡率升高,细胞中cleaved caspase-3水平升高,β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白水平降低(P 0. 05)。Wnt/β-catenin信号通路激活剂可以逆转HDAC1下调诱导的MDA-MB-231细胞凋亡和细胞活力降低,减少cleaved caspase-3的水平(P 0. 05)。结论:敲减HDAC1的表达可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活诱导乳腺癌细胞凋亡。     

Zeste基因增强子同源物2通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响脑胶质瘤细胞凋亡

目的:探讨zeste基因增强子同源物2(EZH2)通过调控Wnt/β-catenin信号通路对脑胶质瘤细胞凋亡的影响。方法:以RT-q PCR和Western blot检测胶质瘤U87、H4和U251细胞及正常人脑星形细胞(NHA)中EZH2的表达水平。在H4细胞中转染EZH2 siRNA和siRNA control,MTT测定细胞活力,流式细胞术测定细胞凋亡,分光光度计法检测caspase-3的活性,Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白β-连环蛋白(β-catenin)和下游靶分子c-Myc的蛋白表达。用Wnt/β-catenin信号通路激活剂处理转染EZH2 siRNA的H4细胞,流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot测定β-catenin和c-Myc的表达。结果:胶质瘤U87、H4和U251细胞中EZH2的mRNA和蛋白水平均明显高于NHA(P0.05),并且H4细胞中EZH2 mRNA和蛋白水平高于U87和U251细胞(P0.05)。EZH2 siRNA可以明显下调H4细胞中EZH2的mRNA和蛋白水平。EZH2表达下调后的H4细胞从48 h开始细胞活力降低,并且细胞凋亡率也明显升高,细胞中caspase-3活性也明显升高(P0.05),同时EZH2表达下调还可以抑制β-catenin和c-Myc的表达。Wnt/β-catenin信号通路的激活剂可以减少EZH2诱导的H4细胞凋亡,降低细胞中caspase-3的活性。结论:EZH2在脑胶质瘤细胞中过度表达,下调其表达可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活而诱导胶质瘤细胞凋亡。     

SCUBE2过表达通过Wnt/β-catenin抑制结直肠癌细胞上皮-间质转化

目的:研究信号肽-CUB-EGF结构域蛋白2(SCUBE2)对结直肠癌细胞上皮-间质转化(EMT)的影响及可能的分子机制。方法:首先,用real-time PCR与Western blot法检测人结直肠癌HCT116细胞和正常人结直肠上皮FHC细胞SCUBE2的表达;HCT116细胞转染GV144-SCUBE2质粒过表达SCUBE2后,MTT、Transwell和流式细胞术分别检测其对细胞活力、迁移和凋亡的影响。转染GV144-SCUBE2质粒6 h后加入10μg/L重组转化生长因子(TGF)-β1蛋白继续培养48 h,real-time PCR或者Western blot法检测EMT标志物[E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和Snail]、β-catenin、c-Myc和细胞周期蛋白(cyclin)D1的表达。随后,在HCT116细胞中使用Wnt/β-catenin通路激活剂氯化锂(Li Cl)或抑制剂XAV93920并加入TGF-β1且过表达SCUBE2,检测Wnt/β-catenin通路激活或阻断后对HCT116细胞EMT的影响。结果:HCT116细胞中SCUBE2的表达明显低于FHC细胞;过表达SCUBE2能够抑制HCT116细胞的活力与迁移,但是对其凋亡影响不大;SCUBE2增加了E-cadherin的表达,降低了TGF-β1诱导的vimentin、Snail、β-catenin、c-Myc和cyclin D1的表达,XAV93920增强了SCUBE2对EMT的影响,而Li Cl阻碍SCUBE2对EMT的影响。结论:过表达SCUBE2能够抑制结直肠癌细胞的生长与迁移,抑制其EMT的发生,这一过程可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥作用的。     

PRRX2通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进胃癌细胞活力和迁移

目的:研究配对相关同源框2(paired-related homeobox 2,PRRX2)基因对胃癌细胞活力和迁移能力的影响,并分析其调控Wnt/β-catenin信号通路的机制。方法:通过生物信息学分析在线数据库中胃癌和正常胃组织的PRRX2表达水平及PRRX2在胃癌组织中的表达与胃癌患者总生存率的相关性;将PRRX2小干扰RNA(si RNA)和过表达质粒分别转染到胃癌细胞MGC-803和SGC-7901中,敲低和过表达PRRX2基因;MTT法和Transwell实验检测胃癌细胞的活力和迁移能力;Western blot和TOPflash/FOPflash双萤光素酶报告基因实验检测Wnt/β-catenin信号通路的活化情况;免疫共沉淀实验检测PRRX2与β-catenin蛋白的相互作用。结果:敲低PRRX2能够减弱胃癌细胞MGC-803的活力和迁移能力(P0.05)。过表达PRRX2能够增强胃癌细胞SGC-7901的活力和迁移能力(P0.05),增加β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白的表达水平(P0.05),增强TOPflash/FOPflash双萤光素酶报告基因活性(P0.05)。PRRX2与β-catenin蛋白存在相互作用。结论:PRRX2可促进胃癌细胞的活力和迁移,其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。     

RARG对胃癌细胞活力和迁移能力的影响

目的:探讨视黄酸受体γ(retinoic acid receptor gamma,RARG)对胃癌细胞活力和迁移能力的影响及其机制。方法:采用生物信息学技术分析在线数据库中胃癌和正常胃组织的RARG表达水平及其与胃癌患者总生存率的相关性;利用过表达质粒转染和RNA干扰技术,在体外促进和抑制胃癌细胞中RARG的表达,并采用MTT和Transwell实验检测RARG对胃癌细胞活力和迁移能力的影响;通过Western blot和TOP/FOP双萤光素酶报告基因检测RARG对Wnt/β-catenin信号通路的调控;利用免疫共沉淀和免疫荧光共定位实验检测RARG与β-catenin蛋白的相互作用情况。结果 :过表达RARG能够增强胃癌细胞SGC7901的活力和迁移能力(P0.05),敲减RARG能够减弱胃癌细胞MGC-803的活力和迁移能力(P0.05)。同时,过表达RARG能够增加β-catenin、c-Myc、cyclin D1、Twist和Snail的蛋白表达水平(P0.05),以及TOP/FOP双萤光素酶报告基因活性(P0.05)。另外,RARG与β-catenin蛋白存在相互作用。结论 :RARG通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进胃癌细胞的活力和迁移能力,其基因在胃癌的发生发展中扮演着癌基因的角色。     

RNA干扰敲低GSK-3β对瘢痕疙瘩形成影响的体外研究

目的:利用RNA干扰技术探讨糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KFB)的抑制效果。方法:将针对人GSK-3β基因设计合成的3对特异性小干扰RNA(siRNA)分别转染体外培养的人KFB,通过RT-PCR和Western blot筛选出干扰人KFB GSK-3β基因表达的最佳siRNA,进而转染人KFB,并用RT-PCR和Western blot检测GSK-3β及相关蛋白的m RNA和蛋白表达。结果:1434序列具有最佳的GSK-3βm RNA和蛋白抑制效率。转染GSK-3βsiRNA后,KFB的β-catenin、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p-GSK-3β和Wnt2的蛋白水平下降,KFB活力下降,且随着培养时间的延长,细胞生长受抑制程度增大,细胞倍增时间明显延迟。结论:转染靶向GSK-3β的siRNA可有效降低该基因在KFB内的表达,从而抑制了瘢痕疙瘩生长,具有潜在的治疗前景。     

丙戊酸孤独症大鼠脑中经典Wnt信号通路的变化

 目的：探讨经典Wnt信号通路在孤独症发病中的作用。方法：利用丙戊酸孤独症大鼠模型,检测经典Wnt信号通路信号分子在孤独症大鼠前额叶皮质及海马脑区的表达。Western blotting法检测糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β）、磷酸化GSK-3β、β-catenin和磷酸化β-catenin表达,半定量RT-PCR法检测GSK-3β、β-catenin、c-Myc和cyclin D1 mRNA表达。结果：与对照组相比,在丙戊酸孤独症大鼠前额叶皮质及海马脑区,失活的GSK-3β磷酸化表达显著增加,抑制性的β-catenin磷酸化表达显著减少;GSK-3β mRNA表达减少,β-catenin mRNA表达增加,下游c-Myc和cyclin D1 mRNA表达增加。结论：前额叶皮质及海马中经典Wnt信号通路活性增加可能促进了机体对孤独症的易感性。     

干扰Yes相关蛋白表达调控Wnt/β-catenin信号通路影响膀胱癌细胞凋亡

目的:探讨干扰Yes相关蛋白(YAP)的表达对膀胱癌细胞凋亡的影响及机制。方法:以膀胱癌细胞T-24为研究对象,分为正常对照(control)组、siRNA阴性对照(siRNA-NC)组和YAP siRNA组。分别以real-time PCR和Western blot实验检测转染后各组细胞中YAP的mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测β-连环蛋白(β-catenin)和c-Myc表达水平。用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535处理YAP siRNA组细胞,并用MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:YAP siRNA组YAP的mRNA和蛋白水平均明显低于control组(P0.05)。YAP siRNA组的细胞活力及c-Myc和β-catenin水平均明显低于control组(P0.05),而细胞凋亡率明显高于control组(P0.05)。与未经FH535处理的YAP siRNA组细胞相比,YAP siRNA组的细胞经FH535处理后细胞活力明显下降,细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论:干扰YAP表达能够通过抑制Wnt/β-catenin信号通路激活而抑制膀胱癌细胞活力,并促进膀胱癌细胞凋亡。     

HSG通过Wnt/β-catenin通路抑制COPD大鼠气道成纤维细胞增殖

目的研究增殖抑制基因(HSG)在大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道重建中与Wnt/β-catenin信号传导通路的关系及其调控气道重建的机制。方法将大鼠随机分为对照组及COPD模型组,模型组采用气道内注射脂多糖加烟熏方法建立。HE染色鉴定COPD组织,测定气道管壁总面积/气道基底膜周长(WAt/Pbm)评价气道重建情况。组织块贴壁法培养大鼠气道成纤维细胞,real time-PCR检测成纤维细胞HSG和β-catenin mRNA表达。Western blot联合ELISA法检测HSG、β-catenin、GSK-3β、TGF-β1和MMP-9蛋白表达。分析HSG、β-catenin基因表达与TGF-β1和MMP-9细胞因子分泌的相关性。结果模型组大鼠小气道重建显著。COPD大鼠气道成纤维细胞中HSG mRNA和蛋白表达均低于对照组。β-catenin mRNA和蛋白表达均高于对照组,P-GSK-3β、TGF-β1和MMP-9蛋白表达也高于对照组。HSG mRNA的表达与β-catenin mRNA表达及与TGF-β1和MMP-9细胞因子分泌呈负相关。结论 HSG可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路,抑制大鼠气道成纤维细胞的增殖从而参与气道重建。     

糖尿病溃疡中Wnt/β-catenin信号通路表达的变化

目的:观察糖尿病(DM)溃疡中Wnt/β-catenin信号通路表达的变化,探讨该信号通路在糖尿病难愈性溃疡中的作用。方法:雌性Wistar大鼠采用高脂高糖饲料联合小剂量链脲佐菌素液腹腔注射法制备糖尿病模型。分别取正常对照组与DM组制作溃疡模型。观察创面造模后第3天、第7天和第14天对照组及DM组创面愈合情况的变化,并采用HE染色法检测创面组织形态结构的变化,采用ELISA法和RT-PCR法检测创面组织中β-catenin、GSK-3β和Rspo-3蛋白及mRNA的变化。结果:DM组大鼠的创面愈合率明显低于对照组(P0.05),且与对照组相比,其创面组织中含有较少的炎性细胞、纤维母细胞及新生毛细血管。DM组大鼠创面组织中β-catenin和Rspo-3蛋白及mRNA的表达水平均低于对照组,GSK-3β蛋白及mRNA的表达水平均高于对照组(P0.05)。结论:Wnt/β-catenin通路的下调有可能导致了糖尿病溃疡的难愈,而该通路的下调可能源自于Rspo-3蛋白表达的下降。     

盐酸水苏碱对实验性急性脑梗死大鼠的治疗作用

目的:观察盐酸水苏碱对实验性急性脑梗死大鼠的治疗效果,并探讨其可能作用机制。方法:将75只大鼠随机分为5组:假手术组、脑梗死组及不同剂量盐酸水苏碱治疗组,每组各15只。盐酸水苏碱治疗组大鼠在造模完成后分别给予盐酸水苏碱10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg灌胃,每天1次,连续给药14 d。给药完成后,对各组大鼠进行神经功能缺损评分,计算脑梗塞体积,干湿重法检测脑含水量,Western blot法检测脑组织中β-catenin、cyclin D1、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)和p-GSK-3β的蛋白水平。结果:与脑梗死组相比,盐酸水苏碱治疗后大鼠的神经功能缺损评分明显降低,脑梗死体积与脑含水量明显降低,β-catenin、cyclin D1和p-GSK-3β的蛋白水平明显升高。结论:盐酸水苏碱对实验性大鼠急性脑梗死具有一定的疗效,其机制可能与激活了Wnt/β-catenin信号通路有关。     

ILK siRNA对高糖刺激的人肾小管上皮细胞GSK-3β及β-catenin表达的影响*

 目的：探讨高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中整合素连接激酶小干扰RNA（ILK siRNA）对糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）磷酸化和β-连环蛋白（β-catenin）核内表达的影响及意义 。方法：体外培养人近端肾小管上皮细胞系HKC,分为正常对照组（NG）、高糖组（HG）、高糖＋阴性转染对照组 (HG+HK)和高糖＋ILK siRNA组(HG+ILK siRNA)。倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。RT-PCR及Western blotting检测ILK  mRNA及蛋白表达水平;免疫细胞化学检测磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）和β-catenin表达。Western blotting检测总GSK-3β、p-GSK-3β、核β-catenin、总β-catenin、E-钙黏蛋白（E-cadherin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平。结果：（1）倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,证实构建的siRNA重组质粒成功转染HKC细胞;（2）与HG和 HG+HK组相比,HG+ILK siRNA组ILK mRNA及蛋白水平下降,但较NG组表达仍高;（3）HG+ILK siRNA组ILK基因沉默后,p-GSK-3β与核β-catenin蛋白表达较HG及HG+HK组均下降,但较NG组表达仍高。而总GSK-3β与总β-catenin 在各组表达无明显差异。结论:ILK、GSK-3β和β-catenin可能参与了高糖介导的肾小管上皮细胞转分化过程。ILK可能通过调节Wnt/β-catenin途径下游效应蛋白GSK-3β和β-catenin的表达而促使肾小管上皮细胞转分化。     

舒林酸对丙戊酸孤独症动物模型大鼠氧化应激变化的影响

 目的:探讨舒林酸对孤独症发生过程中氧化应激变化的影响。方法: 利用丙戊酸（VPA）孤独症动物模型,检测经典Wnt信号通路特异性抑制剂舒林酸处理后经典Wnt信号通路及氧化应激标志物在孤独症模型大鼠前额叶皮质及海马脑区的表达变化。Western blotting法检测糖原合成激酶3β（GSK-3β）、β-catenin和4-羟基壬烯醛（4-HNE）表达,半定量RT-PCR法检测硫氧还蛋白（Trx）1和Trx2 mRNA表达。结果: 与对照组相比,在前额叶皮质及海马脑区VPA组GSK-3β蛋白表达减少,Trx1和Trx mRNA 表达减少,β-catenin与4-HNE的表达增加;而与VPA组相比,VPA与舒林酸同时处理组GSK-3β的表达显著增加,β-catenin和4-HNE的表达显著减少。结论: 舒林酸减少了孤独症发生过程中氧化应激的产生,提示经典Wnt信号通路上调导致氧化应激产生,进而导致孤独症易感性增加。