内抑制素和血小板因子-4对淋巴管内皮细胞生成的影响

目的寻找安全有效的淋巴管生成抑制剂。方法取猪的胸导管内皮细胞进行培养，进行光镜和电镜观察。设立对照组、内抑制素实验组和血小板因子-4（PF-4）实验组。应用刮线法和MTT法来判定这两种抑制因子对细胞有无抑制作用。结果应用刮线法对Endostatin、PF-4对照组与实验各组的细胞数及细胞游走距离进行比较，均P〈0．05。采用MTT法将内抑制素、PF-4对照组与实验各组吸光光度值相比较，均P〈0．05。结论内抑制素和PF-4对淋巴管内皮细胞的增殖和游走有明显的抑制作用，且有剂量依赖性。     

人参皂甙Rg3对淋巴管内皮细胞生成的影响

目的探讨人参皂甙Rg3[20(R)-Ginsenoside Rg3]对淋巴管内皮细胞迁移、增殖能力及凋亡的影响。方法用含不同浓度人参皂苷Rg3的培养液培养Hela细胞,收集培养上清并制备条件培养液(CM);取健康猪的胸导管内皮细胞进行分离、培养;Ⅷ因子、VEGFR-3抗体联合对淋巴管内皮细胞进行鉴定;通过划线刮除法和MTT法观察人参皂甙Rg3对淋巴管内皮细胞的迁移和增殖能力的影响;Hoechst33258荧光染色检测淋巴管内皮细胞凋亡。结果第Ⅷ因子和VEGFR-3抗体对培养的淋巴管细胞进行联合鉴定,为典型淋巴管内皮细胞;应用划线刮除法和MTT法对对照组与实验组进行比较显示:不同浓度的人参皂甙Rg3能够明显抑制淋巴管内皮细胞的增殖和游走,差异有统计学意义(P<0.01);Hoechst33258证实,经人参皂甙Rg3条件培养液处理后淋巴管内皮细胞,可观察到其核周围有凋亡小体。结论人参皂甙Rg3对淋巴管内皮细胞的迁移和增殖能力有明显的抑制作用,并且有剂量依赖性;人参皂甙Rg3能够诱导淋巴管细胞凋亡。     

血管生成抑制素和反应停对淋巴管内皮细胞生成的影响

目的：探讨血管生成抑制素和反应停对淋巴管内皮细胞增殖和游走的影响及作用机制。方法：淋巴管内皮细胞取自猪的胸导管。采用划线法和MTT法观察血管生成抑制素和反应停对淋巴管内皮细胞增殖和游走的影响。Hoechst染色检测细胞凋亡。结果．划线法和MTT法均显示血管生成抑制素和反应停对淋巴管内皮细胞的增殖和游走有明显的抑制作用。Hoechst染色证实,经血管生成抑制素和反应停处理后的淋巴管内皮细胞,核周围有凋亡小体。结论：血管生成抑制素和反应停对淋巴管内皮细胞的增殖和游走具有明显的抑制作用,且有剂量依赖性。血管生成抑制素和反应停具有促进细胞凋亡的作用。     

血小板反应素-1对猪胸导管内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨血小板反应素-1(thrombospondin-1,TSP-1)对淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cells,LECs)增殖和凋亡的影响。方法取健康猪的胸导管内皮细胞进行分离、培养;应用凝血因子VIII,血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)抗体联合对淋巴管内皮细胞进行鉴定;采用MTT法检测TSP-1对LEC的生长抑制作用;采用Hoechst33258荧光染色检测淋巴管内皮细胞凋亡。结果培养的淋巴管内皮细胞呈第VIII因子和VEGFR-3阳性反应,为典型淋巴管内皮细胞。MTT法证实,当浓度为0.8μg/ml￣2.0μg/ml时,TSP-1能明显抑制淋巴管内皮细胞的增殖,且抑制作用呈现剂量依赖关系。Hoechst33258证实,经TSP-1处理后淋巴管内皮细胞,可观察到其核周围有凋亡小体。结论TSP-1对淋巴管内皮细胞增殖有明显的剂量依赖性抑制作用,诱导淋巴管内皮细胞凋亡。     

血管内皮抑制因子α-干扰素和γ-干扰素对淋巴管内皮细胞增殖和游走的影响

目的:探讨α-干扰素(IFN-α)和γ-干扰素IFN-γ对淋巴管内皮细胞增殖和游走的影响及作用机制.方法:内皮细胞取自猪的胸导管.应用Hoechst和Caspase染色法检测IFN-α和IFN-γ诱导的细胞凋亡;采用划线法和MTT法观察IFN-α和IFN-γ对淋巴管内皮细胞增殖和游走的影响;活兔后肢切断淋巴管并分别注射IFN-α和生理盐水,观察淋巴管的再生情况.结果:经IFN-α和IFN-γ处理后,淋巴管内皮细胞其核周围有凋亡小体Caspase染色阳性表达;IFN-α和IFN-γ对淋巴管内皮细胞的增殖和游走有明显的抑制作用;手术切断兔后肢淋巴管后16 d,IFN-α侧仍有大量染料渗漏.结论:IFN-α和IFN-γ具有促进细胞凋亡的作用.IFN-α和IFN-γ对淋巴管内皮细胞的增殖和游走有明显的抑制作用.     

共培养条件下乳腺癌细胞对淋巴管内皮细胞增殖的影响

目的建立乳腺癌细胞和淋巴管内皮细胞共培养模型,探讨乳腺癌细胞在共培养条件下对淋巴管内皮细胞增殖的影响。方法培养并鉴定淋巴管内皮细胞;利用transwell小室建立乳腺癌细胞与淋巴管内皮细胞体外共培养模型;采用MTT法检测乳腺癌细胞对淋巴管内皮细胞增殖情况。结果VEGFR-3抗体对培养的细胞进行鉴定,为典型淋巴管内皮细胞;MTT法结果显示：在共培养24~72 h时,乳腺癌细胞能够促进共培养条件下淋巴管内皮细胞的增殖（P〈0.05）。结论成功建立乳腺癌细胞和淋巴管内皮细胞共培养模型,乳腺癌细胞能够促进共培养条件下淋巴管内皮细胞的增殖。     

IFN-β和angiostatin对猪淋巴管内皮细胞生成的影响

目的探讨IFN-β和angiostatin分别在离体和在体条件下对淋巴管内皮细胞生成的影响。方法淋巴管在体抑制实验观察活体被切断的淋巴管应用抑制因子后的再生情况,应用光镜、透射电镜、共聚焦显微镜观察离体猪胸导管内皮细胞的形态结构,应用MTT法来确定IFN-β对淋巴管内皮细胞生成的抑制作用,采用Hoechst法检测细胞凋亡。结果手术切断兔前或后肢淋巴管5d后,生理盐水侧的淋巴管已愈合,angiostatin侧仍有大量染料渗漏。培养的胸导管内皮细胞的突出结构特点是胞质内有较多吞饮小泡以及从细胞膜上发出许多长突起。MTT法显示IFN-β对离体淋巴管内皮细胞的增殖有明显的抑制作用,IFN-β可引起细胞凋亡。结论 Angiostatin对在体淋巴管的愈合有抑制作用,IFN-β对离体淋巴管内皮细胞的增殖有明显的抑制作用并促进细胞凋亡。     

IFN-β和angiostatin对猪淋巴管内皮细胞生成的影响

目的 探讨IFN-β和angiostatin分别在离体和在体条件下对淋巴管内皮细胞生成的影响.方法 淋巴管在体抑制实验观察活体被切断的淋巴管应用抑制因子后的再生情况,应用光镜、透射电镜、共聚焦显微镜观察离体猪胸导管内皮细胞的形态结构,应用MTT法来确定IFN-β对淋巴管内皮细胞生成的抑制作用,采用Hoechst法检测细胞凋亡.结果 手术切断兔前或后肢淋巴管5d后,生理盐水侧的淋巴管已愈合,angiostatin侧仍有大量染料渗漏.培养的胸导管内皮细胞的突出结构特点是胞质内有较多吞饮小泡以及从细胞膜上发出许多长突起.MTT法去显示IFN-β对离体淋巴管内皮细胞的增殖有明显的抑制作用,IFN-β可引起细胞凋亡.结论 Angiostating对在体淋巴管的愈合有抑制作用,IFN-β对离体淋巴管内皮细胞的增殖有明显的抑制作用并促进细胞凋亡.     

血小板反应蛋白1在转化生长因子β1诱导的大鼠心肌成纤维细胞中的作用

目的:观察血小板反应蛋白1(TSP-1)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导大鼠心肌成纤维细胞中的作用.方法:差速贴壁法分离新生Sprague-Dawley(SD)大鼠心肌成纤维细胞(CFs).MTT法测CFs生长,羟脯氨酸法测CFs胶原含量,RT-PCR法测TSP-1mRNA表达.结果:TGF-β1诱导CFs TSP-l的表达呈浓度一时间依赖性增加(P<0.01).TGF-β1(20ug/L)作用下24 h可诱导CFs增殖和胶原合成(P<0.01).TSP-l反义寡核苷酸作用后的CFs的MTTA值、胶原含量减少(P<0.01).结论:TGF-β1可诱导新生大鼠CFs TSP-1表达,TSP-1反义寡核苷酸对TGF-β1诱导大鼠CFs增殖与胶原合成具有明显的抑制作用,TSP-1在TGF-β1诱导大鼠心肌纤维化中可能具有重要的作用.     

共接种淋巴管内皮细胞对乳腺癌细胞和骨肉瘤细胞在裸鼠体内生长和转移的影响

目的分析淋巴管生成对肿瘤生长和转移的影响。方法从人淋巴结中分离纯化淋巴管内皮细胞(HLyECs),将人乳腺癌细胞系和人骨肉瘤细胞系分别单独或与HLyECs共同接种于裸鼠皮下,比较肿瘤生长和肺转移的差别。用伊文氏蓝显示瘤周淋巴管;用人和小鼠PDPN的免疫组织化学显示肿瘤组织中的淋巴管。用MTT法分析淋巴管内皮细胞的增殖。结果与单纯接种组相比,共接种HLyECs促进乳腺癌细胞的生长和转移,瘤周和瘤内淋巴管密度增加(P<0.01),存在人和鼠PDPN阳性的淋巴管;而共接种HLyECs对骨肉瘤的生长和转移无影响,未见瘤内和瘤周淋巴管。与骨肉瘤细胞相比,乳腺癌细胞的条件培养基明显促进淋巴管内皮细胞增殖(P<0.01)。结论共接种淋巴管内皮细胞可以促进乳腺癌细胞的生长及癌组织中淋巴管生成。     

APCP对人胃腺癌细胞HGC-27生长及血管内皮生长因子的影响

目的体外应用CD73(5’-核酸酶)特异性抑制剂APCP(alpha,beta-methylene adenosine-5’- diphosphate,5’-α,β-亚甲基-二磷酸腺苷),探讨其对人胃腺癌细胞HGC-27细胞生长及其对血管内皮生长因子VEGF-C、VEGF-D表达的影响。方法体外培养HGC-27细胞达指数生长,设正常组和APCP不同浓度干预组,倒置显微镜观察各组细胞生长状态,MTT法检测各组细胞活性,免疫组化法观测两组细胞VEGF-C、VEGF- D的表达及其积分光密度。结果同正常组相比,随药物浓度增加,APCP各干预组细胞在生长方面表现为生长缓慢,胞浆皱缩,细胞界线模糊,细胞数量减少(P<0.05);各干预组细胞内VEGF-C、VEGF-D的表达低于正常对照组(P<0.05)。结论APCP抑制HGC-27细胞生长,细胞数量减少,降低细胞内VEGF-C、VEGF-D的表达。     

叶酸拮抗同型半胱氨酸诱导的内皮细胞凋亡的作用机制

目的： 明确同型半胱氨酸（Hcy）对内皮细胞凋亡的影响以及叶酸的拮抗作用，阐明Bax和Bcl-2在同型半胱氨酸诱导内皮细胞凋亡及叶酸拮抗中的作用。方法: 用不同浓度的Hcy处理内皮细胞后，应用末端转移标记技术（TUNEL）以及Annexin V/PI染色加流式细胞术了解细胞凋亡状态，免疫组化方法检测Bax、Bcl-2的表达。结果: Hcy能促进细胞凋亡，叶酸具有拮抗作用。Hcy能促进细胞Bax、Bcl-2的表达，上调Bax/Bcl-2比值，叶酸能减少细胞表达Bax及Bcl-2，下调Bax/Bcl-2比值。结论: Bax、Bcl-2参与了Hcy诱导内皮细胞凋亡以及叶酸拮抗作用的过程。     

血管内皮生长因子D和血管内皮生长因子受体3在人结肠癌中的表达及淋巴道转移中的作用

目的 观察血管内皮生长因子D(VEGF-D)和血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3)在人结肠癌组织中的表达,检测结肠癌组织中的微淋巴管密度(LMVD),探讨VEGF-D和VEGFR-3在淋巴管生成以及结肠癌淋巴道转移中的作用.方法 选择55例不同时期,不同分化程度的人结肠癌组织样本,应用免疫组织化学染色的方法,观察VEGF-D和VEGFR-3在人结肠癌组织中的表达,应用Podoplanin标记淋巴管,检测结肠癌组织中的淋巴管密度.结果 在55例结肠癌组织中,VEGF-D的阳性表达率为54.5%,明显高于在癌周正常组织内的表达(P＜0.05);结肠癌组织中VEGFR-3表达的阳性率为69.1%,明显高于在癌周正常组织内的表达(P＜0.01);并且VEGFR-3的表达与VEGF-D的表达具有显著相关性(P＜0.01).在结肠癌组织中,淋巴结转移阳性组,浸润深度超过肌层组,DukeC、D期的VEGF-D的表达水平和LMVD明显高于淋巴结转移阴性组,浸润深度未超过肌层组,Duke A、B期(P＜0.01),经计数淋巴管数量,癌组织中的LMVD明显高于癌周正常组织(P＜0.01),并且LMVD与VEGF-D的表达显著相关(P＜0.01).结论 结肠癌组织中VEGF-D的表达水平随着癌的浸润和转移程度的增强而增高,并且通过上调其受体VEGFR-3的表达而促进癌组织中淋巴管的生成,从而促进癌的浸润和转移.     

PAR-2激动剂对肝癌细胞增殖及Ca2+水平的影响

目的： 研究PAR-2激动剂对人肝癌HepG2细胞增殖及细胞内Ca2+浓度（［Ca2+］c）的影响。方法: 培养人肝癌细胞HepG2, 分别利用PAR-2激动剂SLIGKV-NH2及反PAR-2激动肽VKGILS-NH2干预肝癌细胞生长,用Fura-2荧光法测定肝癌细胞内［Ca2+］c,用MTT法检测对肝癌细胞增殖能力的影响,流式细胞术（FCM）检测细胞周期改变情况,RT-PCR法检测cyclinD1 mRNA表达变化。结果: 50 μmol/L SLIGKV-NH2刺激HepG2细胞后,［Ca2+］c迅速短暂升高（P<0.01）;G0/G1期比例明显降低,S期和G2/M期细胞比例和细胞增殖指数(PI)明显提高（P<0.01）;cyclinD1 mRNA的表达显著增加（P<0.01）。SLIGKV-NH2在1-50 μmol/L时可以促进HepG2细胞增殖,呈剂量依赖性（P<0.01或P<0.05）。而VKGILS-NH2组与对照组相比差异无显著（P>0.05）。结论: PAR-2激动剂在体外能通过激活PAR-2,诱导HepG2细胞内［Ca2+］c升高,上调cyclinD1 mRNA的表达,加速HepG2细胞周期进程,促进DNA合成,促进肝癌细胞增殖。     

银杏叶总黄酮对肝癌HepG2细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨银杏叶总黄酮体外对人肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响。方法将银杏叶总黄酮作用于体外培养的人肝癌细胞HepG2,MTT法检测药物对HepG2细胞增殖的影响,缺口末端核苷标记(TUNEL)法检测药物对HepG2细胞凋亡的影响。结果银杏叶总黄酮对体外培养的人肝癌细胞HepG2的增殖效率下降,使凋亡细胞数增加(P0.01),呈剂量依赖效应。结论银杏叶总黄酮对体外培养的人HepG2细胞增殖有抑制作用,并能诱导细胞凋亡。     

人喉癌组织中VEGF—C、VEGF—D及其受体3的表达及意义

目的 探讨喉癌组织中VEGF—C、D和受体VEGFR-3的表达及其在喉癌进展中的作用。方法 取人喉癌标本12例，正常及良性病变喉组织10例，免疫组化法观察VEGF—C、VEGF—D、VEGFR-3以及LYVE-1的表达。结果 VEGF—C和VEGF—D主要表达于喉癌细胞胞浆内，喉癌组织中VEGF—C和VEGF—D表达的阳性率明显高于正常及良性病变喉组织（P〈0．05）；VEGFR-3主要表达于基底层的癌细胞，在喉癌组织中VEGFR-3表达的阳性率明显高于正常和良性病变组织中（P〈0．01），并且VEGFR-3的表达与VEGF—C、VEGF—D的表达显著正相关（P〈0．01）。LYVE—1仅见表达于淋巴管内皮细胞。结论 喉癌组织中VEGF—C、VEGP-D的表达明显增高，推测可能通过与VEGFR-3的结合促进喉癌组织中淋巴管的生成；LYVE-1是淋巴管内皮细胞较特异的标记物。     

牛磺酸抗缺氧及防治肺动脉高压的研究及其细胞机制初探

目的通过动物模型观察牛磺酸对缺氧性肺动脉高压的治疗作用,同时观察其对体外培养牛肺动脉平滑肌细胞(PASMC)和内皮细胞(PAEC)增殖的影响。方法采用模拟高原5 000 m制作缺氧大鼠模型,缺氧2周。设平原(C组)及缺氧对照组(H组),观察牛磺酸治疗后(T组)的肺动脉压(mPAP)、血浆乳酸脱氢酶(LDH)活性、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)、肺匀浆一氧化氮(NO)含量、右心室肥大指数的变化。体外培养PASMC和PAEC用3H-TdR掺入法比较牛磺酸对缺氧PASMC和PAEC增殖的影响。结果H组大鼠LDH活性升高为C的10.1倍(P<0.01);肺匀浆NO含量降低为C组的32%(P<0.01);血浆MDA含量显著升高为C组的1.64倍(P<0.01);mPAP显著增高,约为C组的2.74倍(P<0.01);右心室肥大指数是C组的1.56倍(P<0.01)。T组与H组相比较:LDH活性、血浆MDA、右心室肥大指数均显著降低(P<0.01);mPAP显著降低(P<0.05)。高浓度(10～20 mmol/L)的牛磺酸抑制缺氧内皮及平滑肌细胞的3H-TdR掺入,而低浓度的牛磺酸促进缺氧时PAEC的3H-TdR掺入(P<0.05),抑制缺氧时PASMC的3H-TdR掺入(P<0.05)。结论牛磺酸有抗缺氧及防治肺动脉高压的作用。缺氧抑制内皮细胞的增殖而促进平滑肌细胞的增殖,适当剂量的牛磺酸可以对抗缺氧对PAEC和PASMs的作用:减弱缺氧对PAEC的增殖抑制作用,抑制缺氧的促PASMC增殖作用,使之接近常氧水平。这可能是牛磺酸防治肺动脉高压的细胞机制。提示牛横酸对于高山病缺氧性肺血管收缩和血管结构改建的预防和治疗,可能具有广阔的应用前景。     

肿瘤血管形成的模型建立与显微图像定量分析研究

目的 利用显微图像分析法研究肿瘤新生血管相关模型.方法 以人脐静脉内皮细胞和胃癌细胞系建立体外小管形成模型与血管拟态形成模型,以鸡的受精卵建立鸡胚尿囊膜活体血管形成模型,观察抑癌基因IRX1对血管形成和血管拟态形成的影响.显微镜所摄数字图片通过Image Pro Plus(IPP)专业图像软件进行分析.通过计数点和线长度分析体外小管形成;通过吸光度法测量血管拟态的PAS阳性物质;通过计数法和角度测量法计算鸡胚尿囊膜血管数目.结果 IRX1转基因组与空载体组及空白对照组相比,均显示了抑制血管形成能力,其小管形成数量三组分别为(12.80±3.83)、(29.00±5.34)和(28.20±4.32)个(P<0.01),三组的小管连接点分别为(13.20±2.59)、(25.00±2.24)和(24.60±3.21)个(P<0.01),三组的小管长度分别为(821.5±12.5)、(930.9±13.5)和(948.4±18.1)μm(P=0.022).IRX1基因转染组的PAS阳性物质吸光度值(3606±363)显著低于空载体组(14 200±1251)与空白对照组(15 043±1220,P<0.01).IRX1基因转染组的鸡胚尿囊膜血管形成数量明显少于空载体组与空白对照组,三组角测量血管数量分别为(6.41±2.60)、(10.27±2.65)和(9.18±1.99)个(P<0.01).结论 体外血管形成、血管拟态模型和鸡胚活体血管形成模型研究均显示,IRX1基因转染可以明显抑制新生血管形成;上述模型适用于以血管为靶点的基因干预或者药物筛选研究;专业图像分析软件在肿瘤血管形成的定量分析研究中可发挥一定的作用.

Abstract：

Objective To establish experimental models for tumor neovascularization and to apply quantitative digital imaging analysis in the study. Methods An endothelial tube formation model was established by human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). A vasculogenic mimicry model was established by SGC-7901 gastric cancer cell line. Fertilized eggs were used to establish a chorioallantoic membrane angiogenesis model. Using gene transfection experiment, IRX1 tumor suppressor gene was chosen as a therapeutic target. Image Pro Plus (IPP) analysis software was used for digital vascular images analysis with parameters including points, lines, angles and integral absorbance (IA) for the tubular formation or vasculogenic mimicry.Results Digital image analysis by IPP showed that HUVEC tubular formation was significantly inhibited in IRX1 transfectant, compared with controls. The tubular numbers in three groups were 12.80±3.83, 29.00±5.34 and 28.20±4.32(P<0.01).The connection points of tubules in three groups were 13.20±2.59, 25.00±2.24 and 24.60±3.21(P<0.01). The tubular lengths of three groups were (821.5±12.5), (930.9±13.5)and(948.4±18.1)μm(P=0.022). The IA values of PAS stain in three groups were 3606±363, 14 200±1251 and 15 043±1220 (P<0.01). In chick chorioallantoic membrane model, the angular numbers of tubules in three groups were 6.41±2.60, 10.27±2.65 and 9.18±1.99(P<0.01). Conclusions The endothelial tube formation model, vasculogenic mimicry model and chorioallantoic membrane angiogenesis model are useful for gene therapy and drug screening with targeting neoplastic vascularization. Professional image analysis software may greatly facilitate the quantitative analysis of tumor neovascularization.