苹果MpSNAT1的克隆与表达特性分析

以‘富士’和‘嘎啦’苹果(Malus pumila)叶片总RNA为模板,克隆5-羟色胺-N-乙酰基转移酶(SNAT)基因,利用DNAMAN、MEGA 5.1等软件对该基因进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR技术测定SNAT的表达水平。结果表明,获得的苹果SNAT全长c DNA序列为750 bp,编码249个氨基酸,命名为Mp SNAT1(登录号MF443136)。Mp SNAT1编码蛋白的理论分子量约27.8 k Da,为非分泌型、亲水的不稳定蛋白,具有乙酰基转移酶(GNAT)功能结构域。序列多重比对及系统进化树分析表明,Mp SNAT1编码氨基酸序列与桃和拟南芥的同源性高,一致性分别为91.2%和63.6%。炭疽叶枯病菌接种后,苹果叶中Mp SNAT1表达量升高,但‘富士’和‘嘎啦’中基因上调水平和持续时间存在显著差异。此外,外源褪黑素处理后,苹果叶中Mp SNAT1显著上调表达,但外源水杨酸(SA)处理后,Mp SNAT1表达量均不同程度降低,表明该基因表达不受SA诱导。     

苹果N-乙酰基-5-羟色胺-O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达

以‘富士’和‘嘎啦’苹果(Malus pumila)叶片总RNA为模板,利用反转录PCR(RT-PCR)技术,克隆N-乙酰基-5-羟色胺-O-甲基转移酶(ASMT)基因,通过DNAMAN、MEGA 5.1、Prot Param等生物信息学软件对基因cDNA序列、系统进化关系、理化性质等进行分析,将克隆的苹果ASMT基因与表达载体pET32a连接,构建原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌株Rosetta(DE3)中,优化原核表达条件,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测融合蛋白的可溶性,用蛋白免疫印迹法(western blot)和酶活性测定验证目的蛋白的表达。结果表明,获得了苹果ASMT的全长cDNA序列,命名为MpASMT1(Gen Bank登记号MF135479)。该基因开放阅读框(ORF)为1 077 bp,编码358个氨基酸。MpASMT1编码蛋白的理论分子量约为39.7 kDa,等电点为5.42,是非分泌型、疏水的稳定蛋白;其263位组氨酸(His)为催化位点,225位谷氨酸为底物S-腺苷甲硫氨酸结合位点。多序列比对及系统发生树分析表明,MpASMT1编码的氨基酸序列与珠美海棠(M.zumi)MzASMT1(KJ123721)同源性最高,相似性达99.2%,其次为葡萄(Vitis vinifera)ASMT(LOC100248671),氨基酸序列相似性为66.4%。原核表达结果显示,经0.25~2.0 mmol·L~(-1)异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的重组质粒可特异性表达分子量约58 kDa的融合蛋白,且低温条件(15和25°C)能够提高该蛋白的可溶性表达;western blot分析表明融合表达蛋白能与His单克隆抗体特异性结合,纯化蛋白的酶活性为7.8 pmol·mg~(-1)(蛋白),进一步证实MpASMT1编码蛋白成功表达。     

芥蓝八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1的克隆及原核表达

本研究以‘明丰香菇’芥蓝叶片总RNA为模板,采用同源克隆法设计并合成特异性引物,采用反转录PCR技术克隆得到芥蓝类胡萝卜素生物合成关键结构基因-八氢番茄红素脱氢酶基因Ba PDS1。序列分析表明,该基因c DNA序列长1 692 bp,编码563个氨基酸,推测蛋白等电点为5.96,理论分子量为63.15 k D;序列比对发现芥蓝Ba PDS1基因编码的氨基酸序列与甘蓝、花椰菜、油菜等植物的PDS具有很高的同源性;系统进化树分析表明,芥蓝PDS1与甘蓝PDS1蛋白的亲缘关系最为接近。之后构建p EASY-Blunt E1-Ba PDS1原核表达载体,转入Transetta(DE3)感受态细胞中,诱导后获得特异表达蛋白条带,且大部分以包涵体形式存在。本研究为揭示芥蓝Ba PDS1基因功能提供了一定的理论依据。     

多发性骨髓瘤细胞株ARH-77L1逆转录酶基因的克隆及体外表达研究

通过菌落原位分子杂交,从多发性骨髓瘤细胞株ARH-77 cDNA文库获得L1逆转录酶基因5’端序列．随后使用3’RACE技术,获得L1逆转录酶基因3’端序列及poly(A)尾．生物信息学分析表明：该L1逆转录酶DNA序列有一长552bp开放性阅读框,编码184个氨基酸残基的多肽链,其相对分子质量约为21kDa．同时将编码L1逆转录酶保守区的开放性阅读框DNA片段与原核表达载体pQE30连接,得到重组原核表达质粒,利用大肠杆菌表达并获得L1逆转录酶融合蛋白．     

草莓ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸。序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性。系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近。原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达。用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花红果粉红果白果青果叶。     

苹果生长素输入载体MdAUX1的基因克隆及在拟南芥和烟草中的遗传转化

生长素的极性运输对调节植物生长发育起重要作用。生长素转运蛋白调控生长素的极性运输。本研究从‘嘎啦’(Malus×domestic‘Royal Gala’)苹果中克隆了生长素输入载体基因Md AUX1(基因序列号:MDP0000384437)。序列分析表明,该基因包含长为1 443 bp完整的开放阅读框,编码含有480个氨基酸的蛋白。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,AUX1在不同物种间具有高度的序列保守性,其中,苹果Md AUX1与欧洲甜樱桃Pa AUX1亲缘关系最近。半定量PCR分析显示,Md AUX1在苹果的茎中表达量较高。通过农杆菌介导的遗传转化获得转Md AUX1基因的拟南芥和烟草。转基因拟南芥根系表型观察结果显示,Md AUX1基因在拟南芥中异位表达后,会抑制主根伸长,促进侧根形成;在外源NAA处理下,转基因拟南芥对主根伸长的抑制作用得到部分恢复。在烟草中过量表达Md AUX1基因能够显著促进植株地上部分生长。以上结果说明苹果Md AUX1基因在调节植物生长发育中发挥重要作用。     

无籽刺梨(Rosa kweichonensis var.sterilis)RksAGL基因克隆及表达分析

以无籽刺梨(Rosa kweichonensis var.sterilis)花芽提取的RNA为模板,采用同源克隆结合RACE技术克隆得到无籽刺梨AGL基因的c DNA全长,命名为Rks AGL。序列分析表明,c DNA全长1 089 bp,开放阅读框长度为747 bp,可编码248个氨基酸。编码蛋白分子质量预测为28.56 k D,等电点为9.40,无信号肽序列。分析表明,Rks AGL基因属于MADS-box基因家族C类基因,其编码的蛋白与其它植物AGAMOUS类蛋白具有较高的同源性。实时定量PCR分析表明,RksAGL基因仅在雄蕊和心皮中表达,在萼片和花瓣中不表达     

草莓ξ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ξ-胡萝卜素脱氧酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸.序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性.系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近.原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达.用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草每的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞叶.     

一个新的白血病相关基因LRP16全长cDNA的克隆、序列分析及表达特征

 克隆一个与白血病复发相关基因 (LRP1 6)的全长 c DNA序列 ,对其进行染色体定位、组织表达谱分析 ,并对该基因编码蛋白质进行原核表达 .首先用获得的一段 3kb DNA片段在 NCBI提供的 h ESTs数据库中进行电子杂交并对重叠克隆片段组装 ,再设计引物进行 c DNA末端快速扩增(RACE技术 ) .采用 Northern印迹方法进行组织表达分析 .以高通量基因组序列 (HTGS)数据库为基础进行染色体定位 .对构建的克隆菌用 IPTG诱导重组蛋白表达后进行 SDS- PAGE,同时对重组体测序确证 .钓取了该基因全长 c DNA、推导所编码的氨基酸序列 ,并将该基因定位于染色体1 1 q1 2 .2 .原核表达筛选获得了该基因重组子的一个缺失体 .对 LRP1 6基因全长 c DNA的序列分析提示 ,该基因可能编码两种 N端不同的蛋白质 ,且该基因的转录本可能存在一种丰度较低的剪接体 .     

枇杷八氢番茄红素合成酶基因的克隆及表达分析

本研究以‘大五星’(红肉)和‘川农1-5-9’(白肉)枇杷不同发育阶段的果皮、果肉为材料,采用同源克隆法从枇杷果实中克隆类胡萝卜素合成途径中关键酶基因PSY,利用生物信息学方法分析所获得的核苷酸序列及推导的氨基酸序列,再利用qRT-PCR从转录水平上检测两种枇杷不同发育阶段表达水平。发现枇杷PSY基因cDNA序列全长1 191 bp,具有完整开放阅读框,编码396个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,枇杷PSY蛋白与其他物种PSY蛋白具有很高的相似性,与苹果(Malus domestica)相似性高达98%。qRT-PCR分析表明,随着枇杷果实的发育,PSY基因表达量明显增加,与转色期后枇杷总类胡萝卜素含量变化一致,表明PSY基因可能参与枇杷类胡萝卜素合成的调控。     

解淀粉芽孢杆菌YN-1抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

本文以解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株为研究对象,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出编码TasA抑菌基因的全长DNA,并构建pGEX-4T2/TasA原核表达载体,获得TasA-GST融合表达的抑菌蛋白。测序结果表明,解淀粉芽孢杆菌YN-1TasA基因核苷酸序列全长为786bp(GenBank登录号:EU131674),编码261个氨基酸残基;同源性分析表明,它与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens FZB42(YP_001421886)序列的同源性最高,达98%,预测蛋白分子量为31kD。SDS-PAGE分析表明,TasA基因能在大肠杆菌BL21中表达,Western印迹分析pGEX-4T2/TasA原核表达载体,检测到约57kD的TasA-GST融合外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。表达产物细胞裂解液上清经Ni柱层析,表明浓度为500mmol/L咪唑洗脱缓冲液时获得较高浓度和纯度的纯化蛋白。进一步抑菌活性分析表明表达产物对黄瓜灰霉病病原菌检测平板上显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为今后深入研究TasA抑菌蛋白基因以及抗病转基因工程提供了参考。     

苹果MAX1基因的克隆和表达及启动子分析

MAX1(MORE AXILLARY GROWTH1)是独脚金内酯(Strigolactones,SLs)合成途径中的关键基因,为了研究MAX1在苹果分枝调控中的功能,以苹果‘长富2号’(Malus domestica‘Nagafu 2’)腋芽为材料,采用PCR方法,克隆MdMAX1基因,进行生物信息学和表达水平分析;采用瞬时表达转化烟草,进行GUS染色,分析MdMAX1启动子活性。结果表明:(1)成功克隆得到苹果MAX1,其开放阅读框(ORF)1620 bp,编码539个氨基酸;系统进化和基序分析表明,MdMAX1和已知的A1型MAX1相似。(2)qRT-PCR分析表明,MAX1基因在‘长富2号’嫁接苗茎中高表达,并在腋芽本身有表达;RNA-seq分析表明,细胞分裂素(6-BA)处理苹果腋芽96 h后MAX1基因的表达水平显著降低。(3)成功克隆获得‘长富2号’MAX1启动子序列片段(1500 bp),顺式作用元件预测显示MdMAX1启动子序列中存在光响应元件,GUS活性分析表明光照处理能够减弱MAX1启动子的活性。该研究为进一步研究苹果MAX1参与SLs合成、调控苹果分枝的功能奠定了基础。     

甜樱桃UV-B光受体基因UVR8的克隆及其表达分析

UVR8(UV resistance locus 8)是目前唯一被描述的植物紫外光B(UV-B)特异受体,能感受环境中的UV-B,从而调控植物生长发育进程。本研究以甜樱桃‘红灯’果实为试验材料,利用RT-PCR技术,获得甜樱桃UVR8基因c DNA全长序列。该序列包含一个长1 329 bp的开放阅读框,编码442个氨基酸,相对分子质量为47.80 k D,将该基因命名为Pac UVR8并提交Gen Bank数据库,收录号为(KX671127)。氨基酸保守域分析表明,Pac UVR8基因编码的蛋白包含7个RCC1结构域,该氨基酸序列与其他植物序列相似性在78%~98%之间。同时,利用荧光定量PCR分析UVR8基因在3种不同颜色的樱桃果实生长过程的表达情况,其中‘黑樱桃’和‘红灯’随着果实成熟,果皮颜色逐渐变红,UVR8表达量逐渐上升;而黄色品种‘佐藤锦’在成熟时期基因表达量表现为先增长后减少,在转色期的20 d表达量最高。本研究为甜樱桃光受体对光应答的分子机理及解释甜樱桃着色分子机制提供了一定的理论依据。     

中国野生毛葡萄芪合成酶基因克隆及表达分析

采用RT-PCR技术克隆中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因,命名为VqDSTS1,并进行序列及表达模式分析.结果表明:VqDSTS1基因cDNA编码区全长为1 179bp,GenBank登录号为JQ342086,编码392个氨基酸;氨基酸序列分析表明,VqDSTS1含有芪合成酶基因家簇的特征识别序列‘IPNSAGAIAGN’和‘GVLFGFG-PGLT’;序列比对显示,VqDSTS1与其他葡萄种质的芪合成酶氨基酸序列一致性在95.2%～98.7%之间;半定量RT-PCR分析表明,VqDSTS1受白粉病诱导表达,呈双峰模式.为进一步研究中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因家族的表达及功能分析提供了基础.     

红笛鲷p38β MAPK基因的克隆及原核表达

鱼类p38 MAPK基因在宿主免疫调控及抵御病原侵染的过程中具有重要作用。利用RACE技术克隆了红笛鲷p38βMAPK基因(Ls-p38β,Gen Bank登录号为KJ502277)。序列分析结果显示,Ls-p38βc DNA全长1 628 bp,开放阅读框1 086 bp,可编码361个氨基酸,预测其编码蛋白的分子量为41.6 k D,理论等电点为5.74。该基因推导的氨基酸序列含有p38 MAPK家族保守的双磷酸化激活环(TGY),与尼罗罗非鱼的p38β有97%的相似性。将此基因定向插入原核表达载体构建重组表达质粒p ET32-p38β后导入BL21(DE3)菌株,利用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE与Western blot分析显示约在60 k D出现特异蛋白条带,与预期分子量大小相符,说明Ls-p38β融合蛋白表达成功。     

棉蚜细胞色素P450 CYP6J1的克隆与表达

为了深入了解细胞色素P450 CYP6J1蛋白的结构和功能,本实验克隆获得了棉蚜Aphis gossypii P450CYP6J1基因,对该基因进行信息学及原核表达分析,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达结果,并用Western-blot进行验证。结果表明,P450 CYP6J1序列长1 398 bp,编码氨基酸数为465,理论分子量为53.67 k D,理论等电点为8.80。氨基酸序列分析表明该序列具有完整的开放阅读框,且没有信号肽。同源性分析表明,棉蚜c DNA序列推导的氨基酸与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum的保守性最为接近,一致性可达92%。在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达获得的His-CYP6J1蛋白,并用Western-blot检测目的蛋白大小正确。这些研究结果为棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗体制备提供了基础。     

油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的克隆与表达分析

以国审油茶(Camellia oleifera)良种‘华硕’种子为材料,在已构建的转录组和表达谱数据库基础之上,采用RACE技术,克隆获得油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的全长c DNA序列,命名为Co ACAD(基因登录号KJ910338)。该基因c DNA全长为2702 bp,含有2487 bp的开放读码框,编码828个氨基酸,分子量为92.4113 k D,理论等电点p I为8.47,具有2个比较明显的跨膜区和酪氨酸蛋白激酶活性位点LVHGDFRIDNLVF,存在5个亚结构域;在Co ACAD基因c DNA全长序列的基础上构建表达载体,其中原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达,获得表观分子量约为93 k D的目的蛋白;实时荧光定量PCR分析表明,Co ACAD基因在果实膨大期和成熟期上调表达,预示着Co ACAD基因可能在种子发育过程中参与能量供应过程的调控。     

重金属胁迫下稀有鲫抑制消减杂交文库的筛选与分析

重金属包括镉和铅等污染严重威胁人类健康。为从基因水平研究鱼类应答重金属胁迫的分子机理,本研究利用抑制消减杂交技术构建稀有鲫Gobiocypris rarus对镉处理反应的正、反向抑制消减文库。文库质量检测表明消减效率达210倍,通过对正、反向文库中部分表达序列标签进行序列测定,获得9条表达丰度较高的表达序列标签,平均长度为438 bp。利用快速扩增c DNA末端技术克隆获得核糖体蛋白s18(Rps18)基因的完整编码区,序列长度为525 bp,其中编码区459 bp,编码152个氨基酸,3’非翻译区38 bp,5’非翻译区28 bp。并利用实时荧光定量技术对Rps18基因在铅胁迫下的表达谱进行了研究,结果表明稀有鲫肝组织中Rps18基因的表达量变化较明显。     

新型小鼠淋巴组织特异性肌动蛋白结合蛋白相关序列cDNA克隆

 应用抑制性差减杂交技术 ( SSH)克隆两种不同小鼠胸腺基质细胞的差异表达基因 ,获得新基因片段 C55.通过 Gen Bank检索及 RT- PCR扩增出一个全长 1 .4kb的 c DNA.杂交分析认为它是一个完整的 c DNA序列 .c DNA序列分析表明 ,它拥有一个 636bp的开放读码框架 ,编码 2 1 2个氨基酸 .同源序列比较发现 ,它编码一个肌动蛋白相关蛋白的新成员 ,该序列与多种已知的肌动蛋白相关蛋白 SM2 2 α及其同源蛋白在氨基酸水平上有 62 %～ 95%的同源性 .Northern杂交分析显示 ,该基因 m RNA转录本在两种不同胸腺基质细胞中的表达存在显著差异 . RT- PCR分析显示 ,该基因特异表达于小鼠淋巴相关组织中 ,而在非淋巴组织中无表达 .     

棉花HSP70基因的克隆与原核表达

以抗旱性较强的棉花品种‘KK1543’为材料,采用RT-PCR技术克隆了1个棉花HSP70基因,命名为GhHSP70。研究结果表明:GhHSP70基因开放阅读框长1 997bp,编码648个氨基酸,GhHSP70蛋白相对分子量为70.94kD,等电点为4.83。氨基酸序列比对和系统进化树分析发现,GhHSP70与欧洲大叶杨HSP70的亲缘关系最近,氨基酸序列一致性达到96.4%。为进一步分析基因的功能,构建原核表达载体pGEX-4T-1-GhHSP70,并在大肠杆菌中异源表达。SDS-PAGE分析表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致,重组蛋白在37℃,0.2mmol/L IPTG诱导2h时表达量最大。研究为进一步研究棉花HSP70基因功能奠定基础。