p53转录活化的p21和Gadd45在细胞DNA损伤监视中的作用

p2 1,Gadd45均是受抑癌基因p5 3转录调控的分子 ,当电离辐射引起细胞DNA损伤时 ,p2 1,Gadd45基因的转录以p5 3依赖的方式增强 .为了深入探讨p2 1,Gadd45在DNA损伤监视中的作用 ,构建了稳定表达p2 1及Gadd45反义RNA的p2 1^as/MCF 7及Gadd45 ^as/MCF 7细胞系 .对辐射引起这些细胞G₁期阻滞、DNA损伤修复和细胞凋亡的发生进行了研究 ,发现Gadd45同p2 1一样 ,当其表达受阻后辐射引起的细胞G₁期阻滞明显减弱 ,宿主细胞对辐射损伤的报告基因的修复减弱 ,还观察到辐射引起的p2 1表达受阻的细胞调亡的增加 ,结果表明p2 1,Gadd45通过参与多种辐射细胞学反应发挥DNA损伤监视作用 .     

NtMTP1基因过表达对增强烟草Zn胁迫耐受性的研究

该研究采用实时荧光定量PCR（qRT PCR）技术,对烟草金属耐受蛋白1（MTP1）基因（NtMTP1）在烟草不同组织以及不同质量浓度ZnSO4处理下的表达进行了分析;利用农杆菌介导法,将NtMTP1基因植物过表达载体pBI121 35S∶∶MTP1转化野生型烟草,筛选得到NtMTP1基因过表达的转基因烟草植株,并进行不同质量浓度ZnSO₄处理,检测NtMTP1基因过表达对烟草Zn胁迫耐受性的影响。结果表明：NtMTP1基因在烟草中呈现组织特异性表达,主要在花与叶中表达;NtMTP1基因的表达受到Zn²⁺诱导,在400 μmol/L ZnSO₄处理后,表达量达到最高,为对照组的3.81倍;3株转基因烟草植株中NtMTP1基因表达量分别为野生型的10.42、7.61和11.84倍,与野生型相比,过表达植株对Zn胁迫的耐受性显著增强。研究结果为阐明NtMTP1基因在烟草体内Zn²⁺转运过程中的生物学功能提供了重要依据。     

H2O2－Fe3+所致人淋巴细胞DNA双链断裂损伤

采用脉冲电场凝胶电泳法检测H₂O₂－Fe³⁺体系产生的OH^·对人淋巴细胞DNA的双链断裂损伤．H₂O₂－Fe³⁺浓度与DNA双链断裂呈明显量效关系;随OH^·作用时间延长,细胞DNA双链断裂加重;过氧化氢酶对OH^·损伤有明显抑制作用．脉冲电场凝胶电泳法可检测到的H₂O₂和FeCl₃引起细胞DNA双链断裂的最低浓度为0.3 mmol/L和6 μmol/L．     

大肠杆菌tRNALeu的基因克隆、高效表达和纯化

用化学法合成的tRNA^Leu 和tRNA^Leu ₂的基因分别连接到 pTrc99B质粒载体上 ,转化到大肠杆菌MT10 2中 .DNA测序筛选得到与已知tRNA^Leu₁ 和tRNA^Leu₂ 的基因顺序完全相同的克隆 .对带有tRNA^Leu₁ 和tRNA^Leu₂ 基因的 2个转化子 (MT -Leu1和MT- Leu2 )表达条件进行了优化 ,MT- Leu1和MT- Leu2总tRNA中的亮氨酸接受活力分别达到 810 pmol/A2 6 0 和 5 60 pmol/A2 6 0 :tRNA^Leu₁ 占MT -Leu1总tRNA的5 0 % ;tRNA^Leu₂ 占MT- Leu2总tRNA的 3 0 % .经DEAE Sepharose、BD -纤维素层析柱 ,可分别将MT- Leu1和MT -Leu2的总tRNA纯化到 160 0pmol/A2 6 0 .首次准确地测得了 2种等受体tRNALeu的氨酰化反应动力学常数 .     

cry3A和vhb基因在转基因马铃薯中的表达

分别构建了含cry3A和cry3A+vhb基因的植物表达载体pBCry3A和pBC₃Vhb,并通过根癌农杆菌介导转化了马铃薯. 对转化再生植株进行PCR和DNA印迹分析表明,外源基因已整合到马铃薯基因组中, 且连续三代无性繁殖后转基因仍存在. ELISA分析表明cry3A基因在转基因植株中得到了高效表达, 在单转cry3A植株中最高表达量达0.1%, 转cry3A与vhb双基因株系中为0.065%. 水涝试验显示,转双基因且vhb mRNA的RT-PCR呈阳性的马铃薯植株,对低氧胁迫有较好的耐受性, 表明获得的上述转双基因马铃薯株系可能会具有很好的抗虫和耐涝性能.     

一种简单、快速制备与转化大肠杆菌受体细胞的方法

用TSB溶液取代常规的CaCl₂溶液,制备大肠杆菌受体细胞。在菌体处于对数早期时离心收集细胞,用TSB缓冲液悬浮后,即可用于质粒DNA的转化。转化效率可达10⁷～10⁸转化子／μgDNA。     

P2-DNA的转染及提纯

P₂-DNA即Phage 2型噬菌体的染色体DNA,是一条线状双股螺旋的DNA分子,分子量为2．2×10⁷Da。有19个碱基的牯性末端．可以连接成环状^[1]．1970年Bertani L.E. 和 Bertani G分离纯化得到P₂噬苗体并对其遗传学及理化特性进行了研究^[2],发现它在DNA复制,溶源性的控制以及基因重组等方面与温和性λ菌体不同;1979年Saint R B 等和Westoo A等先后研究了P₂-DNA的几种限制酶的切割图谱^[3]。P₂-DNA可望成为分子生物学研究的重要工具和实验材料。目前国内尚无这种材料．我们试图将少量的P₂-DNA转染获得P₂噬菌体,加以扩增纯化．抽提得到大量的P₂-DNA。为分子克隆和限制酶的研究提供有实用价值的材料和研究工具。     

Ca2+在粟酒裂殖酵母细胞周期时相中的作用*

以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)为研究材料,研究了Ca²⁺在细胞周期时相中的作用。当外源Ca²⁺浓度在0.5-20 mmol/L范围内,随Ca²⁺浓度增加,细胞增殖速度加快,延滞期逐渐缩短。但SD-Ca（CaCl₂省略）并不能终止Sch. Pombe的细胞周期。采用缺氮对群体细胞进行同步化,并以EGTA 螯合培养介质中低浓度的Ca²⁺,Sch. Pombe 细胞增殖被完全抑制,细胞流式法测定结果表明：细胞周期被终止在G1期。分析认为Ca²⁺ 对Sch. Pombe 细胞增殖是必不可少的,外源Ca²⁺在G1期向S期转化过程中起着关键性的作用。     

铁皮石斛四倍体离体诱导和鉴定及生理特性研究

以铁皮石斛原球茎为材料,经不同质量浓度的秋水仙素(C₂₂H₂₅O₆)和0.02 g·mL^-1二甲基亚砜(DMSO)混合水溶液处理后进行组织培养,通过对变异株进行形态学、细胞学及流式细胞仪鉴定,以期获得稳定的四倍体植株并分析其生理特性。结果表明:用2.0 g·L^-1秋水仙素和0.02 g·mL^-1 DMSO混合水溶液处理铁皮石斛原球茎36 h后,植株诱导率达20%;诱导四倍体植株在形态上明显矮化、茎秆粗壮、叶片变小增厚、气孔直径增大;细胞遗传学观察发现,四倍体植株染色体2n=4x=76,二倍体植株染色体2n=2x=38;流式细胞仪分析显示,DNA相对含量四倍体为400,二倍体仅为200;四倍体植株叶片中叶绿素含量、可溶性蛋白、可溶性糖含量均高于二倍体,分别为5.03、3.59、2.98 mg·g^-1;四倍体叶片中主要抗氧化酶POD和SOD活性均显著高于二倍体,分别为9.08、180.4 U·mg^-1,且四倍体植株明显降低了MDA含量累积。研究认为,2.0 g·L^-1秋水仙素和0.02 g·mL^-1 DMSO混合水溶液处理原球茎36 h可提高诱导成功率、降低嵌合体比例,此组合为诱导四倍体较佳诱导条件。     

Pi-ta+基因和几丁质酶基因双价基因导入水稻的研究

为了提高‘云资粳41’和‘云资粳43’的抗稻瘟病能力,利用农杆菌介导法将二价表达载体pCAMBIA1300-Pi-ta⁺-Bchi转化到水稻愈伤组织中。经组织培养获得再生苗,再通过氯酚红显色法、PCR检测和抗稻瘟病鉴定法获得抗稻瘟病的转基因植株,为进一步创建持久、广谱抗稻瘟病水稻新材料奠定基础。结果显示:(1)抗性愈伤组织经分化和生根培养后,共获得T⁰代水稻再生苗137株,其中‘云资粳41’14株,‘中花11’82株,‘云资粳43’41株。(2)经氯酚红显色法和PCR对再生苗检测,‘中花11’、‘云资粳41’、‘云资粳43’的转化苗阳性率分别为66%、43%和55%。证明2个外源基因已经整合到水稻基因组中。(3)对转化阳性植株温室接种稻瘟病病菌66b鉴定结果显示,转基因植株较非转基因植株对稻瘟病的抗性明显增强,而且转Pi-ta⁺基因和几丁质酶基因双价的水稻植株比转单价Pi-ta⁺基因或几丁质酶基因的水稻植株抗稻瘟病能力强。（4）氯酚红检测结果存在一定的假阳性,PCR检测结果更真实可靠,但氯酚红显色法方便、快速,结果观察直观,可对大量的转基因植株进行初步筛选。研究表明,转Pi-ta⁺基因和几丁质酶基因双价基因的水稻植株具有更高的抗稻瘟病能力。     

PKCγ过表达诱导C3H10T1/2细胞生长失控的初探

通过DNA重组构建蛋白激酶C_γ(PKC_γ)亚类的重组质粒并经基因转染技术和DNA印迹、蛋白质印迹与PKC活性分析,获得了过表达PKC_γ的C₃H₁₀T_1/2细胞——NCP4.NCP4细胞生长速率提高,流式细胞光度术检测表明,NCP4细胞G1期百分率下降,S期和G2+M期百分率升高,与对照组细胞相比,血清依赖性明显下降,贴壁依赖性降低,在软琼脂中形成小集落,出现部分转化表型.进一步检测,首次观察到NCP4细胞中癌基因c-sis表达明显增强,这可能是NCP4细胞血清依赖性下降的分子机理之一.实验表明,在正常C₃H₁₀T_1/2细胞中PKC_γ的过表达可直接导致细胞增殖加速并可诱导出现部分转化特征.     

肺腺癌A549/DDP细胞周期变化及其多药耐药性

用Fura-2/AM标记药物敏感的肺腺癌细胞A₅₄₉和抗顺铂药物的肺腺癌细胞A₅₄₉/DDP两种细胞胞内游离Ca²⁺,用碘化丙锭(PI)标记细胞DNA,检测其胞内Ca²⁺的变化及两种细胞增殖能力和细胞周期.实验结果表明,抗药性细胞株A₅₄₉/DDP胞浆内游离Ca²⁺的浓度仅为药物敏感细胞株A₅₄₉的1/3左右,同时前者的细胞增殖能力较后者明显增强,而且细胞周期也明显缩短.当用BAPTA-AM和EGTA或A₂₃₁₈₇和Thapsigargin处理细胞以降低或升高其胞内自由Ca²⁺浓度时可改变细胞的生长周期,二者也呈现明显差别.这些结果表明,对顺铂产生耐药性的人肺腺癌A₅₄₉/DDP细胞胞内Ca²⁺浓度的降低,可能影响细胞的增殖,缩短细胞的生长周期,特别是影响起决定作用的G1期,从而有利于肿瘤细胞多药耐药特性的维持.     

呼吸链电子漏在细胞凋亡中的作用

实验证明细胞色素c具有很强的抗氧化功能,在线粒体中氧化态的细胞色素c直接清除O2·-,还原态的细胞色素c清除H2O2.由于呼吸链传递电子合成ATP的同时,总有少部分电子从呼吸链底物端的复合物Ⅰ和Ⅲ漏出,而且漏出的电子首先使氧分子还原成O2·- ,然后O2·-歧化成H2O2,所以细胞色素c清除O2·-和H2O2的功能使呼吸链出现了两条电子漏旁路.细胞色素c通过这两条电子漏路径实现其控制线粒体中O2·-和H2O2水平的功能.根据两条电子漏旁路都是O2·-代谢路径的事实,引进了线粒体自由基代谢的概念,并从自由基代谢失调的角度探讨了呼吸链电子漏在细胞凋亡中的作用.     

玉米叶表皮短细胞发育过程的形态特征及栓质细胞作用研究

采用大田试验,直接撕表皮或对叶片进行固定处理,结合单染、复染、荧光染色等多种细胞学显色方法,利用光学显微镜、荧光显微镜和扫描电子显微镜系统观察玉米叶表皮短细胞的发生时期、发育过程、分布规律以及形态结构特征,研究K⁺和H₂O₂在栓质细胞中的分布变化与表皮其它细胞中K⁺和H₂O₂的分布及气孔器开关的关系,为进一步挖掘短细胞的新功能提供细胞学依据。结果表明：（1）短细胞是同步发生在玉米多叶位新表皮组织形成过程中,所有植株从第7新生叶,大部分第6叶,极少数第5叶的基部同时开始发生短细胞,之后新生的高位叶也均发生短细胞,并随着叶位的升高叶片各部位短细胞密度均增大,所有植株的1~4叶（因不再生长）均无短细胞出现。（2）初期发育的叶表皮细胞进行不对称分裂,生成相互交替的长、短细胞,有的短表皮细胞横（垂直叶脉）分裂,形成栓质细胞和硅质细胞对;栓质细胞基部与叶肉细胞相邻,硅质细胞嵌在栓质细胞和表皮细胞间偏上。（3）有短细胞发生的叶片,宏观背面发亮且覆有蜡质层,微观表皮细胞的着色特性发生了变化;栓质细胞为面包形柱状细胞,硅质细胞为哑铃形扁细胞。（4）气孔器张开时,栓质细胞中没有K⁺和H₂O₂的积累;气孔器关闭时,栓质细胞中积累了大量的K⁺和H₂O₂,且栓质细胞中K⁺和H₂O₂的积累始终与副卫细胞中K⁺和H₂O₂的积累变化一致,而硅质细胞和长细胞没有K⁺和H₂O₂的积累。该研究确定了玉米叶表皮短细胞发生的时期;展示了其发育过程的形态学变化特征;发现栓质细胞中K⁺和H₂O₂的积累随气孔器开关呈周期性变化,且与副卫细胞中K⁺和H₂O₂的积累变化保持一致。     

胞外ATP对AlCl3诱导的细胞死亡过程中胞内H2O2和Ca2+水平的影响及其生理机制分析

该实验以烟草悬浮细胞 BY 2 为材料,在烟草悬浮细胞中分别加入0.05、0.10、0.15、0.20 mmol·L^-1AlCl₃,以等体积去离子水处理的悬浮细胞液为对照,并依据前述实验结果选择0.15 mmol·L^-1 AlCl₃,分别添加5 mmol·L^-1 DMTU(H₂O₂ 抑制剂)、20 μmol·L^-1CaCl₂、15 μmol·L^-1 LaCl₃(Ca²⁺通道抑制剂)和50 μmol·L^-1 ATP设计多项处理,分析胞外ATP(eATP)对铝离子(Al³⁺)胁迫引起的植物细胞死亡及其胞内H₂O₂、Ca²⁺的影响,以揭示Al³⁺胁迫下植物调节细胞死亡的可能机制,进一步扩展对eATP功能的认知。结果显示：(1)随着 AlCl₃ 胁迫浓度的提高,细胞死亡水平和胞内H₂O₂水平上升,而胞内Ca²⁺和eATP水平则逐渐降低。(2)外援施加H₂O₂抑制剂 DMTU(二甲基硫脲)和Ca²⁺能够有效缓解AlCl₃诱导的细胞死亡水平的上升;而Ca²⁺通道抑制剂LaCl₃(三氯化镧)则加剧了AlCl₃胁迫下的细胞死亡。(3)在AlCl₃胁迫下对细胞添加外源ATP,能够缓解AlCl₃胁迫下胞内H₂O₂水平上升和Ca²⁺水平下降的同时,并显著降低AlCl₃胁迫导致的细胞死亡。研究表明, Al³⁺以剂量依赖的模式提升细胞死亡和细胞内H₂O₂的水平并降低胞内Ca²⁺和eATP水平,AlCl₃诱导的细胞死亡受到H₂O₂和Ca²⁺水平变化的调节,eATP可以通过调节H₂O₂与Ca²⁺水平缓解AlCl₃诱导的细胞死亡。推测Al³⁺胁迫可能通过抑制钙离子通道而破坏了细胞内H₂O₂和Ca²⁺之间的协同关系,外源ATP对Al³⁺诱导H₂O₂上升的缓解作用可能是由于其提升了细胞的抗氧化能力。     

豇豆子叶节再生体系建立及Pti4基因遗传转化

为获得豇豆(Vigna unguiculata)遗传转化体系,以‘成豇七号’带1 片子叶的子叶节作为外植体,对其高效再生体系和农杆菌介导抗病基因Pti4 的遗传转化进行了研究。结果表明,豇豆无菌苗、不定芽诱导和不定芽伸长培养的最适培养基分别为MSB₅ + 6-BA 3.0 mg L^-1、MSB₅ + 6-BA 1.0 mg L^-1 + KT 0.06 mg L^-1 和MSB₅ + 6-BA 0.5 mg L^-1 + IBA 0.2 mg L^-1。不定芽在MS 培养基上能迅速诱导生根,获得完整植株。以豇豆子叶节为受体,通过农杆菌介导成功将 Pti4 整合到‘成豇七号’抗性芽基因组中。因此,豇豆高效再生体系的建立为遗传育种研究奠定了基础。     

电击法诱导的欧白英原生质体转化和转化植株再生

本研究使用电击法成功地将带有标记基因NPTⅡ的质粒pCaMVNEO转入欧白英的原生质体,并获得了再生转化植株。通过用pDW2质粒进行的CAT基因短暂表达研究,确定了欧白英原生质体转化的电击条件为：电容30nF、电场强度l 500V／cm、时间衰变常数59．4微秒;质粒DNA浓度为20μg／2×10⁶原生质体。在以上条件下,欧白英原生质体的相对转化率为12．4％,绝对转化率为2.4×10^-4在大多数抗性愈伤组织和从抗性愈伤组织再生的植株中检测到新霉素磷酸转移酶活性。分子杂交结果也证明了在转化植株中存在NPTⅡ基因序列,而未转化的对照植株则没有。     

渗透胁迫和离子毒害对转Bt基因棉幼苗生长及离子分布的影响

研究了渗透和盐胁迫处理对转Bt基因抗虫棉(Gossypium hirsutum) 99B种子的萌发和幼苗生长的影响,以及幼苗不同器官离子吸收和分配的差异。结果表明:渗透和盐胁迫均对转Bt基因抗虫棉幼苗的生长有抑制作用,其中PEG的抑制作用最强,而3种盐的抑制程度以CaCl₂>NaCl>Na₂SO₄,且在Na⁺含量相同时,Cl^-的毒害大于SO₄^2-。渗透胁迫下使根、茎和叶中的Na⁺和Cl^-含量提高,K⁺、Ca²⁺、SO₄^2-含量和K⁺/Na⁺、Ca²⁺/Na⁺和SO₄^2-/Cl^-比值降低,且地上部的变化幅度大于地下部的,其中以PEG的影响最为显著,其次是CaCl₂,Na₂SO₄处理最弱。这些说明,转Bt基因抗虫棉99B的耐盐性较弱。     

电击法介导的紫孢侧耳原生质体转化

使用基因脉冲导入仪成功地将糙皮侧耳DNA导入紫孢侧耳单核原生质体内,获得了具有"锁状联合”特征的双核转化菌株T₁,和T₂。转化率为8．2×10^-5,转化比为3．6％。酯酶同I酶分析结果表明,转化菌株除具有受体菌的酶带外,还存在供体菌的酶带,由此证明转化菌株确为紫孢侧耳和糙皮侧耳DNA重组的产物。转化菌株子实体形态也发生了变化。两菌株子实体均不释放孢子;T₁。菌柄中生,T₂成熟子实体菌盖中部易长出菌丝。     

三氧化二砷诱导早幼粒细胞白血病细胞线粒体基因突变与细胞凋亡

提取用2 μmol/L As2O3对NB4细胞株和APL体外干预及用0.16 mg·kg^-1·天^-1 As2O3静脉输注治疗干预前后的白血病细胞线粒体基因, PCR扩增后直接测序, 干预前后的序列对比分析, 同时流式细胞仪对细胞凋亡率测定. 分析了As₂O₃在体内和体外作用对原代急性早幼粒细胞白血病细胞(APL)和NB4细胞株的线粒体基因(mtDNA)非编码区D-loop的基因突变与细胞凋亡的关系. 研究发现, As₂O₃处理后mtDNA的D-loop区基因突变位点数目较处理前显著增多, mtDNA的D-loop区基因突变率与细胞凋亡率呈正相关关系, 相关系数r_NB4-As2O3=0.973818,r_APL-As2O3 =0.934703. 突变类型包括转换、颠换、插入和缺失. 本实验仅是初步研究, 尚未发现As₂O₃对mtDNA的D-loop区稳定的突变位点和突变规律. 结果显示, As₂O₃体内外干预均能加剧急性早幼粒细胞白血病细胞mtDNA的D-loop区基因突变, 并与其促凋亡作用呈正相关, mtDNA的D-loop区可能是砷剂治疗白血病的一个靶点.