慢病毒介导RNA抑制黑素瘤细胞Foxp3蛋白表达

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术在体外干扰小鼠B16黑素瘤细胞Foxp3基因表达,探讨RNA干扰用于黑素瘤治疗的可行性。方法:针对Foxp3基因设计小干扰RNA(siR-NA),构建起短发夹状RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并转染小鼠B16细胞,在体外诱导RNA干扰。分别采用Westernblot和RT-PCR检测Foxp3基因的表达情况;ELISA检测TGF-β1、TGF-β2和IL-10等细胞因子的变化;将干扰后的小鼠B16细胞与CD4+CD25-T淋巴细胞共培养,CCK8法检测CD4+CD25-T淋巴细胞增殖能力。结果:通过Foxp3 shRNA的转染,可实现对B16细胞Foxp3表达的沉默,可下调肿瘤细胞对CD4+CD25-T淋巴细胞增殖抑制的能力,并且下调TGF-β1、TGF-β2和IL-10等细胞因子的表达,尤其是TGF-β2的表达。结论:RNA干扰可抑制小鼠黑素瘤细胞靶基因Foxp3的表达及细胞增殖,并对CD4+CD25-T淋巴细胞增殖抑制的能力减弱,同时减弱抑制性细胞因子的分泌,为黑素瘤的基因治疗提供了新思路。     

白藜芦醇的抗肿瘤作用免疫学机制的初步探讨

目的:探讨白藜芦醇(Res)抗肿瘤作用的免疫学机制。方法:用MTT比色法测定肿瘤细胞生长抑制率,流式细胞术分析其细胞周期。分别采用MTT比色法、溶血分光光度法、改良的Mayer法及双抗体夹心ELISA法,检测荷瘤小鼠的免疫功能及细胞因子的水平。结果:Res可以时间-剂量依赖的方式抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡,出现明显的凋亡峰和G0/G1期阻滞现象;抑瘤率最高可达42.76%。Res可增强NK细胞的杀伤力、T细胞增殖、抗体的分泌及CH50活性,并呈剂量依赖性。Res还可显著提高IL-2和TGF-β1的含量;减少IL-8和VEGF的分泌。结论:Res既可直接作用于肿瘤细胞,也可通过提高机体细胞与体液免疫应答的水平,调节细胞因子的分泌,而发挥抗肿瘤作用。     

mPer2在小鼠黑色素瘤细胞B16细胞凋亡中的作用研究

目的:研究mPer2在小鼠黑色素瘤细胞B16细胞凋亡中的作用机制。方法:将构pcDNA3.1-mper2和pcDNA3.1空质粒分别转染入小鼠黑色素瘤细胞B16中。提取两组细胞的总RNA和总蛋白,利用特异引物和抗体,分别检测两组细胞中p53和c-Myc基因在RNA和蛋白水平表达的变化。结果:RT-PCR和蛋白印迹检测均显示与转染pcDNA3.1( )空质粒相比,转染pcDNA3.1-mPer2入B16细胞后,p53的表达增高,而c-Myc表达降低。结论:mPer2可能通过抑制细胞癌基因c-Myc的表达,促进抑癌基因p53的表达,从而抑制B16细胞生长,诱导细胞凋亡。     

早期凋亡细胞抑制LPS诱导炎症反应的研究

目的研究早期凋亡细胞的炎症抑制作用。方法以紫外线照射诱导早期凋亡及坏死的Jurkat细胞，用流式细胞仪检测早期凋亡率。建立LPS诱导的小鼠炎症反应模型，分别向炎症部位滴注100μl灭菌磷酸缓冲液、坏死及早期凋亡Jurkat细胞。以HE染色切片病理学检查及激光共聚焦显微镜检查各处理组小鼠肺组织炎症反应程度；以双夹心ELISA、Westem blot、RT-PCR等方法检测不同处理后小鼠炎症反应状态下细胞因子分泌和表达变化。结果和注入灭菌磷酸缓冲液及坏死细胞相比，向炎症部位滴注早期凋亡细胞后，病理检查肺组织炎症反应程度明显减轻；激光共聚焦显微镜检查，肺间质CD3阳性荧光明显减少；肺组织Westem blot及RT-PCR结果表明，注入外源性早期凋亡细胞后，LPS刺激下肺组织炎症性细胞因子MIP-2、TNF—α的分泌及表达减少，抗炎性细胞因子TGF-β1分泌增强；当TGF-β1中和抗体和早期凋亡细胞共同滴入后，炎症性细胞因子MIP-2、TNF-α的表达及分泌有所上调。腹腔灌洗液ELISA结果表明，早期凋亡细胞增强了LPS刺激的炎症性腹腔内抗炎性细胞因子TGF-β1的分泌，抑制炎症性细胞因子MIP-2、TNF-α的分泌。加入TGF-β1中和抗体后逆转了早期凋亡细胞对MIP-2、TNF-α分泌的抑制作用。结论早期凋亡细胞通过增强炎症部位TGF-β1的分泌，抑制MIP-2、TNF-α的表达及分泌，从而发挥一定的炎症抑制作用。     

白血病细胞TGF-β1含量减少及外源性TGF-β1基因对HL-60细胞的作用

目的：研究白血病细胞是否存在转化生长因子β1（TGF-β1）量的异常以及这种异常在白血病发病机制中的可能作用。 方法： 应用ELISA法检测白血病细胞株和原代白血病细胞培养上清TGF-β1水平，进一步应用脂质体介导基因转移法将TGF-β1基因转染HL-60细胞，采用有限稀释法及G418筛选得到抗性细胞，应用RT-PCR、白血病细胞集落培养、裸鼠移植瘤成瘤试验、片段化DNA分析、流式细胞术检测HL-60细胞内TGF-β1、bcl-2、端粒酶反转录酶（hTERT）mRNA的表达变化等方法了解外源性TGF-β1基因对HL-60细胞体内外增殖、凋亡的影响。 结果： 白血病细胞株和原代白血病细胞培养上清TGF-β1水平明显低于正常对照组(P<0.01)，转染TGF-β1基因后，HL-60细胞内TGF-β1 mRNA表达上调，bcl-2、hTERT mRNA表达下调，细胞体外增殖受抑制，集落形成抑制率达78.3%，裸鼠移植瘤生长受抑制，荷瘤鼠生存期延长，细胞呈现凋亡特征性的梯形条带，凋亡比例达73.4%。 结论： 内源性TGF-β1水平降低是白血病的发病机制之一,外源性TGF-β1基因能够抑制HL-60细胞增殖，诱导细胞凋亡,该基因通过下调bcl-2、hTERT mRNA的表达而发挥作用。     

结核杆菌抗原Ag85B诱导抗黑素瘤免疫应答及其机制研究

目的：探讨Ag85B在诱发抗黑素瘤免疫应答中的作用,以及其用于肿瘤免疫治疗的可行性。方法：经背部皮下接种黑色素瘤细胞株B16建立C57BL/6小鼠荷瘤模型,并分为对照1、2组和实验组。于荷瘤模型建立后,对照1、2组经背部皮下分别接种B16细胞和B16/pcDNA3细胞,实验组背部皮下接种B16/pcDNA3-Ag85B细胞。分别观测3组小鼠肿瘤的体积、生存时间和血清中的IFN-γ及IL-4的含量。研究Ag85B在诱导抗肿瘤免疫应答中的作用。结果：从13d到23d,对照1组和对照2组荷瘤小鼠,肿瘤的平均体积分别从1.1058cm^3和0.9123cm^3增长到7.5983cm^3和5.8746cm^3;而实验组荷瘤小鼠,肿瘤的平均体积由0.5158cm^3增长到1.5080cm^3。对照1组和对照2组荷瘤小鼠的平均生存时间分别为24.1d和24.7d,而实验组荷瘤小鼠的平均生存时间为27.8d。13d内,两对照组和实验组小鼠血清IFN-γ的含量均有所上升（对照1组、对照2组和实验组分别上升至26.3ng/L、23.0ng/L和25.2ng/L）,随后两对照组小鼠血清IFN-γ的含量均呈下降趋势（对照1组和对照2组分别下降至19.3ng/L和18.3ng/L）,而实验组小鼠血清IFN-γ的含量则呈上升趋势（上升至46.5ng/L）。13d内,两对照组和实验组小鼠血清IL-4的含量均有轻微升高,随后逐渐下降,但3组小鼠血清IL-4含量的变化差异不明显。结论：接种B16/pcDNA3-Ag85B细胞的实验组小鼠血清中IFN-γ的含量明显增高,并可抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠生存的时间。     

接种卡介苗对热休克蛋白65-MUC1抗原肽融合蛋白抑瘤作用的影响

目的：探讨接种卡介苗对热休克蛋白65-MUC1抗原肽融合蛋白（HSP65-MUC1）所激发的抑瘤作用的影响。方法：给经卡介苗免疫后产生HSP65抗体的小鼠注射HSP65-MUC1融合蛋白3次，然后给小鼠接种MUC1阳性的B16肿瘤细胞，观察HSP65-MUC1融合蛋白对MUC1阳性的B16肿瘤细胞在已产生HSP65抗体的小鼠体内生长的抑制作用。结果：HSP65-MUC1能够显著抑制MUC1阳性的B16肿瘤细胞在已产生HSP65抗体小鼠体内的生长，HSP65-MUC1组小鼠的肿瘤重量和体积显著地低于PBS组。结论：接种卡介苗并不影响HSP65-MUC1所激发的对MUC1阳性B16肿瘤细胞生长的抑制作用。     

卵巢癌耐药细胞对活化CD4~+T细胞免疫活性的抑制及其机制

目的探讨卵巢癌顺铂耐药肿瘤细胞对活化CD4~+T细胞的抑制作用及其机制,为卵巢癌耐药患者的免疫治疗提供理论依据。方法用中等浓度间歇作用法建立耐顺铂卵巢癌细胞SKOV3/CDDP,MTT法测定细胞耐药指数及交叉耐药性,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率。ELISA检测肿瘤细胞培养上清液中TGF-β1、IL-10的含量。抽取正常人外周血用免疫磁珠分离CD4~+T细胞,用CD3和CD28抗体刺激活化CD4~+T细胞。用含20%肿瘤培养上清液培养,ELISA检测CD4~+T细胞IL-2表达量的变化,Western blot检测CD4~+T细胞内NF-κB、Snail的表达变化及肿瘤细胞中TGF-β1、P-smad2/3的表达变化;将肿瘤细胞与活化的CD4~+T淋巴细胞共培养,计数CD4~+T细胞增殖情况,HE染色观察肿瘤细胞对活化CD4~+T细胞黏附的抑制作用。结果SKOV3/CDDP的耐药指数为32.4,对阿霉素、紫杉醇产生交叉耐药性,在CDDP作用下,SKOV3/CDDP凋亡率明显降低。与SKOV3细胞相比,SKOV3/CDDP细胞培养上清TGF-β1表达量升高,SKOV3/CDDP培养上清能抑制活化的CD4~+T淋巴细胞IL-2的表达,抑制CD4~+T淋巴细胞的增殖及黏附作用;Western blot检测显示CD4~+T细胞内NF-κB、Snail的表达降低;SKOV3/CDDP细胞中TGF-β1和P-smad2/3的表达升高(P0.01)。结论 SKOV3/CDDP耐药细胞TGF-β1/P-smad信号通路激活,细胞分泌TGF-β1增多,对活化CD4~+T淋巴细胞的增殖及黏附起抑制作用,可能是通过抑制CD4~+T细胞内的NF-κB/Snail信号通路实现的。     

靶向叉头框蛋白J2的CRISPR/Cas9基因敲除质粒的构建及其对肝癌细胞转化生长因子β/Smads表达和增殖的影响

目的 构建靶向叉头框蛋白J2（FOXJ2）的规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9（CRISPR/Cas9）基因敲除质粒,探讨干扰FOXJ2基因后对小鼠肝癌细胞Hepa1-6的信号通路转化生长因子β/Smads家族蛋白（TGF-β/Smads）表达和增殖的影响。 方法 设计小鼠FOXJ2的小向导RNA（sgRNA）序列,与PX458载体连接并转化感受态大肠埃希菌,挑取单克隆扩增提质粒。利用脂质体将重组质粒PX458-FOXJ2-sgRNAs转染入肝癌细胞Hepa1-6,对照组只转染空载体,48 h后RT-PCR检测对Hepa1-6细胞FOXJ2的抑制作用,同时检测FOXJ2被抑制后TGF-β和Smads的表达情况;MTT法检测干扰FOXJ2后对肝癌细胞增殖能力的影响。 结果 成功构建3个FOXJ2的CRISPR/Cas9基因敲除质粒PX458-FOXJ2-sgRNAs,其中质粒PX458-FOXJ2-sgRNA2可以有效抑制FOXJ2的表达,同时检测到干扰了FOXJ2的细胞的TGF-β、Smad2和Smad4的表达均高于对照组,差异显著;并且FOXJ2被抑制组肝癌细胞的增殖能力明显提高。 结论 小鼠肝癌细胞中的FOXJ2基因在一定程度上抑制TGF-β、Smad2和Smad4基因的表达,抑制细胞的增殖,推测在体情况下,肝癌细胞的增殖和TGF-β信号通路的激活与FOXJ2基因的负调控有一定的相关性,FOXJ2可以作为肝癌预防和治疗的靶点分子进行干预。     

转移程度不同的小鼠肝癌细胞株对腹腔巨噬细胞免疫功能的影响

目的 研究转移程度不同的小鼠肝癌细胞株对腹腔巨噬细胞功能的影响.方法 在两株转移程度不同的小鼠腹水型肝癌模型中,取荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞,检测其在干扰素γ(IFN-γ)和脂多糖(LPS)刺激下产生一氧化碳(NO)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平,并检测其活化后的杀伤能力.进一步采用夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,研究不同荷瘤小鼠腹水中IFN-γ与转化生长因子β1(TGF-β1)的水平,并用相应抗体封闭TGF-β1后,检测活化巨噬细胞产生NO能力及杀伤活性.结果 经IFN-γ和LPS活化后,荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO和TNF-α能力明显低于正常巨噬细胞,杀伤能力下降.高转移性肝癌小鼠巨噬细胞分泌NO水平和杀伤能力均低于低转移性小鼠,但其分泌TNF-α量较高.此外,荷瘤小鼠腹水含较高水平IFN-γ与TGF-β1,不同转移程度荷瘤小鼠IFN-γ水平接近,但高转移性肝癌小鼠腹水含更多TGF-β1,而且TGF-β1的封闭可导致与肿瘤细胞共培养的巨噬细胞分泌NO的能力部分恢复.结论 肿瘤细胞可以通过分泌TGF-β1等抑制性因子下调巨噬细胞的活性和免疫功能.肿瘤的转移程度可能与其分泌免疫抑制因子的能力相关.     

Hsp70L1增强肿瘤细胞疫苗免疫原性的研究

目的:考察Hsp70L1对肿瘤细胞免疫原性的增强作用。方法:用RT-PCR的方法,从小鼠黑色素瘤B16细胞和C57BL/6小鼠脾脏中获得TRP2153-243及Hsp70L1基因。分别插入pcDNA3.1/V5-His真核表达载体,构建pHSP70L1、pTRP和pTRP2-Hsp3种表达载体。分别转染B16肿瘤细胞并制备坏死或凋亡瘤苗,免疫C57BL/6小鼠后移植B16肿瘤细胞,观察肿瘤生长曲线,采用流式细胞术(FCM)或微量细胞毒的方法检测荷瘤小鼠细胞因子INF-γ和CTL活性。结果:将经过HSP70L1、TRP2及TRP2-HSP基因修饰的坏死或凋亡的B16肿瘤细胞免疫正常小鼠后,观察到Hsp70L1及TRP2-Hsp基因修饰的坏死瘤苗可显著抑制荷瘤鼠肿瘤的生长,并显著促进荷瘤鼠脾脏淋巴细胞CTL活性和IFN-γ产生(P0.05,P0.01);HSP70L1免疫刺激作用在坏死瘤苗中更明显。结论:Hsp70L1可明显提高B16瘤苗的免疫原性,且对坏死细胞瘤苗的作用更显著。     

芒柄花黄素通过TLR4/NF-κB通路抑制肝癌荷瘤小鼠肿瘤免疫逃逸北大核心CSCD

目的:揭示芒柄花黄素对肝癌免疫逃逸的作用机制。方法:采用不同浓度(50、100、200μg/ml)芒柄花黄素处理人肝癌细胞系HepG2 24 h,CCK-8检测细胞增殖,Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡。雄性C57BL/6小鼠皮下接种HepG2细胞(4×105个)建立荷瘤小鼠模型,10/50 mg(/kg·d)芒柄花黄素治疗28 d,计算抑瘤率。qRT-PCR、Western blot检测小鼠肝癌组织和HepG2细胞TLR4和NF-κB p65表达,ELISA检测小鼠血清和HepG2细胞TNF-α、IL-1β和IL-10水平。结果:芒柄花黄素可提高HepG2细胞增殖抑制率和凋亡率(P<0.05),降低荷瘤小鼠血清和HepG2细胞TNF-α、IL-1β和IL-10水平(P<0.05),提高荷瘤小鼠抑瘤率(P<0.05),降低荷瘤小鼠肿瘤组织和HepG2细胞TLR4和细胞核NF-κB p65蛋白表达(P<0.05),且呈剂量依赖性。结论:芒柄花黄素通过抑制TLR4/NF-κB通路介导的肿瘤免疫逃逸抑制肝癌发生发展。     

髓样抑制细胞免疫抑制机理的研究

目的:研究荷瘤小鼠来源的髓样抑制细胞(Myeloid derived suppressor cell,MDSC)在肿瘤免疫抑制中的作用机理。方法:用Percoll分离法从荷瘤小鼠的脾脏和骨髓中分离Gr-1+CD11b+MDSC;用流式细胞术检测MDSC对T细胞增殖的抑制作用;分别用生化法和ELISA技术检测MDSC体外培养上清中抑制性因子NO、ROS和IL-10、TGF-β的含量。结果:MDSC在荷瘤小鼠的脾脏和骨髓中聚集增多,且其在骨髓中所占的比例显著高于脾脏;MDSC可以明显抑制脾脏细胞的增殖,体外培养6小时的MDSC可以分泌大量NO、ROS和IL-10、TGF-β。结论:本实验进一步证实MDSC可以通过分泌大量NO、ROS和IL-10、TGF-β抑制T细胞增殖。     

过表达TGF-β1可抑制人宫颈癌细胞系C-33A增殖和促进凋亡

目的研究TGF-β1基因转染对人宫颈癌细胞系(C-33A)增殖和凋亡的影响。方法取增殖状态良好的宫颈癌细胞C-33A,用基因转染的方法建立TGF-β1过表达质粒,用RT-PCR和Western blot法分别检测TGF-β1 mRNA和蛋白的表达及其Bcl-2和Bax的表达;用MTT实验、Transwell小室迁移实验和流式细胞术分别检测细胞的增殖率、迁移率及凋亡率。结果 TGF-β1 mRNA和蛋白在宫颈癌C-33A细胞中的表达低于其他细胞(P0. 05); TGF-β1抑制Bcl-2的表达(P0. 05)、促进Bax的表达(P0. 05);过表达TGF-β1细胞的增殖与迁移速度低于其他细胞(P0. 05),但凋亡速度高于其他细胞(P0. 05),且这种降低与升高均呈时间依赖性。结论过表达的TGF-β1可明显抑制宫颈癌细胞的增殖和促进凋亡。     

转化生长因子-β/Smad信号对人横纹肌肉瘤细胞RD生长和凋亡的调控

目的研究TGF-β／Smad信号对人胚胎性横纹肌肉瘤细胞系RD生长和凋亡的调控作用。方法采用小分子RNA干扰(RNAi)技术,以阳离子脂质体为载体,将生物合成的发夹状短链RNA(shRNA)转染RD细胞,封闭Smad4的表达以阻碍内源性TGF-β／Smad信号的转导;采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检验shRNA干扰Smad4表达的效果;采用免疫荧光化学,通过激光共聚焦显微镜检测Smad4封闭前后RD细胞中Smad2／3表达位置的变化;应用四甲基偶氮唑盐(MTY)和。H-thymidine摄入实验检测阻碍内源性TGF-β／Smad信号转导和以外源性TGF-β1刺激这2种条件下RD细胞的生长状况;采用流式细胞术和荧光化学染色检测上述2种条件下RD细胞的凋亡情况。结果RNAi技术可有效封闭RD细胞中Smad4 mRNA和蛋白的表达;Smad4的封闭导致Smad2／3由胞质入核明显减少;内源性TGF-β／Smad信号转导受阻不但抑制RD细胞生长,并且诱导凋亡;外源性、较高浓度的TGF-β1可抑制RD细胞生长,但不诱导凋亡。结论TGF-β／Smad信号在一定的浓度范围内精细调控RD细胞的生长和凋亡。     

p16INK4A和 p15INK4B对人肝癌细胞增殖和凋亡影响的研究

目的　为探讨抑癌基因 p16 INK4 A和 p15 INK4 B对 Rb基因状态不同的人肝癌细胞系增殖和凋亡的影响。方法　在分析细胞系遗传背景鉴定基础上采用脂质体将构建的 p XJ- p16、p XJ- p15重组质粒转染人肝癌细胞系 BEL74 0 2 (p16 / p15 Rb )和 SMMC772 1(p16 / p15 / Rb- )。应用 PCR、RNA斑点印迹、MTT、集落形成、流式细胞仪等技术检测外源性 p16和 p15基因、m RNA表达及其对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。结果　经转染的 BEL74 0 2 - p16 ,BEL74 0 2 - p15细胞 ,分别存在外源性 p16、p15基因 ,在含外源基因细胞中相应的 m RNA表达增强 ;BEL74 0 2 - p15细胞生长速度、集落形成率显著低于对照细胞 BEL 74 0 2 (P<0 .0 1) ;细胞周期分析观察到与亲本细胞比较 ,BEL 74 0 2 - p15的 G1期细胞由 37.7%增高到 4 3.6 % ,S期细胞由 2 2 %下降到 13% (P<0 .0 5 ) ,并出现 G1亚峰 (凋亡峰 )。与此相反 ,BEL74 0 2 - p16细胞增殖未见抑制 ,细胞周期分布无明显差异 ,集落形成率也未见减少。此外 ,SMMC772 1- p16细胞增殖也无抑制。结论　外源性 p15 INK4 B具有抑制人肝癌细胞生长 ,诱导细胞凋亡的作用 ,其作用不受内源性p15影响。而 p16 INK4 A对肝癌细胞生长抑制的作用可能依赖于 RB途径的完整性。     

RNA干扰HAS2基因表达对多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞生物学特性及免疫因子的影响

目的:探讨透明质酸合成酶2(HAS2)基因在多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠表达及RNA干扰其表达对卵巢颗粒细胞活力、凋亡及免疫抑制因子TGF-β1和VEGF表达的影响。方法:建立DHEA致雌性SD大鼠PCOS模型,Western blot检测PCOS大鼠卵巢组织中HAS2的蛋白表达;培养原代PCOS大鼠卵巢颗粒细胞,将合成的靶向抑制HAS2表达的siRNA转染到细胞中,Western blot检测转染效果及转染后48 h各组细胞中免疫抑制因子TGF-β1、VEGF和NF-κB信号通路相关蛋白的表达。CCK8及流式细胞仪分别检测细胞活力和凋亡率。结果:HAS2在PCOS大鼠卵巢组织中高表达,转染si-HAS2的大鼠卵巢颗粒细胞中HAS2的表达显著低于NC组和对照组(P 0. 05);与NC组比较,si-HAS2组细胞活力显著降低,凋亡率增加,TGF-β1、VEGF及NF-κB信号通路p-NF-κB、p-IκBα和下游cyclin D1、survivin的蛋白表达均显著降低(P 0. 05)。结论:HAS2在PCOS大鼠卵巢组织中高表达,抑制大鼠卵巢颗粒细胞中HAS2表达可降低细胞活力,诱导细胞凋亡,下调免疫抑制因子TGF-β1、VEGF及NF-κB信号通路表达。     

EGFR/HER2基因敲减对SPC-A-1细胞株细胞生物学特性及相关信号通路的影响

目的： 探讨EGFR/HER2基因沉默对非小细胞肺癌细胞株EGFR酪氨酸激酶信号转导通路的交互影响及其与细胞增殖、凋亡和周期改变的关系。方法： 设计并合成EGFR、HER2及 EGFR/HER2共干扰序列,构建含干扰序列的载体,进行瞬时转染;应用实时荧光定量、蛋白印迹法检测基因沉默效果;用四甲基偶氮唑盐比色法、流式细胞仪检测基因沉默后生物学特性改变;蛋白印迹法检测EGFR下游信号通路蛋白Akt、p-Akt、p-Erk1/2、p-p38表达水平变化;采用SPSS13.0软件分析结果。结果： 在SPC-A-1细胞系中,EGFR干扰组、HER2干扰组、EGFR联合HER2干扰组和EGFR-HER2共干扰组体外细胞增殖率均有下降趋势;除EGFR干扰外,其余各组均可诱发凋亡;各组的细胞周期G1期和S期细胞比例有显著改变;基因沉默效果检测显示EGFR和HER2基因蛋白水平被下调。下游信号通路蛋白检测示EGFR下游信号通路蛋白Akt、p-Akt、p-Erk1/2、p-p38表达水平和细胞增殖、凋亡以及细胞周期改变之间未发现明显相关规律。结论： 单纯EGFR干扰SPC-A-1细胞不能诱发显著凋亡,HER2和EGFR/HER2基因共沉默后诱发的人肺腺癌SPC-A-1细胞凋亡比阴性对照显著增加。EGFR/HER2基因沉默后诱发的细胞增殖、凋亡和细胞周期改变与EGFR家族下游信号通路蛋白之间未发现显著相关关系。     

芳维A酸乙酯对体外培养小鼠肾小球系膜细胞增殖、凋亡及TGF-β1分泌的影响

目的研究芳维A酸乙酯(AE)对体外培养小鼠肾小球系膜细胞(GMC)增殖、凋亡及TGF-β1表达的影响。方法采用MTT法检测芳维A酸乙酯(AE)、全反式维A酸(atRA)对GMC增殖的影响;采用流式细胞仪检测AE干预后GMC的凋亡情况;采用ELISA法检测AE干预后GMC培养上清液中TGF-β1的含量。结果与正常组对比,AE干预组GMC增殖受到抑制(P<0.05),且当浓度在10~(-8)到10~(-5)mol/L范围内时,作用成剂量依赖性。AE能够诱导GMC的凋亡,正常组、10~(-7)mol/L、10~(-5)mol/L的AE干预组的GMC细胞凋亡率分别为(1.13±0.36)%、(9.52±0.99)%和(27.23±2.88)%。AE能够抑制GMC的TGF-β1分泌,与空白对照组,AE干预组TGF-β1表达降低(P<0.05)。AE抑制GMC增殖、诱导GMC凋亡及抑制GMC TGF-β1分泌的作用明显强于atRA。结论AE可以抑制体外GMC增殖并能诱导凋亡,其抑制增殖的作用可能与TGF-β1表达降低有关。AE可干预狼疮性肾炎病理病理进程。     

多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞免疫调节功能异常及其在骨髓瘤骨病中的作用

目的 探讨多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓间充质干细胞(MSCs)免疫调节功能及其对骨髓瘤骨病的影响.方法 分离MM患者和正常对照MSCs,流式细胞技术比较二者的免疫表型.Real-time PCR检测实验组及对照组MSCs的TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、IL-6、IL-3、TNF-α、FasL和NF-κB配体的受体激活物(RANKL)表达量.共培养系统与流式细胞术检测MSCs对T细胞增殖、凋亡和早期活化标志CD25和CD69表达的影响.Von kossa染色、real-time PCR和Western blot等技术检测T细胞对正常对照MSCs向成骨细胞分化的影响.结果 MM来源和正常对照MSCs具有相似的形态学和免疫表型.MM来源的MSCs表达TGF-β1、IL-6、IL-3、TNF-α和RANKL较正常对照MSCs增加,而TGF-β2、TGF-β3和FasL的表达下降.MM来源的MSCs对T细胞增殖的抑制作用明显减弱.正常对照MSCs较MM来源MSCs使更多T细胞静止于G0/G1期.正常对照MSCs明显促进T细胞凋亡,而MM来源的MSCs对T细胞的促凋亡作用减弱.正常对照MSCs明显抑制T细胞活化分子表达,而MM患者的MSCs此抑制作用明显降低.与MM患者的MSCs共培养后的T细胞以及直接来源于MM患者的T细胞均可以明显抑制正常对照MSCs向成骨细胞分化.结论 MM患者的MSCs免疫调节功能较正常对照MSCs降低,主要表现为抑制T细胞活化的功能减弱,而活化的T细胞可抑制MSCs向成骨细胞分化,此可能为骨髓瘤骨病发病机制之一.