钙调蛋白信号转导途径的机制及其对心律失常的影响

钙调蛋白(Calmodulin,CaM)对细胞内钙离子(Ca)的浓度具有重要的调节作用。Ca/CaM/钙调蛋白激酶Ⅱ是心肌细胞CaM信号转导的重要途径之一。钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是一种重要的丝/苏氨酸蛋白激2+酶,其表达直接影响心肌细胞的功能和电生理学特性。CaMKⅡ作为Ca调节通路的组成成分,在过度激活时会通过增加钙通道的开放频率而引发心律失常。而且在缺血再灌注初期,CaMKⅡ活性的增加可触发再灌注性心律失常,CaMKⅡ阻断剂对钙超载损伤的心肌细胞有保护作用。     

钙调神经磷酸酶依赖的信号通路的生物学效应

钙调神经磷酸酶(CaN)是体内唯一的Ca2+/CaM依赖的Ser/Thr蛋白磷酸酶,它参与多种生物学效应.如介导T淋巴细胞活化、心肌肥大等,并与其它信号通路之间相互调节.CaN有可能成为某些疾病药物作用的靶点.     

CaM在内耳感觉细胞中的研究进展

随着钙的作用及其机制成为内耳生理研究关键之一。作为胞内Ca2 + 的多功能传感器或受体 ,钙调蛋白 (CaM)介导了很多Ca2 + 调节的生理过程。CaM在内耳感觉细胞中的含量丰富 ,在毛细胞功能的实现与调节中可能发挥着重要作用。     

钙/钙调蛋白激酶Ⅱ信号系统与心血管疾病

CaMKⅡ是钙/钙调蛋白激酶(Ca2 +/calmodulin-dependent protein kinase,CaMK)成员之一.心脏中的CaMK包括Ⅰ,Ⅱ和Ⅳ三种类型,CaMKⅡ含量最多.CaMKⅡ单体由氨基端的催化域、中间部分的调节域和羧基端的结合域组成.钙调蛋白(calmodulin,CaM)与Ca2+结合后...     

钙调蛋白对电压门控性钠通道Na_V 1.1的调节作用

目的探讨钙调蛋白对通道的调节功能,分析钙调蛋白与Na_V1.1 IQ在不同Ca~(2+)离子浓度下的结合情况,进一步探讨钙调蛋白和Na_V1.1结合的Ca~(2+)依赖性。方法应用pull-down技术检测不同Ca~(2+)离子浓度下Na_V1.1 IQ与钙调蛋白及其突变体的结合情况。结果 CaM野生型与Nav1.1 IQ基序的结合随着钙浓度和CaM浓度的增加而增高,而CaM 1234与Nav1.1 IQ的结合也随着CaM_(1234)浓度的增加而增高,但在不同钙浓度下的结合无变化。结论 CaM野生型和CaM_(1234)对电压门控性钠通道Nav1.1具有调节作用。     

Ca_V1.2和钙调蛋白在自发性遗传性癫痫大鼠小脑中的异常表达

目的研究自发性遗传性癫痫大鼠(Tremor,TRM)小脑组织中CaV1.2与钙调蛋白(Calmodulin,CaM)蛋白表达与共定位情况。方法应用Westernblot技术检测CaV1.2与CaM蛋白表达,应用免疫荧光技术定位CaV1.2与CaM蛋白的分布,应用激光共聚焦显微镜检测[Ca2+]。结果 TRM大鼠小脑内CaV1.2的蛋白表达低于正常iWistar大鼠(P<0.05),而CaM的蛋白表达高于正常Wistar大鼠(P<0.05);荧光定位显示CaV1.2与CaM共定位的阳性细胞比率较之正常组表达降低(P<0.01)。与正常的Wistar大鼠相比,急性分离的TRM大鼠小脑神经元中[Ca2+]明显增强。结论 TRM大鼠小脑内CaV1.2和CaM蛋白表达异常可能是癫痫的发病机制之一。     

钙调蛋白激酶Ⅱ的结构及其在神经系统中的作用

钙离子（Ca²⁺ ）是通过局部信号获得特异性刺激的关键细胞内信使分子。Ca²⁺ 结合蛋白,如钙调蛋白（CaM）及其靶蛋白是Ca²⁺ 依赖性反应信号传导的关键靶点。钙/钙调蛋白依赖性蛋白酶Ⅱ（CaMKⅡ）是一种多聚体酶,它是哺乳动物前脑总蛋白的重要组成部分,并且是形成突触后致密部的主要成分。近年来国内外研究显示,CaMKⅡ包含α、β、γ 和 δ 4种亚型,其中α 和 β 主要在神经组织中表达,而 γ 和 δ 则在全身多种组织均有表达,它们参与特定的突触可塑性和记忆巩固过程,对神经系统的兴奋性及一些神经系统疾病的发生起重要作用。前期也有研究表明CaMKⅡδ在促进神经元存活中起重要作用。本文就CaMKⅡ的结构及其在神经系统中的作用和与相关神经系统疾病的关系作一综述。     

神经肽Y活化大鼠心肌细胞内Ca2+及钙调素依赖的钙调神经磷酸酶途径

目的 观察神经肽 Y (NPY)对心肌细胞内Ca2+及钙调素(CaM)依赖的钙调神经磷酸酶(CaN)信号传导途径的影响.方法 以NPY刺激心肌细胞.用环胞素A(CsA)特异性抑制CaN活性.应用Western印迹测细胞内CaN-α蛋白表达.采用组织化学法测CaN酶活性.用Fluo3-AM荧光标记法观察心肌细胞胞质及核内钙离子浓度变化.结果 加入100 nmol/L NPY刺激后,心肌细胞CaN酶活力较对照组明显增高(P＜0.05),10 nmol/L NPY组和CsA 组(100 nmol/L NPY + 5 μg/ml CsA) CaN酶活性与对照组相比,差异无统计学意义.100 nmol/L NPY组心肌细胞内CaN-α蛋白表达较对照组显著增高(P＜0.05). 加入100 nmol/L NPY在10 min内,心肌细胞胞浆及核内钙含量与对照组相比,差异无统计学意义.经100 nmol/L NPY刺激24 h后,心肌细胞胞浆及核内钙含量明显高于对照组(P均＜0.01).结论 NPY可活化心肌细胞内Ca2+及CaM-CaN途径.NPY刺激下产生的细胞内钙增加,可能是其活化CaN途径的始动环节.     

强磁重力环境对MG63成骨样细胞钙离子/钙调蛋白信号的影响

目的:研究强磁重力环境对MG63成骨样细胞钙离子浓度和钙离子下游信号分子表达的影响。方法:利用大梯度强磁场提供μg(12T),1g(16T)和2g(12T)三组不同强磁重力复合环境处理MG63成骨样细胞后,经Fluo-3/AM标记的细胞用激光共聚焦显微镜检测处理0.5 h对细胞胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响;用Western blot检测处理3 h对钙调蛋白(CaM)和肌球蛋白轻链激酶(MLCK)表达以及钙离子/钙调蛋白依赖蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)活性的变化。结果:钙离子浓度检测结果表明,与对照组细胞(1 g,地磁)相比,1 g(16 T)组细胞Fluo-3荧光强度增加,结果显示强磁场导致[Ca2+]i增加;与2 g(12 T)组相比,μg(12 T)组细胞Fluo-3荧光强度下降,结果显示模拟失重导致[Ca2+]i降低,抑制钙离子信号。蛋白质表达的检测结果表明,与对照组相比,1 g组细胞CaM和MLCK表达以及CaMKⅡ活性没有明显变化;与2 g(12 T)组相比,μg(12 T)组细胞CaM表达以及CaMK活性下降,结果显示模拟失重抑制CaM/CaMKⅡ信号。结论:强磁场导致MG63成骨样细胞胞内游离钙离子浓度增加,模拟失重抑制成骨样细胞钙离子/钙调蛋白信号。     

CaMKⅡ调控Na_V1.1与CaM的结合

目的探讨钙调蛋白激酶CaMKⅡ对电压门控性钠通道Na_V1.1结合钙调蛋白CaM的调节功能,分析CaMKⅡ在不同Ca~(2+)浓度下对二者结合的影响,进一步探讨CaMKⅡ、Ca~(2+)对CaM结合Na_V1.1的共同调节作用。方法应用pull-down技术检测不同Ca~(2+)浓度下经过CaMKⅡ磷酸化处理后Na_V1.1 IQ与CaM的结合情况。结果无钙条件下,CaMKⅡ不影响CaM与Na_V1.1 IQ的结合;有钙条件下,CaMKⅡ使CaM与Na_V1.1结合增加。结论钙离子存在时,CaMKⅡ磷酸化作用使Na_V1.1与CaM结合增加。     

无镁诱导培养大鼠海马神经元癫痫放电模型中电压门控性钙通道Ca_v1.2和钙调蛋白激酶Ⅱ的表达

目的利用无镁细胞外液诱导原代培养大鼠海马神经元癫痫放电模型来检测电压门控性钙通道Ca v1.2和钙调蛋白激酶Ⅱ的表达变化。方法采用新生24h内Wistar大鼠,取海马进行神经元原代培养。体外培养至12d,无镁细胞外液处理一部分神经元3h后,应用全细胞膜片钳技术记录神经元的放电情况以及免疫印迹法检测电压门控性钙通道Ca v 1.2和钙调蛋白激酶Ⅱ的蛋白表达。无镁细胞外液处理另一部分细胞12h后检测Ca v1.2和钙调蛋白激酶Ⅱ的蛋白表达。结果在无镁细胞外液处理3h后,神经元存在自发的"癫痫样"放电,而神经元Ca v1.2和磷酸化钙调蛋白激酶Ⅱ表达不变;无镁诱导12h后,神经元电压门控性钙通道Ca v1.2表达下调,而磷酸化钙调蛋白激酶Ⅱ表达上调。结论电压门控性钙通道Ca v1.2和钙调蛋白激酶Ⅱ的表达变化可能与无镁诱导体外培养大鼠海马神经元自发异常放电的基础病理机制相关。     

慢性心房颤动对人心房肌钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ表达的影响

目的：探讨慢性心房颤动(房颤)对人心房肌细胞内游离Ca2+浓度及心肌组织钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ (CaMKⅡ)表达的影响。 方法: 用激光共聚焦显微镜技术，对急性分离的慢性风湿性心脏病伴慢性房颤或窦性心律患者的心房肌细胞内游离Ca2+浓度进行测定，同时用Western blotting法检测心房肌组织CaMKⅡ表达的变化。 结果: 慢性风湿性心脏病伴慢性房颤患者心房肌细胞内游离Ca2+浓度显著高于窦性心律患者［(276.38±38.12）nmol/L vs （122.28±45.63)nmol/L, P<0.05］。慢性风湿性心脏病伴慢性房颤患者心房肌CaMKⅡ的表达明显强于窦性心律患者（10.14±0.31 vs 6.86±0.89， P<0.05）。 结论: 慢性房颤患者心房肌细胞内存在钙超载，Ca2+/CaMKⅡ信号转导途径可能是维持慢性房颤重要的病理生理基础之一。     

钙离子体外微渗透的时间延迟

目的检验微渗透（MD）系统回收时间（RT）延迟的存在性。方法建立一个用于钙离子（ca2＋）检测的特定MD体外系统。灌注液为生理盐水（NS）,灌注速度为2．0μl／min。析出液经过同步稀释,每10分钟采样1次至80min。样本中的Ca2＋用原子吸收光谱仪检测,计算MD系统的Ca2＋回收率。用Ns和Ca2＋标准液间的切换模拟待测液目标分子浓度变化,记录不同时间点的ca。’浓度和MD系统用于caz＋检测的RT。结果MD系统的ca。’回收率为16％,析出液钙离子浓度自10min[（57±17）μmol／L]开始上升,20min达到峰值,持续至50min[（159＋26）Ixmol／L]开始下降,稳态峰值浓度约200I~mol／L。基线值时间点组（0、60、70、80min）与峰值时间点组（20、30、40min）间Ca2’浓度差异有统计学意义[0min：（3＋4）μmol／L,60min：（7±8）μmo]／L,70min：（7＋7）μmol／L,80min：（5＋9）μmol／L比20min：（197±29）μmol／L,30min：（194＋21）μmol／L,40min：（192＋11）μmol／L,均P〈0．05]。析出液中ca2＋浓度上升和下降变化均较待测液显著延迟,对于该MD系统而言,用于caz＋检测的RT应为20min。结论在10min的采样间隔下,MD系统的caz＋检测RT延迟存在,并且不能事先准确预估。信号切换方法用于RT延迟的校正是可行的。     

人CaMKKβ蛋白的原核表达、纯化及活性测定

目的对原核体系表达的CaMKKβ蛋白体外活性进行探索,为针对CaMKKβ、AMPK药物研发提供科研基础。方法克隆人CaMKKβ基因,建立原核表达载体pET28a-CaMKKβ,将其转化入E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞内,在16℃、0.02 mmol/L IPTG条件下诱导重组表达CaMKKβ蛋白,Ni-NTA纯化6His-CaMKKβ蛋白,并利用Glo?Max Assay方法检测其活性。结果通过基因测序表明pET28a-CaMKKβ质粒构建成功;重组人CaMKKβ蛋白可溶性表达量较高,Ni-NTA纯化6His-CaMKKβ蛋白纯度可达80%以上,活性检测结果表明,大肠杆菌体系内表达的人CaMKKβ蛋白在CaM/Ca2+存在与否情况下,酶活基本一致。结论成功构建原核表达载体pET28a-CaMKKβ,实现重组人CaMKKβ在原核体系内可溶性表达,活性测定表明原核体系内表达的CaMKKβ自主酶活性较强,受CaM/Ca2+影响较小。     

神经肽Y对大鼠心肌细胞Ca2+-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的影响

目的 探讨神经肽Y对大鼠心肌细胞ca2+-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)的影响.方法 原代培养SD乳鼠心肌细胞,分为对照组(n=6)和神经肽Y组(n=6),神经肽Y组加入终浓度为100 nmol/L的神经肽Y,对照组不进行处理.处理15 min后采用同位素32P掺人法检测心肌细胞CaMK Ⅱ活性,免疫印迹法(Western blotting)检测磷酸化CaMK Ⅱ(p-CaMK Ⅱ)蛋白表达;处理24 h后激光共聚焦显微镜下记录心肌细胞静息状态下细胞核Ca2+-浓度,实时定量PCR检测心肌细胞β-肌球蛋白重链(β-MHC)、心钠素mRNA表达.结果 神经肽Y刺激心肌细胞15 min后,神经肽Y组CaMK Ⅱ活性较对照组明显升高(336 094.80±10 744.61比273 301.50±16 737.99,P＜0.05),P-CaMK Ⅱ蛋白表达明显增加.神经肽Y刺激心肌细胞24 h后,神经肽Y组心肌细胞胞核Ca2+-浓度较对照组明显增加(226.87±17.37比84.04±6.50,P＜0.01);实时定量PCR显示β-MHC、心钠素mRNA表达亦明显增加.结论 神经肽Y通过增加心肌细胞胞核Ca2+浓度活化CaMK Ⅱ.CaMK Ⅱ可能在神经肽Y诱导心肌细胞肥大效应中起着重要作用.     

尾加压素Ⅱ与妊娠期高血压疾病发病关系的研究

目的探讨尾加压素Ⅱ(UrotensinⅡ,UⅡ)在妊娠期高血压疾病(pregnancy-induced hyertension,PIH)发病中的作用。方法 (1)测定40例PIH患者和16例正常妊娠妇女血清中UⅡ及血钙水平,分析二者之间的相关性。(2)分别利用血清及10~(-7)mol/L的人重组UⅡ(rUⅡ)对离体培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作用,同时将硫氮唑酮加入10~(-7)mol/L rUⅡ对离体培养的HUVEC作用。(3)流式细胞仪分析PIH患者血清和rUⅡ在不同作用时间内皮细胞的凋亡率。结果 (1)PIH组孕妇血清UⅡ7.85±0.74pg/mL,血钙1.85±0.35 mmol/L,正常妊娠组血清UⅡ5.21±0.96 pg/mL,血钙2.26±0.18 mmol/L,两组差异均有显著意义(t=2.32,P0.05;t=2.84,P0.01),且PIH各组血清UⅡ及血钙水平均呈显著负相关关系(P均0.05)。(2)正常孕妇血清对培养的HUVEC细胞凋亡率低,PIH患者血清及rUⅡ对培养的HUVEC有同样的促细胞凋亡作用,表现为凋亡率明显升高,两者呈时间依赖性。(3)硫氮唑酮可抑制UⅡ诱导的细胞凋亡。结论 (1)UⅡ可诱导HUVEC的凋亡作用,且这种作用与细胞内Ca~(2+)升高有关。(2)UⅡ可能参与了PIH的发病过程。     

复合离子盐对高血压大鼠肾脏皮质AngⅡ、NO的产生及磷酸化ERK1／2表达的影响

目的观察复合离子盐对自发性高血压大鼠（SHR）。肾脏皮质AngⅡ、NO的产生，及对磷酸化ERK1／2（p-ERK1／2）表达的影响，探讨复合离子盐对SHR。肾脏保护作用的可能机制。方法42只8周龄雄性SHR随机分为4组：8％食盐摄入组（HS组）；1％复合离子盐摄入组（CIS组）；1％复合离子盐＋2．25％L-精氨酸摄入组（CIS＋L-Arg组）；1％食盐摄入组（NS组），持续干预12周。干预期间定期观察大鼠血压、尿蛋白的变化；干预结束后处死动物，放射免疫法检测肾皮质中AngⅡ、NO含量；并通过Western-blot法分析SHR肾脏皮质磷酸化ERK1／2蛋白表达的情况。结果12周干预结束后，CIS组与CIS＋L-Arg组血压升高趋势明显低于Ns组（P〈0．01）。CIS组与CIS＋L-Arg组尿蛋白排泄量与实验前相比无差异，但显著低于Ns组（P〈0．01）。与Ns组相比，CIS组与CIS＋L-Arg组可明显促进SHR肾脏组织NO的生成（P〈0．01），抑制组织AngⅡ的产生（P〈0．01），同时p-ERK1的表达在CIS组与CIS＋L—Arg组明显降低（P〈0．05）。结论复合离子盐与普通食盐比较，长期同等量摄入时可通过改变。肾皮质中AngⅡ、NO含量，改善其功能平衡，还可使ERK1／2信号传导通路发生改变，这可能改善盐诱导的靶器官损害作用。     

钙蛋白酶调节致心肌细胞肥大的信号转导

目的： 探讨钙敏感的calpain对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）介导的致心肌细胞肥大的钙调神经磷酸酶（CaN）信号通路的调节。方法: 原代培养的乳鼠心肌细胞为模型，AngⅡ刺激细胞Ca2+内流和（或）内贮细胞Ca2+释放， ［3H］-Leu掺入法反映心肌细胞蛋白合成速率，Fura-2/AM比率荧光成像分析细胞内钙信号变化，免疫印迹检测心肌细胞μ-calpain、m-calpain、CaN磷酸化及蛋白表达。结果: Ang Ⅱ呈浓度依赖性（10^-8-10^-5 mol·L^-1）促心肌细胞［Ca2+］i增加,各刺激组［Ca2+］i与对照组差异显著(P<0.01或P<0.05)。AngⅡ（10-7 mol·L^-1）剌激心肌细胞15 min后, μ-calpain的磷酸化明显增加，但其蛋白表达量无显著改变（P>0.05）, m-calpain蛋白表达及磷酸化量显著差异，CaN的蛋白表达量无显著改变，但其磷酸化增强, 环孢素A（CsA）抑制CaN的磷酸化。AngⅡ可使无血清培养新生大鼠心肌细胞［3H］-Leu掺入率随时间增加而增加，与对照组差异显著(P<0.01或P<0.05)，且在10^-8-10^-5 mol·L^-1范围内呈量效依赖关系。结论: AngⅡ剌激细胞外Ca2+跨膜内流和（或）内贮Ca2+的释放导致μ-calpain的激活，进一步激活钙敏感的CaN信号通路，在心肌肥厚的病理过程中起重要作用。     

DM2肾病患者血清leptin水平与红细胞ATP酶活性的关系

目的：探讨了2型糖尿病（DM2）肾病患者血清瘦素（leptin）水平与红细胞膜Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶活性改变参与DM2肾病发生的可能机制。方法：应用放射免疫分析和Reilni制膜法测定了40例DM2无肾病和32例DM2肾病患者血清leptin水平和红细胞膜Na＋K＋-ATP酶和Ca＋2Mg＋2-ATP酶含量,并与35名正常健康人作比较。结果：DM2无肾病组和肾病组血清leptin水平非常显著地高于正常人组（P〈0.01）和红细胞膜Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶水平显著地低于正常人组（P〈0.01）。DM2肾病组与无肾病组亦有显著性差异（P〈0.05）。结论：DM2的发生、发展与血清leptin水平和红细胞膜Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶的活性有密切的关系。