应用痘苗病毒体表达猴轮状病毒VP4抗原基因

把编码猴轮状病毒Ｖｐ４抗原的第４基因片段插入到痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的Ｐ７．５启动子下游，构建成在痘苗病毒Ｐ７．５启动子调控下表达猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因的重组质粒ｐＪＳＡ１１７５－Ｖｐ４。应用磷酸钙沉淀技术将ｐＪＳＡ１１７５－Ｖｐ４ＤＮＡ转入ＴＫ－１４３细胞，在ＢＵＤＲ和Ｘ－ｇａｌ 存在下筛选蓝色蚀斑。     

乙肝病毒X基因真核表达载体的构建及其表达

目的　为探讨 Ｈ Ｂ Ｖ Ｘ 基因在肝细胞癌（ Ｈ Ｃ Ｃ） 中的致瘤机理提供实验模型。方法　用限制性内切酶从ｐ Ｅｃｏｂ６ 上切下 Ｘ 基因读码框,克隆到ｐ Ｂ Ｋ Ｓ＋ 上,再将 Ｘ 片段插入ｐ Ｃ Ｅ Ｐ４ 的 Ｈｉｎｄ Ⅲ和 ＮｏｔⅠ位点间。将重组载体（ｐ Ｃ Ｅ Ｐ４ Ｘ） 和空载体（ｐ Ｃ Ｅ Ｐ４） 导入肝癌细胞株 Ｈｅｐ Ｇ２ 中,潮霉素选择培养, Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 鉴定其稳定表达。结果　构建的ｐ Ｃ Ｅ Ｐ４ Ｘ 质粒在 Ｈｅｐ Ｇ２ 细胞中有稳定表达。结论　本实验为进一步探讨 Ｈ Ｂ Ｖ Ｘ 基因在 Ｈ Ｃ Ｃ 中的致瘤机理提供了理想的实验细胞株。     

携带人多药抗性基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

从ｐＨａｍｄｒｌ／Ａ质粒用ＸｈｏⅠ和ＳａｃⅡ将ｍｄｒｌ基因切下后克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ质粒的相应酶切位点获得测序质粒ｐＢＳｍｄｒｌ，测定了ｍｄｒｌ基因的两端序列。用ＥｃｏⅠＣＲＩ和ＸｈｏⅠ从ｐＢ－Ｓｍｄｒｌ切下ｍｄｒｌ基因，定向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ和ｐＭＳＣＶ２．１，得到携带ｍｄｒｌ基因的逆转录病毒载体ｐＬｍｄｒｌＳＮ和ｐＭＳＣＶｍｄｒｌ。用ＰＡ３１７病毒包装细胞包装后三种携带ｍｄｒｌ基因的病毒具有相似的滴度。用此三种病毒分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞后，以ｐＨａｍｄｒｌ／Ａ载体ｍｄｒｌ基因产物表达量最高。提示Ｈａｒｖｅｙ肉瘤病毒的启动子可能具有较高的强度。     

应用S基因转染的Sp2/0细胞作为靶细胞研究HBV基因疫苗的细胞免疫应答

构建编码ＨＢｓＡｇ 蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ３－１Ｓ作为ＨＢＶ 基因疫苗, 免疫接种Ｂａ１ｂ／ｃ 小鼠。以重组质粒ｐＣＲ３－１Ｓ转染的Ｓｐ２／０ 细胞作为靶细胞, 采用５１Ｃｒ ４ｈ 释放法, 体外检测免疫小鼠的淋巴细胞杀伤功能。结果显示, 与空载体对照组相比较, ＨＢＶ基因疫苗可诱导Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠产生ＨＢＶ 特异性细胞毒性Ｔ 细胞应答（ Ｐ＞ ０－０５） , 提示以Ｓｐ２／０ 基因转染的细胞作为靶细胞, 检测免疫Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠淋巴细胞的杀伤功能是可靠的。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核 …

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶ Ｃ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表达的核心抗原     

应用S基因转染的Sp2／0细胞作为靶细胞研究HBV基因疫？…

构建编码ＨＢｓＡｇ蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗,免疫接种Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,以重组质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ转染的Ｓｐ２／０细胞作为靶细胞,采用＾５１Ｃｒ ４ｈ释放法,体外检测免疫小鼠的淋巴细胞杀伤功能。结果显示,与空载体对照组相比较,ＨＢＶ基因疫苗可诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠产生ＨＢＶ特生细胞毒性Ｔ细胞应答,提示以Ｓｐ２／０基因转染的细胞作为靶细胞,检测免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠淋巴细胞     

应用痘苗病毒载体表达猴轮状病毒VP4抗原基因

把编码猴轮状病毒（Ｒｈｅｓｕｓｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＲＲＶ）Ｖｐ４抗原的第４基因片段插入到痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的Ｐ７．５启动子下游，构建成在痘苗病毒Ｐ７．５启动子调控下表达猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因的重组质粒ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４。应用磷酸钙沉淀技术将ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４ＤＮＡ转入ＴＫ－１４３细胞，在ＢＵＤＲ和Ｘ－ｇａｌ存在下筛选蓝色蚀斑。经３代以上纯化和病毒增殖，获重组病毒Ｒ－ＶＪＳＡ１１７５－Ｖｐ４。蚀斑滴定其满度达到１５×１０１１ＰＦＵ／Ｌ。经核酸杂交试验证明所获得的重组痘苗病毒带有猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因。用重组病毒感染ＴＫ－１４３细胞（或Ｖｅｒｏ细胞），在感染后４８ｈ，用酶免疫法（ＥＩＡ）检测受染细胞上清液和细胞裂解液中表达的猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因均呈阳性反应。本试验为本研究室轮状病毒基因工程疫苗的一部分，为深入了解轮状病毒基因结构及其功能在方法学上奠定了必要的基础。     

复制缺陷型鼠IL-3重组腺病毒的构建和鉴定

构建以ＣＭＶ启动子控制鼠ＩＬ－３基因表达的复制缺陷型腺病毒（ＡｄＣＭＶＩＬ－３）。将含全部编码序列的鼠ＩＬ－３ｃＤＮＡ克隆于腺病毒穿梭质粒ｐＭＨ４的ＣＭＶ启动子下游,再与含腺病毒基因组的质粒ｐＢＨＧ１０共转染２９３细胞,经细胞内同源重组后产生７个病毒空斑,取其中４个空斑扩增后经双引物ＰＣＲ检测,结果均含有ＩＬ－３及腺病毒特有片段,表明成功地构建了携带鼠ＩＬ－３基因的复制缺陷型重组腺病毒。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶＣ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的核心抗原。结果：用限制性内切酶酶切后，片段大小与计算值相符。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实，表达抗原的Ｍｒ约为２２０００。结论：ＨＣＶＣ基因能够插入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，并使其在真核细胞中表达，为进一步ＨＣＶ基因疫苗的研制和探讨抗ＨＣＶ感染打下了基础。     

逆转录病毒载体介导乙型肝炎病毒反义基因的转录表达

为了探索在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）反义核酸的方法，用基因重组技术将ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因（ＰｒｅＣ／Ｃ）和前Ｓ／Ｓ基因（ＰｒｅＳ／Ｓ）片段反向插入逆转录病毒载体质粒，再将重组体分别转染ＰＡ３１７包装细胞，进而获得能够介导ＨＢＶ反义基因向小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞转移表达的重组逆转录病毒。经分子杂交试验表明，含有ＨＢＶ反义基因的重组逆转录病毒序列已经整合到转染的ＰＡ３１７细胞染色体上；转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。结论：逆转录病毒载体包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞中转录表达，因而有可能利用反义技术和基因转移方法进行抗－ＨＢＶ基因治疗     

C基因截短的HBV复制与包装

目的 探讨C基因截短型HBV变异体的复制与包装。方法 采用分子克隆、人工定点突变等技术构建C基因截短型HBV变异体质粒，用脂质体法转染HepG2细胞，提取细胞内及培养上清液中DNA分别进行Southem杂交，PCR及实时定量荧光PCR分析。结果 经DNA测序及酶切鉴定证实C基因截短型HBV质粒载体构建成功；C基因截短型HBV为复制缺损型，与辅助质粒共转染HepG2细胞，可在细胞内及培养上清液中检测到HBV各种DNA构型；DNA定量分析提示C基因截短型HBV的包装效率较野生型HBV提高3～40倍。结论 C基因截短型HBV变异体为复制缺损型，单独转染后不能在肝细胞内包装与复制，但在缺失包装信号ε的相应辅助病毒辅助下可有效复制并包装成子代病毒颗粒分泌到胞外，且包装效率大大提高。     

Establishment of cell lines using a doxycycline-inducible gene expression system to regulate expression of hepatitis B virus X protein

The hepatitis B virus (HBV) X gene plays an important role in HBV-associated pathogenesis, especially hepatocarcinogenesis. Establishment of a stable and regulable HBx expression system will allow study of the function of this gene. Here, we describe the development of a doxycycline-inducible recombinant plasmid (pBPSTR3-FlagX) with the full-length HBV X gene and all components of the tetracycline-on (“Tet-on”) gene expression system. This vector exhibited dose-dependent doxycycline-dependent induction of the Flag-HBx protein in HepG2 and Hep3B cells. We also observed dose-dependent doxycycline transactivation of HBx in HepG2 cells. After transfecting HepG2 cells with the pBPSTR3-FlagX plasmid, we isolated five puromycin-resistant cell clones with stable HBx expression, two of which exhibited stable and tight control of HBx expression by doxycycline. This new system has great potential for functional studies of the HBV X gene.     

联合免疫失败过程中乙型肝炎病毒S基因突变的母婴配对研究

 目的：探讨在当前联合免疫方案下,发生乙肝母婴传播免疫预防失败过程中乙型肝炎病毒（HBV）S 基因的突变特征。方法：选择15例分娩免疫失败婴儿的孕妇及其联合免疫前的新生儿和免疫后的7月龄婴儿,将母亲、新生儿和婴儿分别配对,对其外周血中HBV的S基因（包括前 S和S）分2个片段进行PCR扩增测序,对比母亲、新生儿及婴儿3组间HBV 基因型、前 S和S基因突变率及突变位点的不同。结果：(1) 新生儿和婴儿体内HBV的基因型与母亲完全相同。(2) 3组2个片段的突变率差异均无统计学意义（P＞0.05）;同源树簇集分析中,母亲与所分娩的新生儿和婴儿体内 HBV 均形成各自独立的簇集。(3)突变位点：母亲-新生儿（13对）: 7例新生儿与母亲体内的HBV存在不同的突变位点（共15个位点）;新生儿-婴儿（13对）：3例婴儿与新生儿体内的HBV存在不同的突变位点,即nt273A→A/G、nt512C→C/T和nt1139C→A（共3个位点）,前2个位于S区的“a”决定簇之外,后1个则在与X编码框重叠的区域;婴儿-母亲（15对）：有9例婴儿与母亲体内的HBV存在不同的突变位点（共25个位点）,但仅1例是母亲、新生儿和免疫后婴儿均存在不同的突变位点。结论：（1）新生儿及免疫后婴儿体内的HBV均源自于母亲;（2）HBV的 S基因在联合免疫前和免疫后均可发生突变,主要发生在联合免疫前,是否与免疫失败有关尚需进一步研究。     

乙型肝炎病毒X基因重组腺病毒的构建及在HepG2细胞中的表达

从携带有双拷贝乙肝病毒adw亚型全基因组的质粒pecob6获得X基因片段,将其亚克隆到AdEasy腺病毒系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,和骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-X,PacI酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增,获得重组腺病毒Ad-X,Ad-X可感染HepG2细胞,Western-blot法检测到X蛋白的表达,重组腺病毒Ad-X构建成功,为进一步研究X蛋白的生物学功能奠定了基础。     

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对病毒自身调控序列的影响

目的 研究双剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体特异性蛋白TPds对病毒自身调控序列的影响.方法 PCR扩增6种HBV启动子/增强子序列,以Kpn Ⅰ及Xho Ⅰ位点克隆于pGL3-basic,分别构建萤火虫荧光素酶重组报告载体pGL3-BCP(含HBV基本核心启动子)、pGL3-CP1601(含增强子Ⅱ的核心启动子)、pGL3-XP(X基因最小启动子)、pGL3-XP1071(含增强子Ⅰ的X基因启动子)、pGL3-SP1(表面抗原大蛋白基因启动子)、pGL3-SP2(表面抗原中蛋白基因启动子).以FuGENE6将TPds表达载体pcDNA3.1/HisC-TPds或空白载体pcDNA3.1/HisC分别与6种HBV启动子/增强子报告载体共转染Huh7细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性,实验重复5次,数据以SPSS11.5软件分析.结果 在一定的质量比值范围内,与pcDNA3.1/HisC空白载体对照相比,pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-CP1601、pGL3-XP1071、pGL3-SP1、pGL3-SP2共转染后,Huh7细胞内萤火虫荧光素酶活性增高,而pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-BCP或pGL3-XP共转染后,胞内荧光素酶活性无变化.结论 TPds蛋白可反式激活HBV启动子SP1、SP2和增强子Ⅰ、Ⅱ,对基本核心启动子和X基因最小启动子无影响.     

Expression of the X gene of hepatitis B virus

The hepatitis B virus (HBV) genome carries an open reading frame of 462 bases, the X region, but the corresponding protein has yet to be identified as a natural product. In rodent cells cotransformed with the thymidine kinase gene of herpes simplex virus and HBV DNA, however, Gough [1983] identified a mRNA that hybridises uniquely with the X region of the HBV genome. A large fragment of the X region was inserted into plasmid pCL19 delta Y-T in order to produce, in Escherichia coli, the X gene product, HBxAg, as a polypeptide fused to the N-terminal part of the phage lambda cro gene product. Antisera raised against this fused polypeptide gave positive immunofluorescence reactions with the transformed rodent cells. This provides direct evidence for the expression of the HBxAg gene in eukaryotic cells transformed with HBV DNA. The approach used here should be generally applicable.     

免疫毒素基因DT390真核表达载体的构建及功能研究

目的：构建一种新型免疫毒素DT390-mIP10（白喉杆菌毒素390-小鼠γ干扰素诱导性蛋白10）基因的真核表达质粒,并对其功能进行初步研究.方法：通过RT-PCR扩增mIP10基因,并插入到含有DT390基因片段的真核质粒SRα中,构建重组质粒.以PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,用免疫荧光检测重组质粒的表达;用MTT比色法测定重组免疫毒素质粒的生物学活性.结果：构建了DT390-mIP10的真核表达载体SRα-DT390-mIP10,并在NIH3T3细胞中获得表达.表达的DT390-mIP10在体外能有效地杀伤活化的T细胞.结论：免疫毒素基因重组真核表达载体DT390-mIP10的构建成功并在真核细胞中表达,为其在肿瘤及自身免疫性疾病治疗方面的进一步应用研究奠定了基础.     

Molecular characterization of hepatitis B virus X gene in HIV-positive South Africans

Hepatitis B virus (HBV) infection is a major public health problem worldwide and the major cause of hepatocellular carcinoma (HCC) in South Africa. The role of HBV in HCC is not well understood, although the HBV X gene has been implicated as a critical factor. Data on the HBV X gene in HIV-positive South Africans are limited; thus, we investigated X gene variability in 24 HIV-infected treatment-naïve patients at Dr George Mukhari Academic Hospital. Quantitative and qualitative HBV DNA tests were conducted using real-time and in-house polymerase chain reaction (PCR) assays, respectively, targeting the complete HBV X gene. In-house PCR-positive samples were cloned using the P-Gem T-easy vector System II and sequenced. By phylogenetic analysis, X gene sequences were classified as subgenotype A1 (n = 15), A2 (n = 4), and D1 (n = 4), and one dual infection with subgenotypes as A1 and C. The basal core promoter mutations T1753C, A1762T, and G1764A were identified in the majority of sequences. Genotype D sequences had a 6-nucleotide insertion. In conclusion, subgenotype A1 was predominant, and a rare dual infection of HBV genotype A and C was detected. The 6-nucleotide insertion could represent a unique variant in the region and highlights the need for functional studies of HBV X gene variants, particularly from resource-limited settings.     

Effects of mutations in the X gene of hepatitis B virus on the virus replication

Previously, we have found a?new mutation at nt 1726-1730 that is associated with lower hepatitis B virus (HBV) DNA levels in the liver, and mutations at nt 1762/1764 that are correlated with higher HBV DNA levels. To confirm the effects of these mutations on the virus replication efficiency, substitutions nt 1726-1730 CTGAG and A1762T/G1764A in the HBV X (HBX) gene region were investigated alone or in combination. Cells Huh-7 or HepG2 were transfected with these constructs. The effects of these mutations on HBV were investigated at the gene and protein levels. The double mutation A1762T/G1764A increased whereas the nt 1726-1730 CTGAG mutations decreased the levels of released virion-associated and intracellular HBV DNA. The combined mutations had no appreciable effect on the replication capacity of the virus. Cells bearing the constructs with double mutations A1762T/G1764A contained the lowest levels of hepatitis B e antigen (HBeAg). Lowest expression of HBV X protein was in constructs that had both A1762T/G1764A and 1726-1730 CTGAG mutations. We think that changes in secondary RNA structure that were caused by these mutations might have been responsible for those results. Keywords: hepatitis B virus; X gene; mutants; replication.