生产干酪用的凝乳酶获得专利

对制造干酪用的重组凝乳酶的开发的竞争日趋激烈。美国 Genencor 公司(加利福尼亚州 South San Francisco)与美国 Chr.Hansen's Laboratory 公司(威斯康星州 Mitwau-kee)共同在重组凝乳酶的商品化上取得了惊人的进展,而美国专利局则已批准美国Collaborative Research(CR)公司(马萨诸塞州 Bedford)利用重组生物制造凝乳酶的专利。一直援助 CR 公司的研究工作的美国 Dow Chemical(DC)公司(密执安州 Miland)拥有国际销售权,支付专利使用费给 CR 公司。DC 公司现在正与计划商业生产重组凝乳酶的的第三个公司协商,办理副许可证。利用上述重组酶产品在食品加工业中是第一个。估计美     

碱性条件下溶解包涵体提高凝乳酶原复性率的机制

重组凝乳酶原的复性效率不仅依赖于复性条件,而且与包涵体的溶解条件(即变性条件)有关.含有凝乳酶原的包涵体在pH11,8mol/L脲中溶解后,其复性率较在pH8,8mol/L脲中溶解的可提高1倍,由20%左右提高到40%左右.其机制是碱性条件有利于破坏分子间交联的二硫键从而增加凝乳酶原的溶解度.更为重要的是碱性条件使凝乳酶原分子处于一种还原性更强更为伸展的状态,这种状态容易进行正确再折叠.     

丝状真菌能分泌外源蛋白

Genencor公司的一个研究小组已用重组DNA技术开发出一种丝状真菌分泌系统。他们是用一种曲霉(Aspergillus)实现这一点的。该公司现用大规模发酵曲霉及其他丝状真菌来生产商用的食品级酶。已用这项新技术分泌凝乳酶,此酶通常由牛第四胃的壁衬细胞分泌,可用于奶酪生产。     

牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的重组表达

通过PCR技术从克隆载体pMD18T-Prochy上扩增牛凝乳酶原基因,双酶切后定向插入到酵母表达载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-Prochy,线性化后电转化毕赤酵母GS115,经PCR和测序鉴定凝乳酶原基因成功插入到毕赤酵母的基因组中。在甲醇诱导下进行凝乳酶的表达,SDS-PAGE分析证明重组凝乳酶的分子量约为37 kD,培养基上清液中凝乳酶的活性为12.2 SU/mL。本研究首次应用毕赤酵母表达牛凝乳酶,在培养基中获得分泌表达的重组凝乳酶,为干酪工业提供了新型及优良的凝乳酶来源。     

解淀粉芽孢杆菌凝乳酶的克隆、重组表达及酶学性质

为了实现解淀粉芽孢杆菌来源凝乳酶的异源表达,并探究重组凝乳酶的酶学性质。以解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,扩增得到凝乳酶编码基因proMCE,构建了重组菌株E.coliBL21(pET28a-proMCE),并成功表达了重组凝乳酶。通过Ni柱亲和层析法纯化具有活性的凝乳酶,分子量大小约为28.5kDa,纯化后比酶活达到1096.97SU/mg,纯化倍数达到4.56倍,回收率为66.51%。对该重组酶酶学性质进行了初步研究,重组凝乳酶分别在70℃、65℃表现最大凝乳酶活力与蛋白酶活力,60℃处理20min,凝乳酶活力与蛋白酶活力均被钝化80%,为热不定性酶。酶的最适反应pH为5.0。在pH5~7条件下处理后,凝乳酶活力相对稳定,能保留超过70%的活力。     

细菌制造牛生长激素为提高牛肉、牛乳产量开新途径辟

美国Genentech公司和Mosanto公司于三月十三日宣称:利用重组DNA技术成功地制造出促进牛生长的激素。利用重组DNA技术转向农业产品的制造是由Genentech发起的。这两个公司今后还要共同研究各种动物激素,可望利用遗传工程提高农业生产做出贡献。     

pta基因敲除对L-色氨酸发酵的影响

[目的]探究pta基因缺失对大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的影响.[方法]运用Red重组技术敲除pta基因,构建pta缺失株E.coli TRTH△pta.利用30 L发酵罐进行分批补料发酵试验,考察重组菌E.coliTRTHApta发酵0生产L-色氨酸过程中生物量、L-色氨酸产量、有机酸含量、发酵液中NH4+浓度及变化....     

凝乳酶原mRNA的分离及其cDNA克隆的鉴定

用异硫氰酸胍法从牛胃粘膜组织中分离到poly(A)RNA。经电泳分析、体外翻译活性分析及No rIhern转移杂交分析,结果表明,poly(A)RNA中含有完整的,具有生物活性的凝乳酶原mRNA,大小为16S。从poly(A)RNA建立的cDNA库中,以C500-pepsinogen为探针进行初级筛选,集中阳性克隆成为凝乳酶原和相关胃蛋白酶原cDNA富集库。从寓集库中选出插入片段带有凝乳酶原基因所特有的EcoRI切点的19个克隆。经限制性内切酶谱分析确定pcT 5为凝乳酶原基因克隆,其5’端缺少80bP。以pCT 5的插入片段为探针,从cDNA库中进一步筛选得到pCTl5。酶谱分析表明,pcTl5的两端均足以覆盖编码区域,而在917位左右约有110bP的缺失。从而不仅充分证明了分离的poly(A)RNA中含有全链长的凝乳酶原mRNA,而且还可通过拼接pCT5及pCTl5获得完整的凝乳酶原基因。     

Novo公司获准制造重组的人胰岛素

丹麦环境保护局已批准Novo工业公司制造基因重组人胰岛素的申请。计划采用酵母菌为宿主生产重组人胰岛素,其回收提纯工段将在该公司花2700万美元新建的Kalundborg工厂中进行,预计在1987年上半年投产。     

牛凝乳酶原基因的合成及其在乳酸克鲁维酵母中的表达

凝乳酶在奶酪加工中应用广泛,为获得高活性的凝乳酶制剂,采用乳酸克鲁维酵母为宿主,首次对经密码子优化的牛凝乳酶原基因进行表达。利用DNAWorks3.0软件辅助设计,用两步PCR法合成了小牛凝乳酶原基因(GenBank Accession No.AA30448)。将该基因插入酵母表达载体pKLAC1,构建了重组载体pKLAC1-Prochy,并用电脉冲法将线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中。通过含1%酪蛋白的YEPD平板活性筛选,PCR鉴定,最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌chy1。该菌株可分泌表达牛凝乳酶原,经SDS-PAGE分析,证明重组牛凝乳酶原的分子量约为41kDa,符合预期大小,酸化处理后为36kDa,证明可以正确自我剪切。液体培养96h后,酶活最高达到99.67SU/mL。分别以半乳糖和葡萄糖为碳源的条件下表达,其酶活性差异不大,说明在发酵期间,可以不经过半乳糖诱导即可产生高水平的牛凝乳酶原产物。该工程菌的获得为进一步优化产酶条件及放大工艺提供了条件,并为凝乳酶的工业化生产奠定了基础。     

91年12月销售重组胰岛素

新北欧药物公司在12月销售5种重组人胰岛素制剂。这是用美国Zymogenetics公司开发的酵母为宿主,利用基因操作技术制造的。该公司现也已申请引进配合型和注射制剂等,1992年将胰岛素制剂更换成重组人胰岛素,分割该公司和日本市场的盐野义制药公司、美国Eli Lilly公司从1986年销售重组人胰岛素。日本决定1992年用基因操作技术制造胰岛素。丹麦Novo Nordisk公司开发用蛋白分解酶将猪胰岛素(有一个氨基酸序列与人的不同)变换成人型的制造     

美创造出脓毒性咽喉炎重组疫苗

美国洛克菲勘大学和俄勒冈州立大学的科学家在创造抗A型脓毒性咽喉炎遗传工程疫苗中取得了极大进展。据研究者说,利用重组DNA技术已创造出至少能抵抗两种型式的脓毒(?)咽喉炎的疫苗。     

关于基因工程的专刊

美国斯坦福大学在Cohen等人1974年关于基因重组的研究报告发表之后不久,向美国专利商标局申请了专利。1980年12月,斯坦福大学被批准取得了美国第一号有关基因重组的专利。这是一项基本专利、以Cohen等的工作为主要内容,实际上包括了目前所知的全部基因重组技术。     

细菌制造牛生长激素为提高牛肉、牛乳产量开新途径辟

美国Genentech公司和Mosanto公司于三月十三日宣称:利用重组DNA技术成功地制造出促进牛生长的激素。利用重组DNA技术转向农业产品的制造是由Genentech发起的。这两个公司今后还要共同研究各种动物激素,可望利用遗传工程提高农业生产做出贡献。     

Genencor公司在酶技术方面取得进展

Genencor公司(南旧金山,加利福尼亚州)在几种可产生大量凝乳酶的丝状真菌的遗传操作方面取得了很大的进展。该公司还在研究一种能产木质素酶的方法,该酶能分解木质素。该公司将凝乳酶基因插入到两种丝状真菌,即泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和一种木霉Trichoderma reesei中已获得成功,这些菌分泌出存在于犊牛胃中的物质的精确复制物。     

鲑生长激素的基因操作宿主由大肠菌杆转向酵母菌

为用基因操作制造鲑生长激素,所用宿主由大肠杆菌的实用化研究,已在日本协和发酵公司开始。该公司从美国菲利普(Phillips)石油公司引进了甲醇同化酵母菌巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)的基因操作技术和高浓度培养技术,并着手共同研究。 这次的引进表明,用大肠杆菌工业生产具有活性的鲑生长激素(SGH)看来是困难的。SGH是疏水性高、难溶于水的蛋白,用大肠杆菌制造的重组SGH也难于提纯。     

美日生物工程研究的几项成果

一、美国有两个公司的遗传工程组构建一种超分泌酵母突变株,该株是用去掉原凝乳酶(系非活性的)基因的质体(指杂种质体)引入酵母基因组内的,其凝乳酶的分泌效率提高10倍,最高达80倍(ASM News,51(11):560—56,1985)。     

木瓜凝乳酶基因的克隆及序列分析

通过设计一对特异性的引物,采用RT－PCR方法从未成熟的木瓜组织中扩增得到木瓜凝乳酶基因,并将其重组到pPIC9K载体中,转化大肠杆菌并筛选阳性克隆,序列测定并利用BLAST软件进行核酸及氨基酸序列相似性分析,结果表明：通过序列组成及特征结构分析,扩增得到的基因为木瓜凝乳酶基因。     

牛凝乳酶原基因在乳酸乳球菌中的表达

【目的】利用乳酸乳球菌nisin诱导基因表达系统(the NIsin Controlled gene Expression system,NICE)表达牛凝乳酶原。【方法】从克隆载体pS19-PPC中获得牛凝乳酶原基因,将该基因与表达载体pNZ8148连接并电转化乳酸乳球菌NZ9000,转化子经酶切、PCR和测序鉴定后,用nisin进行诱导表达,表达产物利用SDS-PAGE和Western blot鉴定,表达产物纯化后检测凝乳活性。【结果】重组牛凝乳酶原与天然牛凝乳酶原比较,其分子量大小、免疫性质、生物活性和抑制剂敏感性没有发现显著差异,其凝乳活性可达2×103IMCU/mL。【结论】在乳酸乳球菌中表达了具有凝乳活性的牛凝乳酶原,同时乳酸乳球菌作为发酵剂和凝乳酶产生菌双重角色的实现,为奶酪加工提供了新思路和新方法。     

日本宝酒造委托以色列Orgenics公司研制用于检测混入医药品中的核酸的 DNA探针

日本宝酒造(宝酿酒公司)委托以色列的 Orgenics 公司研制检测混入医药品中的 DNA的 DNA 探针。这种探针将用于检验药盒,以检测由基因重组所制造的医药品中是否混入了DNA。美国有规定,对由基因重组所制造的医药品须标明其中不含有多余的成分,他们利用DNA 探针检测混入的 DNA。但是,日本现在还没有这种规定,也还没有用干检测的制品。今后日本也将扩大研制基因重组的医药品,也将需要有检测 DNA 的检查。