GEO-基因表达综合数据库的应用与数据挖掘

高通量微阵列杂交技术和测序技术的快速发展,产生了大量的基因数据,生物信息迅速膨胀成为数据的海洋.为适应这种高通量基因表达数据的不断增长和人们共享数据的需要,各种数据库应用而生,其中,NCBI (national center for biotechnology information)的基因表达综合数据库(gene expression omnibus,GEO)是世界上最大的储存高通量分子丰度数据的公共数据库,用户可以提交、储存和检索多种形式的数据并免费使用.迄今为止,GEO已收录了300000个样本的数据,涉及16亿个基因表达丰度数据,涵盖500多种生物体,广泛覆盖各种生物学内容.GEO数据库操作简单,数据全面,免费共享的优势为后期数据挖掘和信息推广提供了良好的平台.文章概述了GEO数据库的结构、数据的提交、检索和其在分子生物学领域中的应用前景.登陆GEO数据库的网址为:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo.     

利用不同方法检测RNAi抑制人pescadillo基因的表达

目的:构建人pescadillo(PES1)基因siRNA的真核表达载体,观察其对PES1表达的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成了2条针对PES1基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上。分别用以下3种方法检测RNAi的抑制效果:(1)将RNAi重组质粒和带FLAG标签的PES1共转染293T人胚肾细胞,用FLAG抗体进行Western blot;(2)将RNAi重组质粒和带GFP标签的PES1共转染293T细胞,用荧光显微镜观察GFP的亮度;(3)在293T细胞中仅转染小干扰RNA(siRNA)重组质粒,用PES1抗体进行Western blot分析。结果:测序证明,成功构建了PES1siRNA真核表达载体。通过Western blot实验证明,构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性PES1基因表达;荧光显微镜检查发现siRNA能明显减弱细胞中荧光强度,抑制PES1的表达。结论:成功地构建了PES1siRNA的真核表达载体,利用3种不同方法均证明该siRNA能有效地抑制PES1基因的表达。     

利用RNAi抑制FHL2基因的表达

目的:构建FHL2基因的siRNA真核表达载体,观察其对FHL2蛋白表达的影响.方法:利用RNAi干扰技术,设计并合成了两条针对FHL2基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer 2.1-U6 neo上.将重组质粒和带FLAG标签的FHL2共转染293T人胚肾细胞,通过Western blot实验检验RNAi干扰效应.结果:经过酶切和测序证明,成功构建了FHL2 siRNA真核表达载体.通过Western blot证明,构建的siRNA能有效抑制FHL2基因的表达.结论:成功地构建了FHL2基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效地抑制FHL2基因的表达.     

基因表达系列分析及其应用

基因表达系列分析 (serial analysis of gene expression,SAGE)是一种快速分析基因表达信息的技术 ,它能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息 ,因此是研究基因表达定性和定量的一种有效工具。近年来人们利用此技术对动植物及人类的基因表达信息进行了广泛的研究 ,本文就 SAGE特点、方法及其应用作一简要介绍。     

基因表达的系统分析在基因组转录谱研究中的应用

基因表达的系统分析技术 (SAGE)是一种全面分析基因表达模式的实验方法。该方法的原理是基于分离出每一m RNA所特有的长 9bp～ 14 bp的标签并将其串联起来进行克隆和测序。该方法不仅可以给出我们一个全面的特定细胞或组织的基因表达谱 ,而且还可以通过对两组处于不同环境中的同一类型细胞的基因表达谱进行比较 ,帮助我们发现那些由于环境的变化而表达发生改变的基因。本文拟就这一高通量方法的原理、应用、不足及其改进等方面的研究情况作以综述     

珠蛋白基因特异性表达的调控

一、珠蛋白基因结构与特异性表达 人类珠蛋白基因包括已确定的八个珠蛋白功能基因和三个珠蛋白假基因,还有一个近年发现的基因,它们在两条染色体上排列成簇。α-珠蛋白基因簇位于16号染色体短臂上,以5′ζ_2-ψζ_1-ψα_2-ψα_1-α_2-α_1-θ_1-3′的顺序排列,约占30kb。其中ζ为胚胎型功能基因、ψζ与ψα为假基因,θ基因的功能有待研究,另外在22号染色体上还有一个ψθ_2假基因。β     

EXPRESSION OF HUMAN CD59 ANTIGEN ON MOUSE NIH3T3 AND EL-4 CELLS CONFERS PROTECTION AGAINST HUMAN COMPLEMENT ATTACK

CD59分子是广泛分布于各组织细胞表面的18kDa糖蛋白,通过肌醇磷脂酰聚糖(GPI)锚固于细胞膜,具有抑制同源补体攻膜复合物(MAC)形成和参与介导T细胞活化等多种功能.本文应用RT-PCR方法,从Jurkat细胞的总RNA中扩增得到396bp的cDNA片段,经测序证实该片段包括25aa信号肽在内的全部的CD59编码序列.进一步将此CD59的cDNA重组于逆转录病毒载体pLXSN,电穿孔转染PA317细胞,并用病毒上清感染小鼠成纤维母细胞NIH3T3及小鼠胸腺瘤细胞EL-4.经G418加压筛选,FACS检测获得表达CD59的阳性细胞克隆.补体杀伤实验结果表明:表达GPI-型CD59分子的NIH3T3和EL-4细胞对人血清补体溶破的抵抗作用较空载体转染的非表达细胞明显增强.证实了用逆转录病毒载体可成功地将人CD59基因导入异源细胞,使表达CD59的异源细胞获得抑制人补体溶破的功能.本研究为探讨CD59分子与细胞活化的关系及其信号转导机制建立了良好的细胞模型,并为进一步应用于异种器官移植,或对由于CD59遗传缺损所致PNH进行基因治疗奠定了基础.     

WIF-1在鼻咽未分化癌中表达的研究

目的 分析WIF-1在鼻咽慢性炎性组织、鼻咽癌中表达的特点,探寻其在鼻咽未分化癌中表达与相关临床资料的关系,以及在鼻咽癌发病机制中的作用.方法 应用免疫组化技术SP法检测65例鼻咽未分化癌鼻咽癌标本、20例鼻咽部慢性炎症中WIF-1的蛋白水平.结果 ① WIF-1在正常鼻咽上皮细胞中存在表达,在鼻咽假复层纤毛柱状上皮的纤毛柱状上皮细胞中呈强阳性表达.其表达呈周期性.② 鼻咽癌标本表达的平均百分数为(31.0±8.0)%,与非癌上皮组织中WIF-1在柱状细胞中全部呈强阳性相比,有显著差异.WIF-1在部分淋巴细胞中表达阳性.在鼻咽癌和淋巴细胞中表达两者无相关性.③ WIF-1在鼻咽未分化癌细胞中的表达与患者的年龄、性别、原发灶大小(T分期)、淋巴转移、远处转移均无关系.结论 WIF-1在正常鼻咽上皮细胞中呈阳性表达;WIF-1在鼻咽未分化癌细胞中出现表达缺少和(或)下调;WIF-1表达缺少和(或)下调的出现可能是鼻咽未分化癌发生的早期事件,WIF-1表达异常可能在鼻咽未分化癌的发病机制中发挥一定作用.     

Bcl-2和nm23的表达与乳腺癌生物学行为的关系

目的研究乳腺癌中bcl-2与nm23基因表达的生物学意义及它们之间的相互关系对乳腺癌生物学行为的影响.方法应用免疫组织化学S-P方法对65例乳腺癌石蜡包埋组织进行检测,分析bcl-2与nm23基因表达与乳腺癌病理参数的关系.结果 bcl-2和nm23阳性表达率分别为57.4%、63.1%.bcl-2基因阳性表达与组织学类型、患者年龄、有无淋巴结转移以及肿瘤大小无关(P>0.05);与乳腺癌组织学分级呈正相关(P<0.05),nm23阳性表达与肿瘤大小、组织学类型和患者年龄无关(P>0.05);与乳腺肿瘤的组织学分级和淋巴结转移呈负相关(P<0.05);bcl-2与nm23的表达有相关性(P<0.05).结论 bcl-2阳性表达和nm23阴性的乳腺癌患者细胞恶性程度高,bcl-2与nm23基因共同参与了乳腺癌的发生和发展.     

用主成分分析探索基因表达模式

以时间点(阵列)为变量,对酵母时间表达序列进行主成分分析,提取出三个主成分:第一主成分代表整个酵母细胞周期中平稳的基因表达状态,第二主成分代表酵母细胞周期中lateG1期和M期差异的基因表达状态,第三主成分表示的是earlyG1期和S/G2期差异的基因表达状态。由第二、和第三主成分揭示出基因表达谱中四个周期性基因表达模式:分别对应lateG1期、M期、earlyG1期和S/G2期,而且发现了一批表达水平呈周期性变化的基因,为进一步研究基因周期性表达和基因调控网络提供有价值的指导。     

VEGF基因表达调控机制的研究进展

VEGF基因的表达受多种细胞因子、瘤基因、抑瘤基因产物及缺氧等因素的调控。不同细胞因子诱导VEGF表达的信号通路与特定的转录因子有关 ,这些转录因子的结合位点位于VEGF启动子附近的区域 ;瘤基因和抑瘤基因产物对VEGF基因的表达调控作用是通过直接或间接作用于VEGF基因启动子来实现的 ,前者可激活VEGF启动子诱导VEGF基因表达 ,后者通过抑制VEGF启动子的活性使VEGF的表达水平下降 ;缺氧上调VEGF基因表达的作用与一种缺氧诱导的特异性的DNA结合蛋白—缺氧诱导因子 1(HIF 1 )有关。     

miRNA,siRNA,saRNA与基因表达调控

近年来的研究发现,生物体内存在着大量的非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNA),它们在染色质修饰、基因转录、RNA剪接和mRNA翻译等多种水平上参与了基因表达的调控.ncRNA中的小分子RNA如miRNA能够识别特定的目标mRNA,通过与mRNAs 3'非翻译区结合,影响mRNA转录及蛋白质翻译;siRNA是RNA干扰的引发物,能够导致与dsRNA同源的mRNA降解,进而抑制相应基因表达;saRNA是目前最新发现的一种靶向目的 基因启动子区的在转录水平激活目的基因表达的dsRNA.miRNA、siRNA和saRNA在生成机制、作用途径等方面关系密切,既区别又相互联系,小分子RNA的研究将是今后分子生物学的研究热点之一.     

一种基因表达的系统分析的方法

随着人类基因组全部核苷酸测序计划的即将完成,研究的焦点逐渐由结构基因组学转向功能基因组学,而全基因组表达分析也成为功能基因组研究的重要组成部分［１］。以往表达序列标签（ＥＳＴ）测序、ｍＲＮＡ差异显示、消减杂交及差异杂交等在克隆差异表达基因方面做出了巨大贡献,但由于它们的随机性均无法描绘出基因表达模式的全貌,所获得的多限于高丰度或表达差异大的基因［２－５］,且无法得知丰度的信息以及与其他差异表达基因相比的相对重要性。而目前用于定量表达分析的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交、逆转录ＰＣＲ、竞争ＰＣＲ（ｃｏｍｐｅ…     

基因表达系列分析技术的原理及应用进展

生物体的特性由内在基因表达决定。个体发育和疾病发生与基因选择性表达密切相关,因此,要了解生命活动和疾病发生、发展的分子机制,就必须深入了解基因表达的时空性和差异性。基因表达系列分析技术(SAGE)是新近建立的能够定性和定量研究基因表达的有效工具,不仅可提供基因组表达丰度较完整的数量信息,而且还可帮助寻找和发现新基因。     

带绿色荧光蛋白标签的人era真核表达载体的构建及人Era对细胞形态和细胞周期的影响

目的:构建人era真核表达载体并初步研究这一人类新基因对体外培养细胞形态和细胞周期的作用。方法:构建带绿色荧光蛋白(EGFP)标签的人era真核表达载体,转染体外培养细胞NIH3T3,用荧光显微镜观测和流式细胞仪进行分析。结果:无论EGFP融合于人Era的C端或N端,融合蛋白均表达于细胞浆接近核膜处,细胞形态无明显变化,细胞周期检测S期细胞所占百分数降低。结论:人era可能参与细胞周期调控,为阐明人era的功能提供了资料。     

诱骗受体DcR3的基因构建、表达及特异性鉴定

目的:构建适于原核表达的人诱骗受体DcR3基因,并进行重组蛋白的表达纯化及特异性鉴定。方法:查得人DcR3cDNA全序列,将其分段设计引物,通过重叠PCR获得DcR3基因。构建pET-22b( )/DcR3表达载体,转化大肠杆菌Rosseta-gami,IPTG诱导表达,Ni柱纯化。采用ELISA进行特异性鉴定。结果:通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因。目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,蛋白纯度达95%以上。ELISA结果表明所纯化的蛋白可与抗DcR3抗体发生特异结合。结论:诱骗受体DcR3基因的成功构建、表达及纯化,为进一步的功能研究奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA-Stx2B融合蛋白的克隆、表达及生物学活性研究

目的 重组表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的EspA与Stx2B融合蛋白,并对其生物学活性进行初步研究.方法 采用PCR技术从EHEC O157:H7基因组中扩增espA基因及stx2B基因,两基因通过连接子(linker)相连,T/A法克隆,克隆至pET-28a(+)表达载体上,转化宿主细胞E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测其表达量及表达形式,免疫印迹分析免疫反应性.用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,检测其免疫原性,然后对免疫小鼠进行O157活菌攻毒试验和O157超声上清致死保护试验.结果 构建的espA-stx2B融合基因片段的测序结果 与理论预测值完全一致.融合蛋白在工程菌中以包涵体的形式表达,表达量约40%.免疫印迹显示融合蛋白能分别与EspA和Stx2B抗体发生抗原抗体反应.免疫小鼠其特异性抗体阳转率达100%,EspA和Stx2B抗体的几何平均滴度(GMT)分别增长了124.30倍和58.49倍.免疫小鼠O157活菌攻毒保护试验免疫后排菌时间和排菌量与对照组相比并没有明显改变,O157菌超声上清致死保护试验免疫组存活率为10/15,对照组全部死亡.结论 在E. coli中高效表达了EspA-Stx2B融合蛋白,此融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,融合蛋白免疫小鼠并不能降低细菌在小鼠胃肠道的黏附与定植,但却起到明显的免疫保护作用,保护率为66.7%(10/15).     

核酶研究的新进展

核酶是有很大发展潜力的遗传操作工具 ,人们不但希望利用它的核苷酸序列特异的酶切活性研究特定基因的功能 ,寻找疾病治疗的新靶标 ,也希望能够开发出具治疗作用的核酶剂。随着人类基因组计划草图的完成 ,核酶潜在的应用前景显得更加诱人。问题是如何提高核酶在体内的活性 ,这成了近年来的一个研究热点。本文从核酶的设计、转移、表达等方面介绍了近年来的研究进展。     

白血病抑制因子反义寡核苷酸对髓母细胞体外生长的抑制作用

为进一步认识白血病抑制因子（LIF）对人髓母细胞瘤生长的生物学作用，我们使用LIF反义寡核苷酸，在髓母细胞内特异性阻断LIF基因表达并观察它对靶细胞的生物学效应。结果发现，被处理细胞的LIF表达降低至RT／PCR检出的阈值之下，抗LIF的免疫组织化学染色亦呈阴性，同时，这些细胞的生长速度明显减缓。相反，用与反义寡核苷酸互补的正义序列处理的细胞无论在基因表达／产生，还是在生长速度方面，均和正常培养细胞的细胞相似，本研究从而提示了一条以LIF为对象的髓母细胞瘤以及其它LIF生长依赖性肿瘤的基因和免疫治疗途径。