黑曲霉发酵过程中菌体形态的分析方法建立及应用

丝状真菌(Filamentous fungi)的发酵生产通常具有较高的工业应用价值,但其菌体形态是一个区别于其他非丝状菌的一个重要发酵指标。针对目前形态分析的瓶颈,本研究使用琼脂糖凝胶对黑曲霉菌形进行固定,利用平板实现菌球样本的大量制备,并结合图形处理软件自建自动化处理程序,实现了大量准确可靠的菌体形态参数的获得,大大增加了形态数据处理通量及准确度。应用该方法于黑曲霉发酵生产糖化酶过程中不同供氧水平及剪切水平下菌体形态的研究,通过大量形态数据定量阐明了黑曲霉在不同剪切水平下的分区域形态分布特性,为进一步工业过程的形态优化提供了重要的研究方法。     

黑曲霉及其与普洱茶品质关系研究进展

近年来,黑曲霉菌的研究受到了国内外大量学者的重视,并取得了一系列新进展,这些进展主要集中在:黑曲霉的分离鉴定方法;黑曲霉发酵生产多酚氧化酶、果胶酶和纤维素酶等酶类的机理;黑曲霉对普洱茶色泽、滋味和香气的影响等方面。文章集中对近年来黑曲霉及其与普洱茶品质形成相关的研究进展作简要综述,以期为黑曲霉在普洱茶中研究利用提供一定的参考。     

微生物发酵青蒿叶和叶渣的研究

为扩大青蒿原料的应用途径,延伸青蒿产业链,对青蒿叶和叶渣进行发酵研究。拟开发可用于动物保健的青蒿来源的产品。采用微生物发酵青蒿及青蒿叶渣,检测枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌等菌株发酵青蒿叶和叶渣后其粗蛋白、粗脂肪、粗纤维素以及青蒿素、青蒿乙素、双氢青蒿酸、青蒿酸含量变化。青蒿叶发酵产物及功效成分含量与对照组比较,酵母菌发酵后粗蛋白提高43.05%,植物乳杆菌发酵后粗脂肪提高106%,枯草芽孢杆菌发酵后粗纤维降低43.30%,黑曲霉菌发酵后青蒿素和青蒿乙素分别提高133.27%和88.06%,地衣芽孢杆菌发酵后青蒿酸提高21.49%,枯草芽孢杆菌发酵后双氢青蒿酸提高86.01%;青蒿叶渣发酵产物与对照组比较,植物乳杆菌发酵后粗脂肪提高87.73%,酿酒酵母菌发酵后粗蛋白提高85.30%,枯草芽孢杆菌发酵后粗纤维降低55.67%,枯草芽孢杆菌发酵后双氢青蒿酸提高71.91%,地衣芽孢杆菌发酵后青蒿乙素提高94.71%。微生物发酵青蒿叶和叶渣显著提高其功效成分含量,增加了探索青蒿叶和叶渣发酵产物作为动物保健品的可能性。     

苹果渣基质柠檬酸高产菌株选育

分别以固态苹果渣、苹果渣固态酶解物、苹果渣酶解液和10%葡萄糖溶液为发酵基质研究了17株野生黑曲霉的柠檬酸产生能力,并对获得的4株柠檬酸高产菌进行了诱变育种。结果表明:17株黑曲霉在4种发酵基质中均能良好生长并发酵产生柠檬酸,不同菌株在同一发酵基质中产酸能力间存在差异。FG17、FG23、FG26、FG30等4株菌苹果渣基质柠檬酸产生能力较高,且在4种不同发酵基质中产酸性能稳定。4株菌分别经紫外线和60Co-γ射线诱变后得到的正向突变株柠檬酸产率均显著提高,突变株中FG26-15-4(UV)发酵苹果渣后柠檬酸产率最高,达11.32%,FG23-13-3(γ)发酵苹果渣酶解液后柠檬酸产率最高,达2.73 mg/mL,均高于现有研究报道,可作为不同类型苹果渣基质柠檬酸发酵用菌种。     

黑曲霉柠檬酸工业菌株原生质体制备与转化

黑曲霉是柠檬酸工业化生产的主要发酵菌株。尽管现代遗传操作技术在黑曲霉的实验室菌株、蛋白质生产菌株等的应用中获得了成功,但是柠檬酸工业菌株遗传转化异常困难,成为柠檬酸工业持续升级的重要限制因素。以柠檬酸工业生产实际应用的黑曲霉菌株为研究对象,对其原生质体的制备与再生以及PEG介导的转化等条件进行了细致优化。结果表明,柠檬酸高产工业菌株原生质体的制备需选取丰富培养基中培养48 h的年轻菌丝体,在1.5%裂解酶-0.5%蜗牛酶-0.2%溶菌酶的复合酶解体系下裂解2.5 h,原生质体的制备浓度可达106个/m L以上,原生质体再生效率可达90%以上。原生质体的浓度是原生质体-PEG介导转化方法的关键,当原生质体浓度达到106个/m L以上时,高产柠檬酸菌株的转化效率大幅提高。成功建立了由原生质体-PEG所介导的高产柠檬酸黑曲霉菌株的遗传转化体系。     

建立以TK基因为标记将外源基因导人臭曲霉(Aspergillus foetidus)的选择系统及外源基因的表达

本文报道建立以胸腺嘧啶核苷激酶(TK)为标记,利用痘苗病毒TK基因为旁侧序列的外源基因载体,通过体内同源重组的原理将外源基因导入臭曲霉菌,并用5-溴脱氧尿嘧啶核膏(BudR)进行转化株选择的新系统,对黑曲霉菌TK+株的挑选、转化及选择条件等进行了研究。用这一系统,成功地将臭曲霉菌自身分离到的启动基因H8驱动下的乙肝表面抗原(HB8sAg)基因导入臭曲霉菌。Southern blot和多次孢子传代证实,HBsAg基因已与宿主的DNA稳定整合：在发酵上清液中,ELIAS检测HBsAg为阳性(P/N值在20左右),wwstern blot有特异的带存在,免疫电镜观察发现,在发酵液中存在有与人血清中HBssAg颗粒大小、形态相似的22nm的颗粒。这些结果表明,HBAg基因在臭曲霉菌中已获表达。本文建立的基因导入和选择系统可广泛应用于各种外源基因在臭曲霉菌中表达的研究。     

扭脱甲基杆菌AM1生物加工过程研究进展

甲醇作为重要的一碳化工原料,可由甲烷、合成气和CO_2等转化制得。扭脱甲基杆菌AM1是以甲醇作为唯一碳源和能源来进行生物发酵的微生物。由于原料来源广泛,发酵过程染菌的风险低,且能够利用合成培养基降低生产成本,同时产物后处理简单,扭脱甲基杆菌AM1被广泛利用在生物化工领域。目前,扭脱甲基杆菌AM1以甲醇作为碳源,已经成功实现了工业化生产单细胞蛋白。随着分子生物学技术的发展,扭脱甲基杆菌AM1以甲醇为底物有望合成更多高附加值的产品。本文中,笔者对扭脱甲基杆菌AM1生物加工过程进行综述,希望对甲醇基生物工业有所启发。     

京尼平的微生物转化及其交联特性的测定分析

从土壤中富集筛选获得一株产β-葡萄糖苷酶的菌株,经菌落的形态和18S rDNA鉴定确定为黑曲霉。将筛选出的黑曲霉菌株接种于发酵培养基,利用含有京尼平苷的栀子粉作为底物发酵,通过对发酵条件优化,得到在装液量50/250 mL,栀子粉浓度为10%,转速为180 r/min,发酵时间为96 h时,京尼平的微生物转化率达到最大22%。这种微生物转化法简化了京尼平的生产工艺,大大降低了生产成本。利用微生物转化获得的京尼平交联胶原蛋白材料,研究表明其具有较好的交联特性,是一种在食品、医药等领域都具有应用前景的生物交联剂。     

细胞工厂黑曲霉的系统生物学

丝状真菌黑曲霉被广泛应用于发酵工业,用于生产柠檬酸和各种不同的工业用酶。在进一步开发生产燃料和化学品的生物过程中,黑曲霉是一个有趣的万能细胞工厂,因为它能耐受低pH值,可以利用广泛的碳源,并有相对较高的转化率。在将黑曲霉作为一般细胞工厂平台进行发展方面．已经拥有了一批系统生物学技术,     

微生物发酵牛血生产蛋白饲料的研究

旨在研究微生物发酵新鲜牛血液前、后的营养成分变化规律,评估其能否作为蛋白饲料,为牛血资源的综合利用提供参考。利用酵母菌、黑曲霉菌和米曲霉菌等比例混合发酵新鲜牛血并测定发酵前、后的水分、粗蛋白、真蛋白、小肽等含量。结果表明:1)发酵后,粗蛋白增至53.81%DM,比发酵前提高了36.50%;2)真蛋白增至36.50%DM,比发酵前提高了55.92%;3)小肽占真蛋白的比例增至44.97%,比发酵前提高了115.08%。实验结果说明,微生物发酵新鲜牛血可以改善牛血营养成分的组成模式,能有效地将大分子蛋白质降解为小分子蛋白(小肽),对开发易于动物吸收利用的蛋白饲料具有重要意义。     

An artificial intelligence tool for bioprocess monitoring: application to continuous production of gluconic acid by immobilized Aspergillus niger

Experimental data on continuous fermentation of sucrose and glucose solution at low pH to gluconic acid by Asprgillus niger immobilized on cellulose fabric show complex dynamic behaviour including a decline in yield. The data have been analyzed using an artificial intelligence based symbolic regression technique to provide a mathematical model for predicting values of conversion 5, 10 and 15 h ahead values of conversion. These predictions can be used during continuous operations to monitor the bioprocess and adjust the residence time of fermentation to get complete and more efficient conversion of sucrose or glucose to gluconic acid.     

新一代糖化酶高产菌株的选育及其工业应用

【目的】建立对糖化酶生产菌种黑曲霉随机突变文库进行筛选的方法,以获得糖化酶酶活提高的突变菌株。【方法】以一株可产糖化酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger X1为出发菌株,经硫酸二乙酯诱变获得突变文库,采用葡萄糖的结构类似物——2-脱氧葡萄糖进行筛选,并在筛选过程中逐渐提高2-脱氧葡萄糖浓度,定向选育具有2-脱氧葡萄糖抗性、高产糖化酶的突变株。【结果】获得的高产突变菌株DG36摇瓶发酵糖化酶产量比出发菌株A.niger X1提高22.2%–33.8%,经工业水平50 m~3罐发酵测试,突变株DG36发酵128 h糖化酶活可达49094 U/m L,在相同发酵时间内,其酶活较出发菌株A.niger X1提高32.8%,发酵时间缩短16.9%。【结论】本研究开发了一种以2-脱氧葡萄糖为抗性标记选育高产糖化酶突变株的方法,所得突变株DG36遗传性状稳定,与出发菌相比具有菌丝粗壮、产酶期提前、糖化酶活高、发酵时间短、有利于发酵后处理的优点。     

Biosorption of zinc by fungal mycelial wastes

Summary Waste mycelia from several industrial fermentation plants (Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Claviceps paspali) were used as a biosorbent for zinc ions from aqueous environments, both batchwise as well as in a column mode. With all mycelia testes, biosorption per biomass dry weight was a function of pH (increasing with increasing pH between 1.0 and 9.0), biomass concentration (decreasing at high biomass concentrations) and the zinc concentration. Under optimized conditions, A. niger and C. paspali were superior to P. chrysogenum. Treatment of A. niger biomass with NaOH further increased its biosorbent capacity. Desorption of biosorbed zinc was achieved by elution with 0.1 m HCl, best results being obtained with NaOH-treated A. niger. Such treatment did not affect the capacity for biosorption in repeated experiments. NaOH-treated A. niger mycelia were also successfully used in removal of zinc from polluted waters in Austria, thereby showing that the simultaneous presence of other naturally occurring ions does not affect biosorption. Offprint requests to: C. P. Kubicek     

Formation of cellulases by co-culturing ofTrichoderma reesei andAspergillus niger on cellulosic waste

A cellulase system possessing high hydrolytic and -glucosidase activity was obtained by co-culturingTrichoderma reesei andAspergillus niger by a new approach using semi-solid fermentation of lignocellulosic materials. Various types of pretreatments were used for making the cellulose easily accessible to enzymatic attack. The optimal water content for maximum activity of the mixed fermentation was investigated. A more concentrated enzyme preparation could be obtained by semi-solid state fermentation than by conventional submerged fermentation.     

一种高效无选择标记的黑曲霉基因组编辑方法

黑曲霉(Aspergillus niger)是一种重要的工业生产菌株,被广泛地应用于生产酶制剂和有机酸,但仍需要进行基因组改造提高它的应用潜力。CRISPR/Cas9技术是一种被广泛采用的黑曲霉基因组编辑技术,但由于需要在基因组中整合选择标记或基因编辑效率还有待提高,影响了其在工业菌株改造中的应用。本研究建立了一种基于CRISPR/Cas9技术的高效无选择标记的基因编辑方法。首先,利用5S rRNA启动子启动sgRNA的表达,构建了一个含有AMA1(autonomously maintained in Aspergillus)复制起始片段的sgRNA和Cas9共表达质粒;同时通过敲除kusA基因构建非同源末端连接(non-homologous end joining pathway,NHEJ)修复缺陷的高效同源重组菌株;最后利用含有AMA1片段质粒的不稳定性,通过无抗平板传代丢失含有sgRNA和Cas9共表达质粒。利用该方法,在采用同源臂长度仅为20bp的无选择标记供体DNA进行基因编辑时,基因编辑效率可达到100%。该方法为黑曲霉基因功能的研究和细胞工厂的构建奠定了基础。     

Enhanced solid‐state citric acid bio‐production using apple pomace waste through surface response methodology

Aims: To evaluate the potential of apple pomace (AP) supplemented with rice husk for hyper citric acid production through solid‐state fermentation by Aspergillus niger NRRL‐567. Optimization of two key parameters, such as moisture content and inducer (ethanol and methanol) concentration was carried out by response surface methodology. Methods and Results: In this study, the effect of two crucial process parameters for solid‐state citric acid fermentation by A. niger using AP waste supplemented with rice husk were thoroughly investigated in Erlenmeyer flasks through response surface methodology. Moisture and methanol had significant positive effect on citric acid production by A. niger grown on AP (P < 0·05). Higher values of citric acid on AP by A. niger (342·41 g kg^?1 and 248·42 g kg^?1 dry substrate) were obtained with 75% (v/w) moisture along with two inducers [3% (v/w) methanol and 3% (v/w) ethanol] with fermentation efficiency of 93·90% and 66·42%, respectively depending upon the total carbon utilized after 144 h of incubation period. With the same optimized parameters, conventional tray fermentation was conducted. The citric acid concentration of 187·96 g kg^?1 dry substrate with 3% (v/w) ethanol and 303·34 g kg^?1 dry substrate with 3% (v/w) methanol were achieved representing fermentation efficiency of 50·80% and 82·89% in tray fermentation depending upon carbon utilization after 120 h of incubation period. Conclusions: Apple pomace proved to be the promising substrate for the hyper production of citric acid through solid‐state tray fermentation, which is an economical technique and does not require any sophisticated instrumentation. Significance and Impact of the Study: The study established that the utilization of agro‐industrial wastes have positive repercussions on the economy and will help to meet the increasing demands of citric acid and moreover will help to alleviate the environmental problems resulting from the disposal of agro‐industrial wastes.     

Biochemical studies of citric acid production and accumulation by Aspergillus niger mutants

The biochemical rationale for the inhibition of citric acid fermentation by Aspergillus niger in the presence of Mn²⁺ ions has been investigated using high citric acid-yielding, Mn²⁺ ion-sensitive as well as Mn²⁺ ion-tolerant mutant strains of A. niger. In the presence of Mn²⁺ (1.5 mg/l), citric acid production by the Mn²⁺ ion-sensitive strain (KCU 520) was reduced by about 75% with no apparent effect on citric acid yield by the Mn²⁺ ion-tolerant mutant strain (GS-III) of A. niger. The significantly increased level of the Mn²⁺ ion-requiring NADP⁺-isocitrate dehydrogenase activity in KCU 520 cells and the lack of effect on the activity level of the enzyme in GS-III mutant cells by Mn²⁺ ions during fermentation seem to be responsible for the Mn²⁺ ion inhibition of citric acid production by the KCU 520 strain and the high citric acid yield by the mutant strain GS-III of A. niger even in the presence of Mn²⁺.     

基于DNA高通量测序分析生料酿醋过程中的真菌多样性

【目的】了解生料酿醋不同阶段的真菌群落结构及其变化规律,为生料酿醋工艺优化提供理论指导。【方法】从山西一家生料酿醋企业采集原料、麸曲、发酵缸醋醅、熏醋样、淋醋样等涉及生料酿醋各阶段的样品共51份,扩增真菌ITS1区序列并利用高通量测序技术分析真菌多样性。【结果】除5份样品未扩增成功外,在剩余46份样品中共检测到489个真菌OTU,以子囊菌为主(占88.3%)。原料、麸曲、发酵缸醋醅、熏醋样、淋醋样等不同组别间在真菌群落结构方面存在显著差异。原料和麸曲中的真菌物种丰富度最低,发酵缸醋醅的真菌物种丰富度最高,熏醋样和淋醋样中的真菌物种丰富度又有所降低。原料和麸曲中的优势真菌分别为酿酒酵母和黑曲霉,是发酵阶段真菌的重要来源,但发酵缸醋醅中也检测到大量可能来源于发酵室环境的真菌。发酵缸醋醅在不同发酵时期间也存在明显的真菌群落结构差异,并可据此划分成发酵前期(包括发酵第2–13天的样品)和发酵后期(包括发酵第17–46天的样品)。酿酒酵母和亮白曲霉的丰度在发酵前期显著高于发酵后期,而黑曲霉、一种小戴卫霉科真菌等的丰度在发酵后期显著高于发酵前期。【结论】生料酿醋的不同阶段和发酵缸醋醅发酵的不同时期,其真菌群落结构都存在明显差异。酿酒酵母和黑曲霉是发酵阶段的优势真菌。本研究为生料酿醋工艺优化提供了理论依据。     

柚子皮黑曲霉的分离鉴定及产酶特性研究

对柚子皮上自然生长的黑曲霉进行分离鉴定,并探讨其产酶特性。以平板稀释法从柚子皮上分离出一株霉菌菌株,通过观察其形态特征和培养特征,对照《真菌鉴定手册》判定该菌株的种属;采用鉴定培养基法对其产酶特性进行分析。根据柚子皮的成分特性,以干柚子皮为主要原料,该菌为生产菌株,采用固态发酵法探究培养基的成分、柚子皮含量、培养基初始含水量及发酵时间4个因素对纤维素酶活力的影响。结果表明,该菌株为黑曲霉(Aspergillus nige),可产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶;固态发酵培养基中添加柚子皮12g,麸皮0.5 g和(NH_4)_2SO_40.5 g,培养基初始含水量保持在68.5 mL/100 g,培养时间控制在60 h左右时纤维素酶产量较高。     

肺炎克雷伯氏菌利用甘油生产1,3-PDO发酵优化的研究进展

发展可再生能源,尤其是生物能源,具有显著的能量收益和碳减排效益。随着石油等不可再生资源的减少,许多大宗传统石油化工产品正不断被使用可再生原料的生物制造产品替代。生物发酵法生产1,3-丙二醇（1,3-PDO）顺应了这一潮流,具有广阔的发展前景。提高微生物发酵竞争力,优化发酵法生产1,3-PDO水平,势必增加1,3-PDO的生产效益。对肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）发酵法进行1,3-PDO生产的代谢机理、菌株筛选和利用、发酵参数的选择和优化以及发酵工程策略的设计和监测等进行综述,为利用生物柴油副产物甘油生产有重要工业价值的1,3-PDO产品提供参考。