肿瘤超声抗原疫苗联合低剂量环磷酰胺在小鼠体内抗肿瘤效应的研究

目的探索肿瘤超声抗原疫苗联合低剂量环磷酰胺(CTX)的抗肿瘤效应。方法 C57BL/6雄性小鼠48只,随机分为PBS对照组、CTX组、FBL3超声抗原疫苗组、FBL3超声抗原疫苗联合CTX组。按程序免疫3次后,每组随机取4只小鼠,流式细胞术比较脾细胞中CD4+CD25+Treg及CD8+T细胞比例,MTT法比较脾细胞杀伤FBL3功能,各组其余小鼠接种FBL3肿瘤细胞,观察成瘤时间及肿块大小。结果超声抗原疫苗不能诱导CD8+T细胞比例升高(P0.05);CTX可下调Treg细胞数量(P0.05);疫苗和CTX均可提高脾细胞体外肿瘤杀伤率并能缩小肿块体积、延长小鼠成瘤时间,两者联合显示更强的抗肿瘤效应。结论肿瘤超声抗原疫苗联合小剂量CTX可能通过提高体液免疫或固有免疫发挥抗肿瘤效应。     

红景天乙醇提取物调节Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤浸润T细胞数量并增强抗肿瘤免疫效应

目的探讨藏药红景天(RRL)的抗肿瘤免疫功能。方法将Lewis肺癌荷瘤小鼠随机分为生理盐水组、 500 mg/kg RRL乙醇提取物处理组和10 mg/kg环磷酰胺(CTX)处理组,处理10 d。计算小鼠生存率和肿瘤生长抑制率;流式细胞术检测肿瘤浸润的CD4~+T、 CD8~+ T细胞数量及FOXP3~+调节性T细胞(Treg)占CD4~+CD25~+Treg的比例; ELISA检测荷瘤小鼠血清中白细胞介素2 (IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)水平,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果 RRL乙醇提取物处理的Lewis荷瘤小鼠生存率显著提高,肿瘤生长受到抑制,肿瘤浸润的CD4~+T细胞和CD8~+T细胞数量增加, FOXP3~+ Treg占CD4~+CD25~+Treg的比例降低。荷瘤小鼠血清IFN-γ和IL-2水平提高,脾脏CTL的杀伤能力增强。结论 RRL乙醇提取物通过调节免疫细胞数量和功能增强抗肿瘤免疫效果。     

鳖甲煎丸经AT1R/VEGF信号通路对肝癌血管生成的影响

目的 探讨鳖甲煎丸通过AT1R/VEGF信号通路影响肝癌血管生成的相关机制。方法 将40只BALB/c小鼠分为正常组、模型组、阿霉素干预组(DOX组)及鳖甲煎丸干预组(BJJW组),每组各10只。除正常组外,余下3组小鼠均立肝癌HepG2移植瘤模型,造模期间各组给予生理盐水和相应的药物治疗(腹腔注射给药),连续治疗10 d。测量各组小鼠的瘤体体积和瘤体肿瘤,并计算抑瘤率;采用免疫组织化学法检测CD34的表达情况来反映肿瘤组织的微血管密度,并采用Wstern blot法检测各组小鼠肿瘤组织中血管生成相关蛋白——缺氧诱导因子(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、金属基质蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9水平的表达情况,及血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)通路相关蛋白含量。结果 与正常对照组相比,模型组与各治疗组小鼠均形成瘤体组织,表示造模成功。其中模型组小鼠肿瘤体积、瘤体肿瘤[分别为(245.32±122.51)cm³、(1.08±0.78)g]均明显大于治疗组[DOX组体积分别为(83.41±12.04)cm³、(110.04±48....     

体外扩增的Treg细胞抑制NK细胞介导的抗肿瘤免疫

目的研究CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)对NK细胞肿瘤杀伤力的影响及Treg细胞介导的抗肿瘤免疫抑制的机制;初步探讨过继输注NK细胞逆转Treg细胞介导的抗肿瘤免疫抑制的作用。方法免疫磁珠分离法(MACS)分离得小鼠脾脏Treg细胞及NK细胞,用流式细胞术检测其纯度。以CD3/CD28单克隆抗体磁珠和重组小鼠白介素2(rm IL-2)联合刺激体外扩增Treg细胞,重组小鼠白介素15(rm IL-15)、rm IL-2以及氢化可的松联合刺激体外扩增NK细胞。将扩增后Treg细胞及NK细胞按不同比例混合淋巴细胞培养,MTT比色法检测NK细胞的杀伤活性。将B16-F10小鼠黑色瘤细胞输注至Balb/c小鼠体内建立肺移植瘤模型[1],将荷瘤小鼠分为4组:A组单独接种B16-F10小鼠黑色瘤细胞;B组接种Treg细胞+B16-F10黑色素瘤细胞;C组接种B16-F10黑色素瘤细胞+NK细胞;D组接种Treg细胞+B16-F10黑色素瘤细胞+NK细胞。MTT比色法测定各实验组小鼠脾脏NK细胞的杀伤活性,并比较不同处理组小鼠肺部肿瘤结节数目。结果体外扩增后的Treg细胞对新鲜分选及扩增后的NK细胞活性均具有明显抑制作用(P0.05),且抑制作用呈剂量依赖关系;A组荷瘤小鼠NK细胞活性低于正常小鼠,且B组荷瘤小鼠NK细胞活性较A组进一步降低(P0.05);D组荷瘤小鼠NK细胞活性高于A组和B组荷瘤小鼠,但仍低于正常小鼠组(P0.05)。B组荷瘤小鼠肺部移植瘤数目(105.33±10.97)较A组明显增多(17±4.58)(P0.01);C组荷瘤小鼠肺部移植瘤数目(2.00±1.00)较A组(17±4.58)明显减少(P=0.037);D组荷瘤小鼠肺移植瘤数目(79.00±8.54)较B组明显降低(105.33±10.97)(P=0.030),但仍高于A组荷瘤小鼠(17±4.58)(P0.001)。结论体内种植肿瘤会抑制机体NK细胞活性;输注体外扩增Treg细胞能够通过抑制NK细胞发挥抗肿瘤免疫抑制;过继输注体外扩增NK细胞能够部分逆转Treg细胞介导的抗肿瘤免疫抑制。     

氟达拉滨联合瘤苗抗肿瘤生物治疗作用的实验研究

目的探讨氟达拉滨对小鼠CD4＋CD25＋Treg细胞的影响，同时研究其抗肿瘤作用。方法氟达拉滨或生理盐水分别腹腔注射10只小鼠，用流式细胞术检测CD4＋CD25＋Treg细胞相对量。氟达拉滨或生理盐水分别腹腔注射10只小鼠，4d后用丝裂霉素灭活的肿瘤细胞免疫小鼠，观察小鼠抗肿瘤的能力（观察肿瘤发生率和出瘤时间）；用乳酸脱氢酶杀伤实验进一步验证氟达拉滨可增强CTL的杀伤活性。结果氟达拉滨组CD4＋CD25＋Treg细胞占淋巴细胞百分比为（1．150±0．256）％，对照组为（1．488±0．270）％，氟达拉滨组明显低于对照组（P〈0．05）；氟达拉滨＋接种瘤苗组、生理盐水＋接种瘤苗组、氟达拉滨＋未接种瘤苗组和生理盐水＋未接种瘤苗组小鼠第13天肿瘤发生率分别为10％、30％、50％和70％，两两间差异均有统计学意义（P〈0．05）；氟达拉滨＋接种瘤苗组、生理盐水＋接种瘤苗组、氟达拉滨＋未接种瘤苗组和生理盐水＋未接种瘤苗组小鼠分别在接种后第13天、第10天、第8天和第5天发现出瘤现象；对照组的肿瘤生长曲线较为陡直，氟达拉滨组的生长曲线较为平缓。氟达拉滨联合瘤苗接种组和单纯瘤苗接种CTL的活性分别为24．425±13．544和17．575±10．260，两者间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论低剂量氟达拉滨降低CD4＋CD25＋Treg细胞，使其抗肿瘤免疫作用增强，联合接种灭活瘤苗进一步增强抵抗肿瘤攻击的能力。     

装载阿霉素和GM-CSF的纳米颗粒增强宫颈癌抗肿瘤免疫反应的研究北大核心CSCD

目的:探索pH敏感型纳米颗粒(DGNPs)是否可以实现化疗药物阿霉素(Dox)和免疫细胞因子GM-CSF的共递送,并在肿瘤局部释放药物,实现对宫颈癌的协同抗肿瘤效应。方法:采用纳米沉淀法制备Dox纳米粒,然后用无溶剂包埋方法负载GM-CSF。电镜观测纳米颗粒DGNPs形态;HPLC检测Dox从DGNPs中的释放,ELISA检测GM-CSF从DGNPs中的释放;使用活体成像技术观测DGNPs在荷瘤小鼠体内的生物分布;利用小鼠移植瘤模型检测DGNPs的体内抑瘤活性;通过免疫组化检测CD4+和CD8+T细胞的肿瘤浸润情况;Western blot检测肿瘤组织中caspase-3的表达情况。结果:成功制备DGNPs,电镜观测其具有均匀的纳米颗粒形态;DGNPpH在pH=6.5时Dox的释放量明显高于pH=7.4时的释放量,但pH对DGNPpH和DGNPnon释放GM-CSF无明显影响;活体成像显示DGNPpH显著聚集于肿瘤组织;小鼠移植瘤模型显示,相较于回输DGNPnon组及Dox与GM-CSF联合回输组,DGNPpH抑制肿瘤生长的能力更强(P<0.01),且CD4+和CD8+T细胞的浸润增强(P<0.0001),肿瘤组织中c-caspase-3表达增强(P<0.0001)。结论:DGNPpH可以方便地实现Dox和GM-CSF的共递送,在宫颈癌肿瘤组织中有效富集,并展现出显著的抑制肿瘤生长及增强抗肿瘤免疫反应能力。因此,DGNPpH有可能在今后发展成为一种针对宫颈癌的可靠的免疫化疗策略。     

输注体外扩增的同源CD4~+CD25~+调节性T细胞增进小鼠肿瘤易感性

目的研究过继输注体外扩增同源调节性T细胞(Treg)对小鼠抗肿瘤免疫的影响,探索过继输注Treg治疗方法可能存在的风险。方法免疫磁珠分离法分离小鼠脾脏内CD4+CD25+Treg,流式细胞术测定其纯度后予以CD3/CD28单克隆抗体磁珠和大剂量IL-2(1 000 U/mL)刺激,进行2周2轮次扩增后收集Treg,混合淋巴细胞培养测定其体外抑制功能;后将1×107Treg静脉注射BALB/c小鼠,24 h后再注射B16F10肿瘤细胞,同时设置单独接种肿瘤细胞组,14 d后计数肺部移植瘤数目,测定外周血Treg比例。结果新鲜CD4+CD25+Treg纯度大于95%,平均96.3%±2.88%,体外扩增后纯度大于85%,平均87.73%±2.35%;与新鲜Treg相比,扩增后抑制功能未受损(P0.05);给BALB/c小鼠注射1×106B16F10细胞后14 d肺部肿瘤结节数为(14±5)个,先注射1×107体外扩增Treg后再注射1×106B16F10细胞,肿瘤结节数增多为(73±9)个(P=0.007),与单独注射2×106B16F10细胞相当(86±8)个(P=0.230);给C57BL/6小鼠输注5×105B16F10细胞后结节数为(70±15)个,预先输入8×106体外扩增Treg后再注射5×105B16F10细胞,肺部肿瘤结节数明显增多,大于300个,与前者相比,差异有统计学意义(P0.01),同时荷瘤小鼠外周血Foxp3+Treg比例上升更为显著(P0.05)。结论过继输注体外扩增Treg诱导移植物免疫耐受的同时,可能抑制机体的抗肿瘤免疫,因此存在一定风险。     

不同化疗药物对小鼠学习记忆功能的影响比较

目的:研究比较阿霉素、环磷酰胺联合使用以及单独注射5-氟尿嘧啶(5-FU)或阿霉素(DOX)对正常小鼠认知功能的影响。方法:成年雄性C57/BL小鼠随机分为正常(Control)组、阿霉素(D)组、5-氟尿嘧啶(5-FU)组、阿霉素与环磷酰胺联合(D+C)组。各组小鼠每周腹腔注射1次化疗药物,连续注射3周。采用旷场实验、新位置识别实验评价各组小鼠行为学变化;尼氏染色观察各组小鼠海马CA1和CA3区神经元变化。结果:行为学检测发现,与Control组相比,D+C组小鼠运动速度、活动距离、在中心区域活动时间及频率均无明显差异,新位置识别时间比则显著下降(P 0. 01); D组及5-FU组新位置识别时间比则明显减少(P 0. 05)。尼氏染色显示较Control组,D+C组小鼠海马CA1区和CA3区神经元均显著减少(P 0. 01),排列稀疏;而D组(P 0. 01)及5-FU组(P 0. 05)仅在海马CA3区出现神经元细胞数量降低。较D+C组,D组小鼠海马CA1区细胞数明显增多(P 0. 05)。结论:相较于单一使用阿霉素或5-氟尿嘧啶,阿霉素与环磷酰胺联合使用可以在短时间内造成小鼠严重认知功能障碍。     

转染肿瘤总RNA的DC疫苗诱导抗肝癌特异性免疫

目的：探讨转染人肝癌总RNA的树突状细胞(DC) 疫苗体外诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的作用。 方法： 采用原发性肝癌（HCC）病人外周血单核细胞（PBMC），在粒/巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4) 刺激下增殖分化为DC细胞；从人肝癌细胞中体外扩增肝癌RNA。以HCCRNA转染DC细胞，并与PBMC混合培养诱导扩增CTL。MTT法测定CTL的杀瘤活性。 结果： 转染HCCRNA 48 h后， DC表面分子CD83、CD86和HLA-DR表达明显增高。转染HepG-2细胞HCCRNA的DC和病人HCCRNA诱导的CTL对HepG-2细胞和病人HCC细胞的杀瘤活性均明显高于正常肝细胞RNA+DC、脂质体+DC、Opti-MEM+DC以及空白对照组；而对胃癌SGC-7901细胞无杀伤活性。 结论： 以肝癌RNA为肿瘤抗原，DC作为疫苗的抗原提呈细胞，体外冲击致敏DCs，能诱导肝癌特异性CTL。本研究为HCC术后复发和转移的防治提供一种可能有效的疫苗治疗方法。     

小剂量环磷酰胺对正常小鼠CD4~+CD25~+Treg细胞的调节作用

目的比较多次与单次应用小剂量环磷酰胺(CTX)对小鼠CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)数量及功能的影响,明确小剂量CTX可否多次用于下调Treg细胞。方法 C57BL/6小鼠32只,随机分为正常对照、单次、两次及三次CTX注射组共4组,各组每10天腹腔注射20 mg/kg CTX或等体积PBS,末次给药后3 d,流式细胞技术测小鼠脾细胞中Treg细胞占CD4+T细胞百分比;同时3-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法比较各组脾细胞中T、B细胞增殖功能,中性红吞噬试验比较各组巨噬细胞吞噬功能。结果各实验组小鼠脾细胞中Treg细胞占CD4+T细胞百分比显著低于对照组(P<0.05),而各实验组间差异无统计学意义(P>0.05)。各实验组T、B细胞增殖指数及巨噬细胞吞噬功能明显高于对照组(P<0.05),但各实验组间差异无统计学意义(P>0.05)。应用CTX后Treg细胞数量与T、B细胞增殖功能及巨噬细胞吞噬功能呈线性负相关。结论多次与单次小剂量应用CTX对小鼠Treg细胞数量的下调作用无差异,下调Treg细胞后对免疫细胞的调节功能也无差异,小剂量CTX可多次用于下调正常小鼠Treg细胞。     

败血症休克肝细胞线粒体损伤机制的实验研究

目的:探讨败血症休克肝细胞线粒体损伤的机制。方法:30只SD大鼠随机分为3组,假手术组,12h手术组,16h手术组。采用盲肠结扎穿孔术(cecalligationandpuncture)制作败血症休克模型,比较手术前后肝细胞线粒体呼吸功能和氧化磷酸化功能的变化及线粒体膜ATP酶的活性改变与大鼠死亡率和血压变化的关系。结果:12h手术组平均动脉压(9.54±1.26)kPa明显低于假手术组(14.58±1.32)kPa(P<0.05),死亡率明显高于假手术组(P<0.05),12h手术组肝细胞线粒体Ⅲ态(1.28±0.25)、P/O比值(1.67±0.34)、呼吸控制率(1.27±0.25)、线粒体膜Ca²⁺-ATP酶(58.00±2.43)、Na⁺-K⁺-ATP酶(40.80±3.45)、Mg²⁺-ATP酶(78.30±4.16)、Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶(2.70±2.25)活性与假手术组相比较,具有显著差异(P<0.05)。术后16h组更低于12h组,与大鼠死亡率增加呈显著正相关。结论:肝细胞线粒体摄氧功能和氧化磷酸化功能减弱,膜流动性降低,能量代谢功能障碍,线粒体内钙镁平衡紊乱是败血症休克肝细胞线粒体损伤的主要机制。     

钙通道阻滞剂对缺氧右心室心肌钙调神经磷酸酶活性的调控作用

目的:探讨钙调神经磷酸酶(CaN)在大鼠慢性缺氧性右心室肥大中的作用以及L-型钙通道阻滞剂对其的影响。方法:将大鼠置于氧浓度为(10±0.5)%的大型玻璃舱中每天24 h缺氧持续共7 d建立大鼠慢性缺氧模型。实验大鼠分为3组,每组各20只,即正常组、缺氧组、苯磺酸氨氯地平(norvasc)处理组,缺氧组持续缺氧21 d,norvasc处理组在缺氧的同时灌喂norvasc 30 mg·k^-1·d^-1。第21 d每组取10只大鼠分离心脏称重,并测CaN活性水平,另10只取心脏测定心肌细胞[Ca²⁺]_i。结果:(1)缺氧组右室与左室加室间隔的重量比、右室重/体重均明显高于正常组和norvasc处理组(均P＜0.01) 。(2)缺氧组右心室心肌细胞[Ca²⁺]_i 明显高于正常组(P＜0.01),而norvasc处理组则明显低于缺氧组(P＜0.01)。(3)缺氧组右心室心肌CaN活性明显高于正常组(P＜0.01),而norvasc处理组则明显低于缺氧组(P＜0.01)。结论: CaN可能参与了大鼠慢性缺氧性右心室肥大, L-型钙通道阻滞剂可能是通过降低心肌细胞内钙浓度,调控CaN活性而阻滞慢性缺氧右心室肥大。     

Benextramine逆转神经肽Y下调人血管平滑肌细胞LDL-R的表达

目的:探讨benextramine对神经肽Y(NPY)人血管平滑肌细胞(hVSMC)低密度脂蛋白受体(LDL-R)表达影响的逆转作用。方法:应用荧光免疫组化和激光扫描共聚焦显微技术,定量检测hVSMC的LDL-R表达的变化。Benextramine(B组)浓度设为10^-5mol/L,NPY设10^-8mol/L(N1组)、10^-7mol/L(N2组)、10^-6mol/L(N3组)和10^-5mol/L(N4组)4个浓度,培养时间分别为6、12、24和48h。结果:对照组LDL-R表达的平均荧光值较高,介于2564-2649之间,且各时段间均无显著差异(P>0.05)。各NPY组LDL-R表达的平均荧光值均明显低于对照组和各benextramine组(P<0.05),介于1639-2512之间,其荧光值随NPY浓度增加而下降,N1-N4组分别平均下降15.64%、20.31%、22.58%和27.42%,呈现一定的剂量依赖效应;同时其荧光值也随NPY作用时间的延长而下降,在6、12、24和48h时间段分别平均下降11.24%、21.29%、23.04%和30.38%,亦呈现一定的时间依赖效应。各benextramine组(包括B组、B+N1组、B+N2组、B+N3组及B+N4组)的LDL-R表达荧光值介于2554-2631之间,与对照组间差异无显著(P>0.05),且与NPY作用浓度及时间无关(P>0.05)。结论:NPY能导致hVSMC的LDL-R表达下降,benextramine可逆转该作用。     

心房钠尿肽对脂多糖所致大鼠急性肺损伤的影响

目的:探讨心房钠尿肽(ANP)对脂多糖(LPS)血症大鼠急性肺损伤的作用和机制。方法: 大鼠静脉给予LPS(2 mg·kg^－1)后立即静脉给予ANP(2 μg·kg^－1),记录动物平均动脉血压(MAP)、检测血浆一氧化氮(NO)和内皮素(ET)浓度、测定肺水含量并做肺组织病理学检查。结果: 给予LPS的大鼠,MAP持续下降,至4 h MAP(8.1±2.6)kPa;血浆NO和ET浓度均显著升高(P<0.01 vs control);4 h肺湿干比(5.15±0.43),显著高于对照组(P<0.05);大鼠肺组织病理学检查呈现肺间质水肿。LPS＋ANP组大鼠MAP在给药初期的短暂下降后逐步回升,至4h MAP(13.4±2.9)kPa(P<0.05 vs LPS);4 h血浆NO水平和ET浓度均显著下降(P<0.05 vs LPS),但仍明显高于对照组(P<0.01 vs control);肺湿干比(4.57±0.35)与对照组没有显著差异;肺组织病理学改变较LPS组明显减轻。结论: ANP对LPS引起的急性肺损伤有治疗作用,能调节LPS引起的动脉血压的持续下降,上述作用可能与ANP拮抗ET的产生、降低NO的分泌有关。     

地塞米松或茶碱对血小板活化因子诱导的嗜酸性粒细胞活化的影响

目的:血小板活化因子(PAF)可诱导嗜酸性粒细胞(EOS)脱颗粒产生低密度嗜酸性粒细胞(HE),本研究旨在探讨地塞米松、茶碱对上述过程产生的影响。方法:分离正常人外周血EOS,观察不同密度EOS的组织学差别,测定地塞米松、茶碱对PAF诱导的EOS脱颗粒和正常密度EOS(NE)向低密度EOS(HE)转化的影响。结果:低密度嗜酸性粒细胞颗粒缩小;10^-5mmol/L地塞米松或10mg/L茶碱可使17.87%±2.16%或14.08%±2.42%的正常密度嗜酸性粒细胞转化为低密度嗜酸性粒细胞,与血小板活化因子组比较差异显著(P<0.05,P<0.01);同样浓度的地塞米松和茶碱分别使PAF诱导的嗜酸性粒细胞过氧化物酶的释放量下降至(101.17±10.32)mg/L、(110.85±4.16)mg/L及(100.53±9.65)mg/L、(106.94±10.11)mg/L(P<0.05,P<0.01)。结论:EOS脱颗粒是HE产生的原因之一;地塞米松、小剂量茶碱可以抑制PAF对EOS的活化,这可能是它们抗炎作用的机制之一。     

褪黑素对电离辐射诱导小鼠淋巴细胞凋亡的影响

目的:探讨褪黑素(MLT)对电离辐射诱导小鼠胸腺细胞和脾细胞凋亡的影响及其机制。方法:采用流式细胞术(FCM)和荧光分光光度法分别检测离体和在体小鼠淋巴细胞凋亡小体百分率和DNA裂解率。结果:在离体研究中,小鼠胸腺和脾淋巴细胞体外接受(0.5-6.0)Gy X射线照射前预先加入2 mmol/L MLT,细胞凋亡小体百分率和DNA裂解率均显著低于单纯照射组,胸腺和脾淋巴细胞凋亡小体百分率分别为单纯照射组的86.25％和89.44％,DNA裂解率分别为单纯照射组的87.23％和89.16％。在体研究中,2 Gy X射线全身照射前60 min腹腔注射MLT,小鼠胸腺和脾淋巴细胞凋亡小体百分率和DNA裂解率显著低于单纯照射组,接近或低于假照水平,MLT剂量在0.1-2.5 mg／kg范围内均有作用,但无明显剂量依赖性。结论:MLT在体内和体外均可减轻电离辐射诱导的小鼠淋巴细胞损伤,且体内比体外作用更明显。     

重组色素上皮衍生因子对人视网膜微血管内皮细胞迁移及凋亡的影响

目的: 构建rAAV2-PEDF腺相关病毒,研究色素上皮衍生因子(PEDF)基因高表达对人视网膜微血管内皮细胞的作用。方法: 将PEDF基因克隆、重组到腺相关病毒载体pSNAV,得到的pSNAV-PEDF后转染BHK细胞,用含G418的培养基进行筛选,得到稳定转染pSNAV-PEDF的生产细胞系,用重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2感染细胞进行病毒包装,纯化后得到高滴度rAAV2-PEDF 病毒颗粒。按照10⁵v.g./cell的剂量进行rAAV2-PEDF病毒转染,分别设空白和阴性对照,激光共聚焦显微镜下观察GFP阳性细胞,Western blotting检测PEDF蛋白表达。Boyden小室法观察细胞迁移情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果: 通过PCR、酶切及基因测序的方法,证实rAAV2-PEDF构建成功。转染病毒48 h后,激光共聚焦显微镜下观察可见GFP阳性细胞,Western blotting检测,实验组PEDF表达明显强于其它组。rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,正常对照组凋亡细胞比例为2.10%±0.53%,rAAV2-GFP组为3.40%±0.62%,rAAV2-PEDF组为1.60%±0.47%,各组间无显著差异(P＞0.05)。rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,单纯CoCl₂组凋亡细胞比例为4.00%±0.55%,CoCl₂+rAAV2-GFP组为6.10%±0.71%,CoCl₂+rAAV2-PEDF组为40.00%±2.10%。rAAV2-PEDF组与其它2组相比,有显著差异(P<0.05)。细胞迁移计数显示,正常对照组为33.0±2.7,rAAV2-GFP组为35.0±3.6,rAAV2-PEDF组为12.0±2.1,rAAV2-PEDF组与其它2组相比,有显著差异(P<0.05)。结论: 成功构建了rAAV2-PEDF,转染人视网膜血管内皮细胞后PEDF可稳定表达。PEDF高表达可显著抑制人视网膜微血管内皮细胞迁移并可在低氧条件下诱导其凋亡。     

同种异型抗原冲击不成熟CD8α+DCs抑制T细胞增殖的体外实验

目的: 探索同种异基因抗原体外冲击后小鼠优势不成熟CD8α⁺树突状细胞(DCs)体外抑制T细胞增殖的最佳条件。方法: 取SPF级C57BL/6(H-2b)小鼠的骨髓细胞,GM-CSF +IL-4 +SCF +Flt3L诱导制备优势不成熟CD8α⁺DCs,于培养最后1 d加入梯度蛋白浓度(0、2.5、5、10和20 mg/L)同种异基因(H-2d)小鼠脾细胞抗原冲击DCs。经抗原冲击后的DCs分别与同系T细胞按1∶ 1、2∶ 1、4∶ 1比例共培养,MTT法观察T细胞增殖情况。ELISA法检测上清中细胞因子(IFN-γ和IL-10)的含量。以GM-CSF +IL-4 +TNF-α诱导的成熟DCs作为对照。结果: 优势不成熟CD8α⁺DCs与T细胞1∶ 1共培养时不能有效刺激T细胞增殖,与2∶ 1及4∶ 1组相比刺激能力最弱(P<0.05);上清中IFN-γ的分泌明显低于成熟DCs对照组,且经小剂量抗原(＜2.5 mg/L)冲击时IL-10的分泌高于对照组。结论: 经小剂量(2.5 mg/L)同种异基因抗原冲击后的优势不成熟CD8α⁺DCs,与T细胞1∶ 1混合,是抑制T细胞增殖的最佳条件。     

EGb761增强c-jun表达减少轴突撕脱后运动神经元的死亡

目的:观察EGb761对脊神经根撕脱后前角运动神经元c-jun表达和存活的影响。方法:成年Sprague-Dawley雌性大鼠180只,行脊髓C5-T1节段神经根撕脱术后,每日给予腹腔注射1mLEGb761(25mg·kg^-1),对照组注射同容积的生理盐水。治疗后4h、12h、1d、3d、5d、1周、2周、4周和6周9个时点分别处死动物,取C7脊髓节段行c-jun免疫细胞化学和中性红染色。定量比较两组c-jun阳性和存活的运动神经元数目。结果:对照组损伤侧运动神经元4h开始表达c-jun,1d达高峰,以后逐渐下降至术后2周。术后2周运动神经元开始死亡,4周-6周达高峰。EGb761组各时点c-jun阳性和存活的运动神经元数目都多于对照组。结论:EGb761能有效地减少神经根撕脱后运动神经元的死亡,机制可能与c-jun基因的上调有关。     

非兴奋性电刺激对正常及心肌梗死兔心功能的影响及其作用的局部性

目的:观察于绝对不应期发放电刺激对正常和心肌梗死(MI)兔在体心脏心功能的影响及其对心肌作用的局部性。方法:64只家兔随机分为正常组和MI组两大组,每组又分为前壁和后壁两组。复制MI模型,4周后每组开胸,窦性心律下,分别于前壁组和后壁组的左心室前壁和后壁,发放绝对不应期方波电刺激(CCM)。观察左心室收缩压(LVSP)左心室舒张末压(LVEDP)及其微分(±dp/dt_max)的变化。结果:正常组前壁和后壁CCM刺激时LVSP及+dp/dt_max均显著大于刺激前(P<0.05),LVEDP低于、-dp/dt_max负值大于刺激前(P<0.05),且不同部位的CCM刺激对心功能的影响不同,左心室前壁的上述作用大于后壁(P<0.05);MI组前壁和后壁CCM刺激时LVSP及+dp/dt_max亦大于刺激前(P<0.05),LVEDP低于、-dp/dt_max负值亦大于刺激前(P<0.05),但前后壁两组之间无显著差别(P＞0.05)。结论:于绝对不应期发放电刺激能明显增强正常和MI后心肌的收缩和舒张功能,CCM刺激对心肌的作用是局部性的。