人IgG3上游铰链区／p53四价功能域融合基因的构建及空间构象分析

目的 构建人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因,并进行空间构象的分析,方法 利用递归PCR法,扩增人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因,并在融合基因5′端和3′端引入SalI与HindⅢ酶切位点,将融合基因克隆人puC19载体中,经酶切鉴定及序列测定证实后,利用计算机软件进行空间构象分析,结果 人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因,经酶切鉴定及测序证实,其大小及核苷酸序列正确,与设计完全一致。计算机软件分析显示,融合基因表达产物可自动装配成四聚体,并具有4条柔性好的长多肽,可确保与其融合的其他基因片段空间构象的独立性。结论 人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因的成功构建,为进一步研制多价抗体奠定了基础。     

抗人CD33单克隆抗体(HIM3-4、WM53、M195)抗原识别表位的初步研究

目的：确定抗人CD33单克隆抗体（HIM3-4、WM53、M195）抗原识别表位所在区域，进而阐明抗体识别表位不同于其介导的生物学作用之间的关系。方法：将四个CD33胞外区不同长度的基因片段定向克隆入真核表达载体pDisplay，构建成真核表达载体pDisplay／EP1、2,3、4，分别将空载体和构建的质粒通过磷酸钙沉淀法转染入293T细胞，瞬时转染48小时后利用流式细胞仪通过抗血凝素A（HA）抗体标记以检测各质粒在细胞表面的表达，同时检测HIM3-4、WM53、M195和不同区段的结合活性。结果：抗人CD33单克隆抗体HIM3-4能识别pDisplay／EP1、2、3表达的蛋白，WM53能识别pOisplay／EP1表达的蛋白，M195则均能识别四个片段所表达的蛋白。结论：HIM3-4、WM53、M195识别的CD33抗原表位分别位于115—170、17—60、170—262氨基酸。     

抗CD3 scFv基因的真核表达及其生物学活性鉴定

目的：真核表达抗CD3单链抗体(scFv)，并研究其生物学活性。方法：将编码抗CD3 scFv的DNA片段插入真核表达载体pDisplay中。对所构建重组表达载体进行测序确认后，以电穿孔法将重组质粒导入Hela细胞，以原位杂交法检测抗CD3 scFv的表达，以3H TdR掺入法检测其在体外对T细胞的活化作用，以MTT比色法观察转染的。Hela细胞与T细胞混合培养后，诱发的细胞毒性T细胞的杀伤作用。结果：成功地构建了抗CD3 scFv的真核表达载体，并在Hela细胞中获得表达。所分泌的抗CD3 scFv在抗CD28mAb存在的条件下，能够刺激T细胞活化。将转染的Hela细胞与T细胞混合培养能够诱发CTL的杀伤作用。结论：真核表达的抗CD3 scFv具有刺激T细胞活化的活性，可用于构建对肿瘤进行免疫治疗的双功能分子。     

抗人CD33单链抗体的基因构建、表达及其生物活性检测

目的：构建及表达抗人CD33单链抗体（抗CD33-scFv）基因，并检测其生物活性。方法：采用RT—PCR方法从分泌抗人类白细胞表面分化抗原CD33单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞中克隆出VL和VH可变区基因，再通过重叠延伸拼接（splice—overlap extension）PCR方法在VH和VL可变区基因之间引入柔性连接肽（Gly4Ser）3，体外构建抗人CD33-scFv基因。将其克隆至原核表达载体PET-28a（＋）并在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达。结果：SDS-PAGE和Western blot分析结果表明，抗CD33-scFv在Rosetta（DE3）菌中获得高效表达，重组蛋白的相对分子质量（Mr）为30000，表达产物以不溶性包涵体形式存在，经过溶解包涵体，镍柱亲和层析纯化和体外复性过程，获得了高纯度的scFv片段。流式细胞术（FCM）分析结果证实抗CD33-scFv可与人类白细胞表面的分化抗原CD33结合，保留了鼠源性mAb的与CD33结合的活性。结论：重组抗人CD33-scFv基因构建与表达成功，并且通过复性得到有生物活性的scFv，为下一步针对髓系恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础。     

树突状细胞靶向性DNA疫苗的构建及其在CHO细胞的表达

目的 构建含OVA-Fc融合基因的真核表达质粒，证明其能在真核细胞CHO细胞表达。方法通过PCR从OVA-pcDNA3．1质粒中扩增出全长的小鼠OVA cDNA，酶切后克隆到含有小鼠IgG2a Fc cDNA的真核载体pMIgV，然后将OVA-Fc酶切后亚克隆入pcDNA3．1，构建真核表达载体OVA-Fc-pcDNA3．1；脂质体转染法将其导入CHO细胞，流式细胞仪、Western blot、ELISA法检测融合蛋白OVA-Fc的表达。结果酶切鉴定和序列测定证明真核表达载体OVA-Fc-pcDNA3．1构建正确；流式细胞术、Western blot、ELISA法均检测到转染的CHO细胞能表达OVA-Fc融合蛋白。结论OVA-Fc-pcDNA3．1真核表达质粒构建正确并能在真核细胞中表达，该质粒的成功构建与表达为进一步将其作为DNA疫苗治疗肿瘤、哮喘等疾病奠定了基础。     

人CD40-Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达与纯化研究

目的 建立稳定表达CD40－Ig融合蛋白的工程细胞株,获得大量融合蛋白以研究靶向阻断CD40：CD40L途径防治移植物抗宿主病（GVHD）策略的应用潜力。方法 自真核瞬时表达载体pIG／40Ig中切下CD40－Fc融合基因,插入pcDNA3．1载体中构建稳定表达载体。利用脂质体Lipo-fectamine将该载体转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆;夹心ELISA法检测上清中CD40－Ig融合蛋白的表达;Westem blot法鉴定其免疫学活性。利用有限稀释法对筛选出的混合克隆单克隆化。滚瓶法无血清大批培养工程细胞,ProteinA亲和层析法纯化,SDS－PAGE后薄层扫描分析纯度。利用流式细胞术检测该蛋白与Jurkat细胞表面CD40L的结合功能。结果 CD40－Fc融合基因插入pcDNA3．1载体后构建成功稳定表达载体p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为B2。ProteinA亲和层析纯化融合蛋白纯度达95％以上,该融合蛋白可特异结合Jukat细胞表面的CD40L。结论 CD40－Ig融合蛋白可模仿天然分子与其配基结合,为研究靶向CD40：CD40L途径的治疗制剂在防治GVHD中的潜在应用提供了有用的工具。     

抗人CD25分子单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定

目的:构建和表达抗人CD25分子单链抗体(scFv)蛋白,并测定其生物学活性。方法:用RT-PCR方法从能分泌特异性抗CD25单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因。用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起,构建抗CD25分子scFv的基因。将scFv基因克隆至pMD18T,用限制性内切酶切以及测序鉴定。将scFv基因连接到pBAD/gⅢA表达载体,转化Top10表达菌。阳性克隆用左旋阿拉伯糖诱导4 h,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度,竞争抑制ELISA实验检测其活性。结果:scFv基因长度约为700 bp。通过DNA序列测定和分析,构建出VL-(GGGGS)3-VH(但其中349位G突变为A,使Linker其中一位Gly→Ser)。其VH隶属于小鼠Ig重链可变区Ⅲ(C)亚类,全长351 bp,可编码117个氨基酸;其VL隶属于小鼠Igκ轻链可变区Ⅳ亚类,全长318 bp,可编码106个氨基酸。TOP10中表达的scFv抗体加上同时融合表达的两个标签6×His和C-mycMr约为31 000,结果符合scFv的Mr。竞争抑制细胞ELISA实验显示表达的scFv具有活性。结论:此scFv基因的表达产物具有一定的特异结合活性。为抗CD25 scFv的临床应用打下了基础。     

可溶性小鼠BTLA对树突状细胞表面B7-1和B7-2表达的影响

目的研究可溶性小鼠B/T淋巴细胞弱化因子（murine B and T lymphocyte attenuator ，mBTLA）-人IgG1 Fc融合蛋白（mBTLA-hIg）对树突状细胞表面共刺激分子表达的影响。方法克隆mBT／A基因，构建mBTLA胞外功能区和人IgG1Fc融合基因的真核表达载体（pmBTLA-hIg），并采用脂质体转染法，将pmBTLA-hIg质粒转染小鼠树突状细胞系（DC2．4）。采用RT-PCR、ELISA和Westem blot分别检测pmBTLA-hIg质粒转染DC中mBTLA基因mBNA的表达及细胞培养上清中mBTLA-hIg融合蛋白的表达；采用流式细胞术检测pmBTLA-hIg质粒转染对DC2．4表面共刺激分子B7-1（CD80）和B7-2（CD86）表达的影响。结果成功克隆了小鼠BT／A基因，并构建了真核表达载体；mBTLA-hIg融合基因转染的DC高表达mBTLA-hIg融合蛋白，并可结合到DC表面。表达可溶性mBTLA-hIg融合蛋白的DC2．4表面B7．1的表达上调，B7-2的表达下调，而且这种改变可被兔抗GST-mBTLA血清阻断。结论可溶性mBTLA-hIg融合蛋白对DC细胞表面研分子的表达具有调节作用，可能是BTLA反向信号作用于DC的结果。     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。     

真核表达载体pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的构建及其在NIH 3T3细胞株中的表达

目的: 构建pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的重组真核表达载体，并在NIH 3T3细胞株中表达。方法: 采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/IgGFc/CD80的真核表达载体pLNCX质粒上，转染NIH 3T3细胞株，经G418筛选细胞，用RT-PCR、流式细胞术检测目的基因表达情况。结果: 经菌落PCR、酶切及一次测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的成功构建；经RT-PCR法，能够从转染的NIH 3T3细胞中扩增出1条与目的基因大小一致的DNA片段，流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白。结论: 重组表达载体pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的构建，并在NIH 3T3细胞株中的成功表达，为该重组质粒转染原代T淋巴细胞从而制备CD20靶向性嵌合锚定T细胞奠定了基础。     

抗人精浆蛋白/抗CD3双特异性单链抗体的活性研究

目的:构建并表达抗人精浆蛋白/抗CD3的双特异性单链抗体(BsscFv),并检测其生物学活性。方法:利用重叠延伸拼接PCR,拼接抗人精浆蛋白scFv基因和抗CD3scFv基因,并在中间引入柔性短肽(GlySerGly)2,构建抗人精浆蛋白/抗CD3的BsscFv基因。测序正确后,将融合基因亚克隆入真核表达载体中,并在HeLa细胞中进行表达,采用流式细胞术(FCM)和51Cr释放试验,评价BsscFv的抗原结合活性和体外介导的特异性杀伤靶细胞的效应,以及利用裸鼠前列腺癌模型观察其在体内的抑瘤作用。结果:测序分析证实,Bss-cFv基因片段的大小为1.5kb,编码500个氨基酸,该序列与设计的完全一致。SDS-PAGE和Westernblot分析证明:表达产物存在于HeLa细胞的培养上清中,其相对分子质量(Mr)为61000。FCM结果显示:BsscFv可特异性的结合前列腺癌细胞LNCaP和CD3 淋巴瘤细胞Jurkat,结合率分别为54.1%和53.7%。体外实验表明,BsscFv可介导CTL对LNCaP细胞的杀伤。与对照组相比较,接种LNCaP的裸鼠在体内注射激活的CTL和BsscFv治疗后,肿瘤的生长明显受到抑制(P<0.05)。结论:抗人精浆蛋白/抗CD3的BsscFv具有一定的生物学活性,在体内、体外均可介导CTL杀伤靶细胞LNCaP。     

抗人乙酰胆碱受体scFv-人血清白蛋白融合蛋白的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:制备抗人乙酰胆碱受体单链抗体637(scFv637)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白,提高scFv637的稳定性。方法:用PCR扩增人HSA基因,并克隆到含有抗人乙酰胆碱受体scFv637基因的载体pHEN2中构建重组载体pHEN2-scFv637-HSA。以重组载体转化E.coliHB2151,表达产物用斑点杂交试验检测,并以SDS-PAGE和Westernblot鉴定其融合蛋白的相对分子质量(Mr)。结果:琼脂糖凝胶电泳显示,扩增的人HSA基因和融合基因的大小分别为1770bp和7054bp。构建的scFv637-HSA经测序证实核苷酸序列正确,并且正确克隆至载体的开放读码框架内。表达产物仅存在于pHEN2-scFv637-HSA转化的E.coliHB2151外周质裂解液中。表达的融合蛋白的Mr约为95900。结论:在E.coli中成功地表达scFv637-HSA融合蛋白,为进一步对其进行功能研究和应用奠定了基础。     

人CD226分子胞膜外区D1和D2真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的 构建含有人CD226分子胞膜外区结构域1(D1)和结构域2(D2)的真核表达载体,表达并纯化重组蛋白.方法用特异性引物分别扩增CD226 D1和D2的基因,定向插入真核表达载体pSecTag2B-Fc,进行酶切和DNA测序鉴定,重组质粒瞬时转染293T细胞,收集上清,纯化蛋白及SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果利用PCR方法克隆出CD226胞膜外区D1和D2的基因,并正确插入pSecTag2B-Fc载体中,真核表达载体瞬时转染293T细胞,Western blot结果证实转染293T细胞的培养上清液中含有hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc融合蛋白,培养上清经亲和层析柱纯化,可获得较高纯度的重组蛋白.结论 成功的构建了分泌型融合蛋白hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc真核表达载体,获得纯度较高的融合蛋白,为进一步探讨其配受体的相互作用机制奠定了基础.     

抗KDR单链抗体的构建、表达及生物学活性鉴定

目的: 构建并表达抗人血管内皮生长因子受体KDR单链抗体(scFv)蛋白, 并测定其生物学活性。方法: 设计合成抗KDR单抗 (mAb)Ycom1D3VH、VL引物, 通过重叠延伸拼接 (splicingoverlapextensive, SOE)PCR, 在VH 和VL基因间引入柔性短肽(Gly4Ser)3, 构建抗KDRscFv基因并进行序列分析。将其克隆入pAYZH原核表达载体, 在大肠杆菌中诱导表达, 并以ELISA及免疫荧光结合实验测定重组蛋白的生物学活性。结果: 序列分析表明, 抗KDRscFv基因的全长为 729bp, 编码 243个氨基酸。将重组体表达产物进行SDS PAGE及Westernblot分析显示, 融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为 30 000, 同预期的结果一致。表达产物主要以不溶性包涵体的形式存在, 表达量占菌体总蛋白的 20%。表达产物经变性、纯化及体外复性后, 纯度达 90%以上。ELISA和竞争性免疫荧光结合实验显示, 重组小分子scFv可与可溶性KDR抗原及表达KDR受体的人脐静脉内皮细胞特异性结合, 保留了亲本mAb的抗原结合活性。结论: 成功地构建了抗KDRscFv基因, 并在大肠杆菌中功能性表达, 为靶向诊断、治疗及进一步基因工程改造奠定了基础。     

人抗HER2单链抗体/精氨酸九聚体融合蛋白的基因构建、表达及鉴定

目的:构建人源性抗HER2单链抗体(scFv)/精氨酸九聚体(9R)融合蛋白基因,在大肠杆菌里表达纯化并检测该融合蛋白的活性。方法:采用PCR的方法,扩增融合基因scFv-9R,将获得的基因克隆入原核表达载体pQE30,在大肠杆菌M15中表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,通过Ni-NTA螯合层析纯化,透析复性,超滤浓缩。ELISA分析scFv-9R融合蛋白抗原亲和活性,凝胶迁移实验检测scFv-9R融合蛋白与siRNA结合活性。结果:成功构建了人源性抗HER2 scFv-9R融合基因,经IPTG诱导后在M15中以包涵体形式表达。表达的目的蛋白scFv-9R能与HER2抗原结合,同时具有siRNA结合能力。结论:scFv-9R具有结合抗原与siRNA双重活性,为靶向递送siRNA的研究奠定了基础。     

人野生型p53 cDNA的克隆、表达和意义

目的：为探讨肿瘤细胞ｗｔ ｐ５３蛋白功能失活机制的研究,检测肿瘤患者血清抗ｐ５３抗体辅助临床诊断提供人ｗｔ ｐ５３蛋白。方法 将人ｗｔ ｐ５３基因ｃＤＮＡ片段插入到大肠杆菌表达载体ｐＱＥ－３０中,得到重组表达质粒ｐＱＥ３０－ｐ５３,用ｐＱＥ３０－ｐ５３重组质粒转化大肠杆菌Ｍ１５细胞,转化菌落经ＰＣＲ扩增和ＢａｍＨⅠ、Ｘｂａ Ｉ酶切证实ｐ５３基因插入。ＩＰＴＧ诱导大肠杆菌表达ｗｔ ｐ５３蛋白,通过Ｎ     

抗人整合素αυβ3单链抗体的构建和表达

目的：利用基因工程抗体技术构建抗人整合素αυβ3单链抗体(scFv)。方法：从分泌抗人整合素αυβ3单抗(mAb)的杂交瘤细胞E10总RNA中，用RT-PCR扩增VH和VL基因，对其核苷酸序列分析后，通过PCR在VH和VL基因间插入柔性连接子(Gly4Ser)3 组装成scFv基因，并克隆至原核表达载体pTIG—TRX中。以重组子转化大肠杆菌B121(DE3)诱导目的基因表达。结果：转化菌可表达相对分子质量(Mr)为31000的scFv。Western blot证实，具有His6标签蛋白的表达。经低剂量的IPTG诱导和较低温度培养，scFv获得了可溶性形式表达。表达产物经Ni—NTA琼脂糖层析纯化后纯度达91％以上。ELISA鉴定证实，scFv具有良好的抗原结合活性。结论：成功地构建并表达抗人整合素αυβ3的scFv，为进一步临床研究奠定了基础。     

人源His-talin1原核表达载体的构建及其蛋白表达

目的克隆人源talin1 cDNA,构建其高效原核表达载体,并纯化得到高纯度His-talin1融合蛋白。方法 PCR法扩增talin1基因并连接到原核表达载体pET32a(+),筛选和测序鉴定阳性克隆。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经过IPTG诱导表达和亲和层析分离纯化表达产物,对纯化的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果成功扩增了2.4kb的talin1基因,构建了pET32a(+)-talin1重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达出His-talin1融合蛋白。经SDS-PAGE和Western blot方法 ,验证了高纯度纯化的融合蛋白。结论建立了高效稳定的His-talin1表达体系,为进一步研究Talin1蛋白的结构及其与P-selectin之间的关系打下基础。     

人GST-Cdc25C融合蛋白的原核表达、纯化及功能初步检测

目的:构建人Cdc25C基因原核表达载体,获得纯化的GST-Cdc25C融合蛋白,并对其功能进行初步检测。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增Cdc25C基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体,重组质粒转化大肠杆菌Ros-sate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot方法检测融合蛋白表达,通过GSTpull-down技术检测纯化蛋白与已知结合蛋白Chk2的相互作用。结果:构建得到Cdc25C基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为80 000的目的蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测,融合蛋白成功表达,并纯化得到GST-Cdc25C融合蛋白,GST pull-down检测证实GST-Cdc25C蛋白可以和已知相互作用蛋白Chk2相互作用。结论:成功克隆Cdc25C基因,并获得了活性良好的GST-Cdc25C蛋白,为进一步研究细胞周期蛋白调控机制奠定了实验基础。