EST技术及其在基因全长cDAN克隆上的应用策略

随着人类基因组计划的顺利进行，EST技术被广泛应用基因识别、绘制基因表达图普、寻找新基因等研究领域。利用人类基因组研究不断产生的，从ESTs即cDNA的部分序列入手，通过同源筛选，获得基因部分乃至全长cDNA序列，避免或减轻了构建与筛选cDNA库等繁锁的实验室工作。本从原理、应用有其在科学研究上产生的影响等方面对EST技术进行了概述。     

抑制性消减杂交筛选不稳定性心绞痛相关基因

目的:筛选并鉴定不稳定性心绞痛淋巴细胞相关差异表达基因,探讨不稳定性心绞痛发病的分子机理。方法:应用抑制性消减杂交技术(SSH)和斑点杂交技术,筛选不稳定性心绞痛组和稳定性心绞痛组淋巴细胞差异表达基因,应用反向Northern杂交和RNA狭线杂交技术,鉴定并获得阳性序列表达标签(EST),将获得EST测序,并进行同源性比较。结果:在不稳定性心绞痛组获得3个阳性EST,在稳定性心绞痛组获得1个阳性EST,全部为已知基因的部分序列。结论:所筛选的EST与不稳定性心绞痛的患者动脉粥样硬化斑块不稳定有关。     

cDNA末端快速扩增技术新进展

全长 c DNA的获得是基因克隆的重要内容 ,也是目前人类基因组研究中的一个重要方面。 c DNA末端快速扩增 (RACE)技术是以 PCR为基础 ,从部分已知的 c DNA序列扩增出其他未知部分的 5′端和 3′端的 c DNA序列的一种方法。本文从 RACE技术的基本原理方法出发 ,详细阐述了其存在的缺陷 ,并对 RACE最新研究进展 ,如 Marathon- PCR、Smart- RACE以及“电子”c DNA克隆等作一综述     

小鼠遗传型多囊肾病1基因组片段的克隆

目的　克隆小鼠的遗传型多囊肾病1 基因(polycystic kidney disease 1,PKD1),为产生PKD1 基因缺陷小鼠品系准备条件。方法　以正常小鼠基因组DNA 为模板、扩增小鼠PKD1 基因部分序列为探针,应用噬斑原位杂交技术筛选129SvTer小鼠基因组DNA 文库,并用Southern 杂交、亚克隆及测序等方法鉴定所得克隆。结果　筛选得到1 个阳性克隆,并证实了所得序列与基因库收录的序列一致。结论　已克隆到含有PKD1 基因目的区域的基因组DNA 片段,其结构符合构建目标载体的要求,为建立小鼠PKD1 胚胎干细胞基因打靶动物模型奠定了基础     

中药“神经再生素”促神经生长过程中基因差异性表达的初步研究

为了探索中药“神经再生素”促神经生长过程中基因水平的变化。本实验采用 dd-PCR方法 ,从体外培养背根神经节细胞加药组和不加药组中获得两者的差异表达片段 ,并经反杂交筛选、克隆测序、DNA序列检索分析、Northern验证。结果表明 ,差异显示共获得 8个差异条带 ,一个为下调基因 ,其余为上调基因 ,其中 2个 c DNA序列与 RRAJ5 16 1基因 (增殖相关基因 )、AF196 3 15基因 (锌指样蛋白 DDP2 ) 10 0 %同源 ,2个 c DNA序列与 AK0 0 175 7基因、STA5 SRR基因 (t RNA合成酶 )部分同源。结论是中药“神经再生素”在促神经生长过程中 ,对神经元基因的选择性表达起着重要的调控作用。     

日本血吸虫（中国大陆株）表达基因的大规模随机测序体系的建立

目的：建立日本血吸虫(中国大陆株)表达基因的大规模随机测序体系。方法：应用EST方法,从Sj cDNA库中随机挑选出单个重组克隆进行PCR直接序列分析,通过互联网将获得的EST序列送入WHO血吸虫基因库进行同源性检索。筛选出血吸虫未知基因EST,并克隆其全长cDNA。结果：完成了140个Sj表达基因EST序列测定,获得了100个可用于分析的EST序列,并在Genbank登录。其中已知血吸虫编码基因或EST序列46个,未知基因54个。结论：成功地建立日本血吸虫(中国大陆抹)表达基因的大规模随机测序体系,为进一步开最日本血吸虫(中国大陆株)表达基因的研究奠定了基础。     

日本血吸虫卵壳蛋白基因的筛选及EST序列测定

目的 通过对日本血吸虫(Sj)成虫cDNA库的核酸杂交筛选，分离出Sj卵壳蛋白相关基因的cDNA克隆，并进一步探讨该基因的结构与功能关系。方法 用地高辛标记的特异性寡核苷酸探针对Sj成虫cDNA库进行膜原位杂交筛进，挑选出阳性克隆，用通用引物进行PCR扩增，获得cDNA插入片段，采用PCR直接序列测定法，对其部分序列进行测定，而后将EST序列输入GENEBANK进行同源性检索和分析。结果 本实验从Sj cDNA库筛选到9个不同的阳性克隆，用通用引物扩增出9十分子量大小不同的单一条带，其中两个为已知序列，其余7个为新的EST序列。结论 用寡核苷酸标记探针对Sj库中进行校酸杂交筛选是寻找特定目的基因的有效方法。     

日本血吸虫（中国大陆株）表达基因的EST序列测定及同源性分析

目的 运用表达序剜标签技术(EST方法),从Sj cDNA库中分离、鉴定和鉴定血吸虫表达基因序列。方法 应用EST方法,从Sj cDNA库中随机挑选出单个重组克隆进行PCR直接序列分析,通过互联网将获得的EST序列送入NCBl GenBank进行同源性检索,并对检索结果进行分析。结果 分离了46个Sj cDNA克隆,并对18个克隆cDNA插入片段的PCR进行直接序列分析,获得了16个EST序列。其中13个EST序列为GenBank中已知的血吸虫基因序列．3个未发现明显同源(score<200)基因序列。结论 采用EST-PCR直接序列分析方法可大量获得血吸虫表达基因EST序列,为进一步开展日本血吸虫（中国大陆株）表达基因的研究奠定了基础。     

RACE：一种研究新基因的有效方法

RACE（rapid amplificationofc DNA ends）技术是以PCR和RNA反转录为基础,通过部分已知基因序列（如EST）快速扩增cDNA的3′端或5′端未知序列区域,获得全长cDNA,研究新基因的一种有效方法。本文针对该项技术自身存在的优缺点,同时结合国内外的最新研究改进方案,对该技术作一概述。     

酶促放大基因组DNA中特定序列的直接克隆与序列分析

为了解遗传病或复杂的基因多态现象的分子基础,需要在个体水平详细分析某些位点DNA序列的变化。目前分析每一个等位基因突变个体要经过建立基因文库、筛选、绘制物理图谱、次级克隆,DNA序列等一系列繁杂的工作。本文作者应用体外聚合酶促DNA扩增技术,对基因组DNA中特定     

EST法筛选日本血吸虫表达基因序列的研究

本运用表达序列标签法(EST)筛选日本血吸虫(中国江西株)成虫cDNA库，将得到的EST序列送入GenBank和EBI进行同源性分析检索，获得30个日本血吸虫基因EST，今后寻找新的抗血吸虫疫苗侯选分子及研制新的化疗药物奠定一定的工作基础。     

利用抑制性减数杂交技术(SSH)研究IL-10抑制表达的新基因

目的　利用抑制性减数杂交 (SSH)技术筛选IL 10抑制表达的新基因。方法　以PHA刺激的U937细胞为tester,以PHA刺激同时IL 10抑制的U937细胞为driver,提取mRNA ,反转录构建cDNA文库 ,利用SSH技术筛选IL 10抑制表达的新基因。结果　通过SSH技术 ,发现了 15个可能的IL 10抑制表达的基因 ,其中 6个与GenBank中已公布的表达序列检签 (expressedsequencetag ,EST)片段没有明显同源性 ,为新基因 ,其中之一经EST拼接 ,得到全长cDNA ,为一种新的C C家族趋化因子 ,已被GenBank收录 ,收录号码为AF0 96 985。挑选 4个新基因进行Northernblot分析 ,发现IL 10可抑制其中 3个新基因表达。结论　SSH技术是一种高效的差异基因筛选方法 ,IL 10可抑制多种包括新细胞因子基因的表达     

免疫相关基因在同一膀胱癌亚克隆细胞株中的差异表达

目的:筛选和鉴定同一膀胱癌亚克隆细胞株中差异表达的与BCG免疫相关的基因。方法:以已建立的两株同一来源、不同生物学表型的膀胱移行细胞癌细胞系BLX和BLS211为材料,采用抑制性削减杂交技术(SSH)筛选差异表达的基因片段。结果:在BLX细胞中获得9个高表达的基因,在BLS211细胞中获得15个高表达的基因。BLX细胞中有3个基因,即与卡介苗(BCG)免疫治疗相关的基因BCG诱导的膜蛋白(BIGM103)基因、纤维连接蛋白(FN)基因和补体因子B(BF)基因;BLS211细胞中有8个基因均为新的表达序列标签(EST),已被GenBank登录(登录号为DY50570813,DY2304478)。结论:SSH技术筛选表明,BIGM103等免疫相关基因的不同,可能与不同膀胱癌细胞对BCG免疫治疗的差异性有关;新的EST的获得,为进一步克隆全长、研究基因的功能创造了条件。     

日本血吸虫新基因的发现及其功能的初步预测

本文运用表达序列标签（expressed sequence tags,EST)法筛选日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库,获得50个日本血吸虫EST片段,经过测序后将EST序列送入EMBL和NCBI,Genbank进行同源性分析并登录。为寻找新的抗血吸虫疫苗候选分子,化疗药物及具有我国自主知识产权的血吸虫功能基因奠定工作基础。     

原发性肉碱缺乏症一家系的SLC22A5基因突变检测与产前诊断

目的对原发性肉碱缺乏症(PCD)病患者及一家系进行致病基因SLC22A5突变鉴定,为家系提供遗传咨询和产前诊断,同时研究c.394-1 GT突变所导致的SLC22A5基因剪接形式的改变。方法收集患者及父母的外周血标本,提取基因组DNA,采用Sanger法对家系中各成员进行SLC22A5基因的所有外显子进行测序,同时对发现的突变在100名正常对照中进行测序,以排除多态性位点;使用QIAGEN血液RNA提取试剂盒抽提患儿总RNA,通过RT-PCR和测序技术分析c DNA序列特征。对先证者母亲的羊水标本进行产前诊断。结果 Sanger法DNA测序检测出该家系中先证者为SLC22A5基因的两个杂合突变:c.394-1 GT,c.760CT(p.R254X),在100名正常对照中均未发现这两个位点的突变。先证者父亲、母亲分别携带SLC22A5基因c.394-1 GT、c.760 CT(p.R254X)杂合突变。先证者母亲的羊水标本的基因型与先证者一样。先证者的特定片段RT-PCR产物电泳时较非携带者的正常人多出一条小的亮带,经测序确认是由c.394-1 GT突变导致SLC22A5基因c DNA外显子2完整序列的缺失。结论 c.394-1 GT突变位点在国内外仅一例报道,本研究证实该突变的存在,同时证明该突变导致SLC22A5基因c DNA外显子2完整序列的缺失。这一发现丰富了SLC22A5基因突变谱,为原发性肉碱缺乏症(PCD)病的防治提供新的参考,Sanger测序等技术可为原发性肉碱缺乏症家系提供遗传咨询和产前诊断服务。     

PCR技术在cDNA文库构建中的应用

c DNA文库在基因分离和克隆中具有重要作用。近年来 ,随着分子生物学技术的发展 ,c DNA文库的构建方法有了许多改进和提高。尤其是 PCR技术的发明和引进使从少量来源的组织和细胞中构建 c DNA文库成为可能。本文就 PCR技术在 c DNA文库构建中的应用方面的进展作一综述。     

肝癌组织差异表达基因cDNA序列的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定肝癌组织特异表达基因。方法：通过菌落原位杂交技术筛选用抑制消减杂交法构建肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库，用PCR方法进一步筛选出有插入片段的阳性克隆，将阳性克隆进行DNA测序和同源性比较分析，用Northern印迹方法对新的cDNA序列进行初步鉴定。结果：从消减文库中随机挑取的100个白色克隆中筛选出13个阳性克隆，DNA测序获得11个不同的cDNA序列；同源性比较分析表明，6个cDNA片段与在基因高度同源，5个cDNA片段为新的序列。其长度大于300bp的3个新序列，Norther印迹证实它都来源于肝癌组织。结论：用抑制消减杂交方法构建的肝癌差异表达基因消减cDNA文库富含肝癌特异表达基因，经验证的3个新的cDNA序列可能为肝癌特异的基因序列。     

DNA改组(DNA Shuffling)在生物药学中的应用

目的综述DNA改组技术的发展及其在生物药学领域的应用,为生物药学及其相关领域的研究和进一步应用提供参考。方法总结、分析近几年来相关方面的文献资料。结果及结论DNA改组是一种有效的在体外利用重组技术加速基因进化的定向分子进化过程,它可以使单一基因和多基因靶序列进行多次重组和筛选而使其快速进化。DNA改组技术发展迅速并广泛应用于酶的改良、药物蛋白优化、疫苗改进等领域,具有广阔应用发展前景。     

人PLAGL2基因表达载体质4粒的构建

目的克隆人PLAGL2基因片段并插入（TetO）7-CMV表达载体。方法采用PCR技术扩增出人PLAGL2基因的两个DNA片段，经酶连后获得约2kb的目的DNA片段并插入（TetO）7-CMV载体中，PCR筛选阳性转化株并分析重组质粒的DNA序列。结果DNA测序结果显示重组质粒（TetO）7-CMV-PLAGL2序列正确。结论扩增并连接了人PLAGL2基因的两个DNA片段，最终成功构建了人PLAGL2基因的表达载体质粒-（TetO）7-CMV-PLAGL2。     

基因免疫制备抗人BLyS单克隆抗体及单抗特性分析

目的:基因免疫制备抗人BLyS单克隆抗体并分析其免疫学特性。方法:将人BLyS 基因克隆到真核表达载体pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3/hBLyS,用其免疫BALB/c鼠,取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,用ELISA法筛选阳性克隆,用免疫印迹和流式细胞技术进一步鉴定抗体的特异性,用双向免疫扩散鉴定单克隆抗体的类别。结果:重组质粒双酶切结果和DNA序列测定结果表明,pcDNA3/hBLyS 重组质粒含有目的基因;ELISA、免疫印迹、流式细胞仪和双向免疫扩散等实验结果表明,9c10杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体可以特异性结合IFN-γ激活的人T淋巴细胞膜表面BLyS蛋白的膜外区,属于IgG1亚类。结论:获得了能够特异性结合人T淋巴细胞上BLyS蛋白膜外区的单克隆抗体,为进一步研究人BLyS与自身免疫性疾病的关系提供了条件。