白介素-1β对MN9D细胞Nurrl及酪氨酸羟化酶表达的影响

利用具有未成熟特性的多巴胺(DA)合成细胞系MN9D,观察白介素-lbeta(IL-1β)对MN9D细胞内源性孤儿核受体Nurrl表达的作用,并研究Nrrl表达增高对MN9D细胞酪氨酸羟化酶(1H)表达的影响,探讨Nurrl调控DA能神经元发育的机制.用20 ng/ml的IL-1β作用于MN9D细胞,于IL-1β作用的2、4、6 h用相差显微镜观察细胞形态的变化,并采用免疫细胞化学染色及Western blot方法榆测IL-1β作用后MN9D细胞内源性Nul1蛋白表达的变化,以及Nurrl表达变化对MN9D细胞TH表达的影响.结果显示:经20 ns/ml的IL-1β作用2、4、6 h,MN9D细胞的形态与未经IL-1β作用的细胞相比没有明显改变.从加入IL-1β2 h起,直至6 h,MN9D细胞Nul1免疫荧光染色强度比未加IL-1β作用的正常对照组细胞明显增强,但此时MN9D细胞中TH阳性细胞的百分比与正常对照组相比没有明显改变(P＞0.05).Western blot结果显示:20 ng/ml的IL-1B作用2、4、6 h,MN9D细胞Nurrl蛋白表达分别为233%、232%和254%,经统计学检验,与正常对照组相比具有显著性差异(P＜0.05).而IL-1β作用2、4、6 h,MN9D细胞TH蛋白的表达分别为97%、107%和105%,但经统计学检验,与正常对照组相比没有显著性差异(P＞0.05).本研究结果表明,IL-1β在2～6 h可迅速明显激活MN9D细胞内源性Nurrl的表达.但此时单纯Nurrl表达增加并不影响MN9D细胞TH的表达;TH的表达激活可能还需要除Nurrl外的其它特殊的细胞(或神经元)的环境或因子的共同作用.     

白介素-1β对MN9D细胞Nurr1及酪氨酸羟化酶表达的影响

利用具有未成熟特性的多巴胺(DA)合成细胞系MN9D,观察白介素-1beta(IL-1β)对MN9D细胞内源性孤儿核受体Nurr1表达的作用,并研究Nurr1表达增高对MN9D细胞酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响,探讨Nurr1调控DA能神经元发育的机制。用20 ng/ml的IL-1β作用于MN9D细胞,于IL-1β作用的2、4、6 h用相差显微镜观察细胞形态的变化,并采用免疫细胞化学染色及Western blot方法检测IL-1β作用后MN9D细胞内源性Nurr1蛋白表达的变化,以及Nurr1表达变化对MN9D细胞TH表达的影响。结果显示:经20 ng/ml的IL-1β作用2、4、6 h,MN9D细胞的形态与未经IL-1β作用的细胞相比没有明显改变。从加入IL-1β2 h起,直至6 h,MN9D细胞Nurr1免疫荧光染色强度比未加IL-1β作用的正常对照组细胞明显增强,但此时MN9D细胞中TH阳性细胞的百分比与正常对照组相比没有明显改变(P>0.05)。Western blot结果显示:20 ng/ml的IL-1β作用2、4、6 h,MN9D细胞Nurr1蛋白表达分别为233%、232%和254%,经统计学检验,与正常对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。而IL-1β作用2、4、6 h,MN9D细胞TH蛋白的表达分别为97%、107%和105%,但经统计学检验,与正常对照组相比没有显著性差异(P>0.05)。本研究结果表明,IL-1β在2～6 h可迅速明显激活MN9D细胞内源性Nurr1的表达,但此时单纯Nurr1表达增加并不影响MN9D细胞TH的表达;TH的表达激活可能还需要除Nurr1外的其它特殊的细胞(或神经元)的环境或因子的共同作用。     

吗啡对大鼠海马神经元钾、钙通道的作用

吗啡是常见的阿片类镇痛药,长时间应用可导致吗啡耐受和依赖,其作用机制十分复杂。海马中同时包含μ,κ,δ阿片受体,与吗啡耐受及依赖有一定的关系,并参与机体的痛觉调制过程,因而了解吗啡对海马神经元离子通道的作用对阐明吗啡的镇痛、耐受及依赖机制具有重要的理论及实际意义。本文报导吗啡对培养的海马神经元电压门控性钾、钙     

Forskolin上调MN9D细胞Nurr1的表达及Nurr1过表达对酪氨酸羟化酶的影响

目的寻找能激活MN9D细胞内源性孤儿核受体（Nurr1）表达的信号分子,研究Nurr1表达增高对酪氨酸羟化酶（TH）表达的影响,探讨激活Nurr1表达的信号机制。方法用蛋白激酶A激动剂Forskolin或蛋白激酶C激动剂PMA作用于MN9D细胞,用免疫荧光细胞化学及Westernblot方法检测MN9D细胞内源性Nurr1表达的变化,以及Nurr1表达增加对TH表达的影响。利用PKA信号转导通路的特异性抑制剂H89探讨激活Nurr1表达的信号机制。结果1．从加入Forskolin1h起,直至6h,MN9D细胞Nurr1表达比未加Forskolin组明显增加（P〈0．05）;Forskolin主要增加MN9D细胞核内Nurr1含量,而细胞浆内Nurr1含量变化不明显;Forskolin作用后MN9D细胞TH表达无明显变化。2．用蛋白激酶A的特异性抑制剂H89预处理后,Forskolin仍具有增加Nurrl表达的作用。结论Forskolin可增加MN9D细胞内源性Nurr1表达及核转位,单纯Nurr1表达及核转位增加不影响MN9D细胞TH的表达,TH表达的激活可能还需要其他特殊的细胞（或神经元）环境或共激活因子的共同作用。Forskolin增加MN9D细胞内源性Nurr1表达及核转位的作用不是主要通过激活PKA信号转导通路完成的。     

不同时程吗啡依赖对大鼠中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元的影响

目的:观察不同时程吗啡依赖对大鼠中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)多巴胺能神经元的影响。方法:建立吗啡慢性依赖大鼠模型,石蜡包埋组织连续切片,免疫组织化学染色观察多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达变化。结果:TH免疫组化结果显示随着吗啡依赖时间的延长VTA区内TH阳性细胞逐渐减少,吗啡依赖6周组阳性细胞减少明显。结论:较长时程吗啡依赖大鼠VTA多巴胺能神经元损伤明显。     

蛋白激酶Cδ在6-OHDA诱导大鼠多巴胺能神经元损伤过程中的作用

目的:探究蛋白激酶Cδ(PKCδ)对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森病(PD)模型大鼠多巴胺能神经元损伤的影响及其机制。方法:50只2月龄雄性SD大鼠,随机分为对照组(control)和6-羟基多巴胺注射组(6-OHDA)。通过大鼠右侧纹状体注射6-OHDA溶液构建PD模型。运用旋转实验和圆筒实验检测平均旋转速率和右上肢使用率,利用免疫组化染色观察大鼠黑质致密部(SNc)酪氨酸羟化酶(TH)的表达,利用Western Blot检测大鼠SNc部位线粒体中PKCδ和胞质中细胞色素c(Cyt c)及TH的表达情况,通过免疫荧光染色观察PKCδ定位。结果:6-OHDA组大鼠平均旋转速率及右上肢使用率明显增加,TH阳性神经元形态及分布异常且TH蛋白表达减少,线粒体PKCδ表达增多,胞质中Cyt c增多,免疫荧光染色显示PKCδ与线粒体蛋白发生共定位现象。结论:PKCδ可能通过线粒体转移参与调节6-OHDA诱导的大鼠多巴胺能神经元损伤。     

Lactacystin诱导大鼠黑质小胶质细胞的变化及炎性介质的表达

目的:观察蛋白酶体抑制剂Lactacystin诱导大鼠黑质小胶质细胞的变化及炎性介质的表达。方法:采用立体定向术将不同剂量(2μg,10μg)的蛋白酶体抑制剂Lactacystin注射至大鼠黑质部位,免疫组织化学法观察黑质区多巴胺能神经元和小胶质细胞的变化及炎性介质环氧化酶-2(COX-2)、核转录因子κB(NF-κB)的表达。结果:注射不同剂量Lactacystin14d,阿扑吗啡腹腔注射后2μgLactacystin组大鼠无旋转行为,10μgLacta-cystin组出现典型旋转行为;8周后2μgLactacystin组大鼠损毁侧黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数明显减少,2μg和10μgLactacystin组黑质小胶质细胞数量均增加,炎性介质COX-2、NF-κB表达均增强。结论:蛋白酶体抑制剂Lactacystin能激活大鼠黑质小胶质细胞,诱导炎性介质表达。     

外源性Nurr1基因过表达对SK-N-SH细胞分化作用的研究

为研究外源性Nurr1基因过表达对转染细胞的作用,探讨Nurr1基因调控多巴胺能神经元分化的机制。本研究应用:(1)pBK- RSV -Nurr1质粒经脂质体法转染SK- N- SH细胞,G418筛选;用RT PCR和免疫细胞化学方法检测基因转染细胞Nurr1mRNA及Nurr1蛋白的表达; (2)all- trans- RA、9- cis- RA、forskolin诱导基因转染细胞,RT PCR及免疫荧光细胞化学方法检测基因转染细胞MAP2 和TH的表达。结果显示: (1)经RT -PCR检测,基因转染细胞表达Nurr1mRNA;免疫细胞化学染色结果显示基因转染细胞表达Nurr1蛋白,说明外源性Nurr1基因在转染细胞内过表达;基因转染细胞形态与正常细胞相比没有明显变化,生长速度略有降低并表达成熟神经元的特异性标识物MAP2,但不表达多巴胺能神经元的特异性标识物TH。(2)尽管RA、forskolin诱导可促进Nurr1基因转染的SK- N- SH细胞进一步向成熟神经元分化,但不能诱导基因转染细胞表达TH。结论:单纯的Nurr1过表达可以促进SK- N- SH细胞向成熟神经元方向分化,但不足以激活TH基因转录。TH基因的转录激活还需要除Nurr1以外的其它细胞(或神经元)的环境或因子的共同作用。     

核受体相关因子1基因转染神经干细胞移植治疗帕金森病

目的 探讨转染核受体相关因子1(Nurr1)基因的神经干细胞(NSCs)移植至帕金森病(PD)大鼠纹状体后向多巴胺能神经元的分化及对PD大鼠行为的影响.方法 应用脑立体定位技术构建单侧PD大鼠模型.将PD大鼠随机分为3组,每组8只.假手术组注射生理盐水,NSCs组移植未转染的NSCs,Nurr1组先将重组质粒载体pEGFP-N1-Nurr1转染NSCs,用RT-PCR方法及免疫荧光染色检测Nurr1基因的表达效果,然后用转染Nurr1 基因的NSCs进行移植.细胞用DIL标记后移植至PD大鼠右侧纹状体中,术后2周起用阿朴吗啡诱发旋转试验观测移植后大鼠行为改善情况,12周后用免疫荧光技术检测移植细胞中酪氨酸羟化酶(TH)的表达.结果 重组质粒转染后Nurr1基因能在NSCs中过表达.移植后假手术组和NSCs组PD大鼠的旋转圈数均无下降趋势,两者差异无统计学意义(P＞0.05);NSCs组移植区可见DIL阳性细胞,但TH免疫阳性细胞较少,平均每视野为(3.21±0.40)个;Nurr1组移植后PD大鼠的旋转圈数从第6周开始下降,移植区DIL/TH双标神经元每视野达(9.28±1.09)个.结论 Nurr1基因过表达能诱导NSCs在PD大鼠纹状体内分化为TH阳性的多巴胺能神经元,并在一定程度上改善大鼠的行为功能.     

银杏内酯B体外诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化

目的:探讨银杏内酯B(GKB)对大鼠中脑神经干细胞(NSCs)体外诱导分化为多巴胺能神经元的作用。方法:采用无血清培养技术从大鼠胚胎中脑组织中分离培养出神经干细胞克隆球,然后分为2组诱导分化,对照组分化培养液中仅含10%FBS,银杏内酯B组在对照组分化培养液的基础上加入终浓度为40μg/ml的银杏内酯B。2周后免疫印迹检测分化的细胞中多巴胺能神经元发育和分化调节因子Nurr1蛋白的表达情况;免疫荧光检测分化神经元中酪氨酸羟化酶(TH)标记的多巴胺能神经元数量和分化情况。结果:对照组Nurr1蛋白相对表达量很低,仅有极少量的神经干细胞分化为不成熟的多巴胺能神经元;银杏内酯B组Nurr1表达显著升高,分化的多巴胺能神经元较多,且细胞形态较成熟,突起较丰富。结论:银杏内酯B具有诱导中脑NSCs向多巴胺能神经元分化的作用,其作用机制可能与上调Nurr1表达有关。     

α-突触核蛋白过表达对黑质多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶表达的影响

目的 研究α-突触核蛋白(α-synuclein，α-SYN)过表达对多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。方法 在α—SYN基因转染的MES 23．5大鼠黑质多巴胺能神经元细胞系，分别用免疫组织化学、免疫荧光、Western blot等方法分析α-SYN和TH的表达以及两者之间的关系。通过绘制生长曲线和MTT测试细胞氧化还原活性，观察α—SYN基因转染细胞的生长和损伤情况。结果 α-SYN过表达明显抑制MES 23．5多巴胺能神经元的TH表达，但对该细胞的生长和增殖无明显影响，也不引起该细胞损伤。结论 α-SYN过表达对多巴胺能神经元的TH表达具有抑制作用。     

CX3CR1参与雷公藤内酯对MPP~+帕金森病大鼠多巴胺能神经元的保护作用

目的:探讨雷公藤内酯对1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)帕金森病模型大鼠的保护作用及其可能机制。方法:采用MPP+黑质内注射建立帕金森病大鼠模型。实验分为假手术组、模型组、雷公藤内酯组及其溶剂对照组,利用酪氨酸羟化酶(TH)免疫荧光强度测定多巴胺神经元存活率、小胶质细胞标记物OX-42免疫荧光强度测定小胶质细胞激活程度、Western blotting测定趋化因子受体CX3CR1表达量。结果:免疫组化结果表明,MPP+黑质内注射可使模型组OX-42免疫荧光强度增高,DA神经元进行性变性死亡。雷公藤内酯组OX-42免疫荧光强度较模型组低(P0.01),TH阳性神经元数量较模型组多(P0.01)。Western blotting结果提示雷公藤内酯组CX3CR1表达量较模型组低(P0.05)。结论:雷公藤内酯对MPP+帕金森病大鼠模型具有神经保护作用,其机制可能与抑制小胶质细胞激活有关,抑制CX3CR1可能是其抑制小胶质细胞的途径之一。     

大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺样神经细胞分化

目的探索大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能样细胞分化。方法全骨髓培养法分离大鼠骨髓间充质干细胞;体外培养至第3代,用碱性成纤维细胞生长因子,抗坏血酸和表皮生长因子诱导分化;免疫荧光法鉴定胞质中的多巴胺神经元相关蛋白的表达;RT-PCR鉴定多巴胺神经元相关基因的表达;ELISA法检测上清及胞质中的多巴胺。结果诱导后,免疫荧光法检测到诱导后的细胞表达多巴胺神经元相关蛋白:酪氨酸羟化酶、多巴胺转运蛋白和神经核蛋白;RT-PCR检测到诱导后的细胞表达多巴胺神经细胞相关基因TH、AADC;ELISA法检测到诱导后的上清及胞质中有多巴胺分泌。结论间充质干细胞具有向多巴胺能样细胞分化的能力。     

胶质细胞源性神经营养因子促进中脑源神经干细胞增殖和向多巴胺能神经元分化

目的:探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对中脑源神经干细胞(mNSCs)增殖、分化能力和表达垂体同源盒家族因子3(Pitx3)、孤儿核受体相关因子1(Nurr1)和酪氨酸羟化酶(TH)蛋白的影响。方法:取E14.5d大鼠中脑组织体外培养原代mNSCs,增殖培养传三代后进行分化实验;使用免疫荧光方法检测培养分化的mNSCs表达Pitx3、Nurr1和TH蛋白。结果:在GDNF作用下,体外培养的mNSCs克隆球直径增大,数量增多;分化的神经元中Pitx3、Nurr1和TH蛋白表达增加(P0.05)。结论:在体外培养条件下,GDNF有促进mNSCs增殖和向多巴胺能神经元分化的作用。     

海洛因依赖大鼠VTA区NMDA受体介导的多巴胺神经元膜电流的变化

目的:探讨海洛因依赖大鼠中脑腹侧被盖区(vental tegmental area,VTA)NMDA受体介导的多巴胺(DA)神经元膜电流的变化。方法:20只SD雄性大鼠随机分成对照组、海洛因依赖组(以下称依赖组)。按剂量递增原则皮下注射给予海洛因,纳络酮催促戒断,确定海洛因依赖模型的建立。免疫组织化学方法标记VTA区DA神经元酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH),脑片膜片钳技术记录其NMDA受体特异性激动剂N-methyl-D-aspartate(NMDA)介导的膜电流。结果:建立的海洛因依赖模型组大鼠催促戒断症状的评分符合成瘾模型评分标准;海洛因依赖组VTA区DA神经元TH表达上调(P<0.05);海洛因依赖组VTA区NMDA受体介导的DA神经元膜电流减小(P<0.05)。结论:海洛因依赖组VTA区DA神经元TH反应增强,神经元的兴奋性受到抑制。     

6-羟多巴诱导大鼠黑质的持续胶质细胞反应

本研究将40μg6- 羟多巴注射到SD大鼠一侧纹状体制作Parkinson病动物模型,研究黑质反应性神经胶质增生在Par kinson病发病过程中的可能作用。筛选成功的模型大鼠,术后12周处死。应用免疫荧光双标记法检测模型大鼠黑质胶质细胞对多巴胺能神经元损伤的反应。结果显示:在注射后12周,损伤侧黑质仍然存在明显的星形胶质细胞反应和小胶质细胞激活。此外,小胶质小结和淋巴细胞浸润的存在提示在注射后12周的注射侧黑质内依然有多巴胺能神经元死亡。结论: 6 -羟多巴对大鼠黑质多巴胺能神经元的急性损伤可以通过胶质细胞反应从而对多巴胺能神经元产生长期的毒性作用。     

Desert Hedgehog诱导大鼠胚胎中脑神经前体细胞定向分化为多巴胺能神经元

目的 研究Desert Hedgehog(DHH)对胚胎中脑神经前体细胞(NPCs)向多巴胺能神经元分化的诱导作用。方法 大鼠DHH病毒上清感染COS7、NIH/3T3和9L细胞, 用免疫荧光、实时定量PCR和Western blot方法检测DHH表达。分离培养大鼠胚胎中脑神经前体细胞，免疫荧光鉴定神经前体细胞的增殖分化特性。条件细胞表达DHH成功后分别与上述NPCs共培养10d，免疫荧光检测酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果 DHH在COS7、NIH/3T3和9L细胞中成功表达；同时，分离培养的大鼠胚胎中脑神经前体细胞具有良好的增殖分化特性，但两者共培养10d后偶见TH阳性的细胞。结论 DHH编码的蛋白不能或不能单独诱导与其共培养的NPCs定向分化为多巴胺能神经元。     

大鼠生后视网膜发育过程中Nurr1与TH的相关关系研究

目的:观察核受体相关因子1(nuclear receptor-related factor 1,Nurr1)与多巴胺能神经细胞特异性标记物酪氨酸羟化酶(TH)在生后大鼠视网膜发育过程中的表达变化,探明Nurr1与视网膜多巴胺能神经元的相关关系。方法:石蜡包埋组织切片,免疫组织化学双重标记。结果:Nurr1在视网膜发育过程中的表达出现了显著的动态变化,Nurr1阳性产物主要表达在内核层细胞,生后3～7 d达到高峰,之后随着细胞的成熟阳性表达又逐渐减少,成熟的视网膜组织内仅见少量Nurr1阳性细胞,在视网膜神经细胞从幼稚到成熟的分化过程中仅见个别TH阳性细胞。Nurr1与TH的免疫组化双标结果显示两蛋白可以共表达在同一细胞中,但众多的Nurr1阳性细胞不表达TH。结论:Nurr1在大鼠视网膜多巴胺能神经细胞及非多巴胺能神经细胞从幼稚到成熟的分化过程中可能具有重要的调控作用。     

Sertoli细胞诱导大鼠胚胎中脑神经干细胞定向分化的研究

目的研究Sertoli细胞对胚胎中脑神经干细胞的营养及向多巴胺能神经元分化的诱导作用。方法将大鼠Sertoli细胞与胚胎13d大鼠中脑神经前体细胞体外共培养5、7、10、14d后,免疫荧光检测神经干细胞标记物Nestin、神经元前体细胞标记物β-Ⅲ tubulin、多巴胺能神经元标记物酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况。结果随着共培养时间的延长,神经干细胞中nestin阳性细胞数量逐渐减少,β-Ⅲ tubulin阳性细胞数在共培养7d时较多,TH阳性的神经元在共培养10d时数量最多。而且在各时间段TH阳性细胞数均多于单独培养的神经前体细胞。结论Sertoli细胞能够诱导与其共培养的胚胎中脑神经干细胞定向分化为多巴胺能神经元。     

类鸦片耐受性的细胞机制

<正> 即使重复使有吗啡可对它的镇痛效果产生耐受和大剂量使用可在一些病人中产生重要的副作用,吗啡仍然广泛地用于治疗中、重度的疼痛。对于外周的类鸦片敏感神经元来说,耐受就是对抑制剂都不敏感。这说明神经元细胞膜的改变是外周神经元耐受性的主要因素,而这种变化会使神经元的敏感性发生非特异性改变。然而在脑内,非特异的敏感性变化可能并不重要。在脑组织中,至少存在着μ,δ和κ三种类鸦片受体。尽管临床上使用的包括吗啡在内的大多数类鸦片制剂优先作用于μ受体,然而实验动物的镇痛则可由药物作用于其中任何一种受体而产生。作用于同一类型受体的不同药物可致交叉耐受性,然而选择性作用于不同类