带卫星RNA黄瓜花叶病毒保护接种的植物中病毒积累与基因组RNA合成及病状表达

本文报道了三生烟在接种带卫星RNA的黄瓜花叶病毒(CMV-S52)后,或接种后用强毒CMV攻击,其病状表现、组织中病毒含量,病毒基因组RNA合成与卫星RNA合成的关系.植物在接种CMV-S52后7～10天,所有接种植物都表现出不同程度的轻度花叶症状,此期正是组织内病毒含量最高,而卫星dsRNA占总dsRNA百分比较低时期.接种后不同时间的测定证明,组织内病毒基因组dsRNAl和dsRNA2的合成水平均较低,而卫星dsRNA则始终保持较高的合成水平;到接种后15天病状消失时,卫星dsRNA占总dsRNA合成百分比的84.79％之多. 用CMV-S52保护接种后再用强病毒攻击,植物中的病毒含量、病毒ssRNA合成不增加或稍有增加;而基因组dsRNA和卫星dsRNA合成都有增加,但卫星dsRNA合成仍占绝对优势.保护作用的效果,取决于攻强病毒时已存在于组织内的卫星RNA与基因组RNA合成量的相对比例。讨论了卫星RNA的保护机理。     

黄瓜花叶病毒致弱卫星RNA对辅助病毒含量的影响

为研究黄瓜花叶病毒(CMV)弱病毒株的基因组RNA和卫星RNA的含量变化,将一个卫星RNA介导的CMV弱病毒株NDM-1与CMV强毒株在4种寄主系统上进行对照实验.采用RNA点杂交方法,检测从早期接种病毒到大田释放阶段（病毒接种后5到40天）,寄主植物叶组织中的基因组RNA和卫星RNA的相对含量变化.结果显示：弱病毒株NDM-1基因组RNA和卫星RNA负荷量具有寄主效应和时间效应,趋势一致但程度不同.它们在番茄上的变化规律不同于其他寄主而且病毒的致弱效果最明显：在接种后的5～10天 (生产上接种育苗的保护期) ,基因组RNA和卫星RNA相对含量上升,到40天(大田释放期) 时回落至最低.比较NDM-1于不同时间在各寄主上的卫星RNA和基因组RNA的相对比值：在40天时,寄主番茄上的相对比值达15.8,与在其他寄主上和其他时间段比较均有显著差异,即此时卫星RNA达到含量优势.说明弱病毒NDM-1在番茄上的致弱机制为:卫星RNA的大量复制对CMV基因组RNA产生抑制作用.此弱病毒株在烟草和心叶烟中的变化规律基本一致.     

系统侵染寄主中黄瓜花叶病毒及其卫星RNA的动态变化

以³²P标记的黄瓜花叶病毒（CMV）RNA3 cDNA片段和卫星RNA全长cDNA作为探针,定量测定CMV基因组RNA和卫星RNA的含量变化,结果显示：二者均具有明显的寄主效应和时间效应.在16～20℃条件下,接种不携带卫星RNA的分离物CMV-R3,15天、30天和75天时,CMV基因组RNA负荷量呈显著下降的趋势.在第15天,RNA3的负荷量以烟草>心叶烟>克里夫兰烟>番茄的顺序表现为不同寄主的显著性差异.相同条件下接种携带高拷贝卫星RNA的分离物CMV-RS,在5天和15天之间基因组RNA和卫星RNA负荷量均呈现上升的趋势,同时测得其基因组RNA和卫星的负荷量具有相似的寄主效应和时间效应,但程度不同.第15天时,二者负荷量以烟草＞心叶烟＞番茄的顺序表现寄主效应的显著性差异.在18～21℃条件下,接种携带坏死卫星RNA的CMV强毒株HC4,第5天、第10天和第15天时,基因组RNA和卫星RNA的负荷量均以番茄＞心叶烟＞烟草的顺序表现出显著性差异,并表现出明显的时间效应.不同来源CMV分离物还存在寄主选择性差异.     

表达黄瓜花叶病毒卫星RNA的转基因烟草耐烟草花叶病毒

表达黄瓜花叶病毒(CMV)的卫星RNA的转基因烟草可以抗CMV的侵染.为了决定这些植物对其它病毒,如烟草花叶病毒(CMV)的安全性,我们对这些植物接种CMV.结果发现 卫星RNA可减弱TMV引起的症状,井降低病情指数,然而却对TMV在植物中的积累没有明显影响.这一发现有助于对卫星RNA抗病机制的理解,有助于含卫星RNA的生防制剂及表达病毒卫星RNA的转基因植物的应用.本文在国际上首次报道卫星RNA可减弱非相关病毒引起的症状.1 材料和方法1.1 病毒及植物烟草花叶病毒(TMV),烟草G140种子及枯班三生烟种子均为中国科学院微生物研究所病毒室保存;含黄瓜花叶病毒卫星RNA-R1基因的烟草G140(烟Sat-G140)为中国科学院微生物研究所病毒室培育,所用材料为第三代种子.     

卫星RNA对黄瓜花叶病毒基因组RNA体外合成的影响

卫星ＲＮＡ对黄瓜花叶病毒基因组ＲＮＡ体外合成的影响杨海花,康良仪,赵大健,田波（中国科学院微生物研究所,北京１０００８０）关键词卫星ＲＮＡ,黄瓜花叶病毒,依赖ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶,体外合成利用卫星ＲＮＡ生防制剂控制田间的番茄、青椒、烟草等由黄瓜花叶病...     

两株黄瓜花叶病毒卫星RNA的竞争与共存研究

通过体外转录方法 ,将大小分别为 36 9nt和 385nt的 2个黄瓜花叶病毒 (Cucumbermosaicvirus,CMV)的卫星RNAYi和Yns共同与不含卫星的辅助病毒株CMV_CNa进行假重组 ,接种CMV系统寄主心叶烟。结果表明 :在接种5d的接种叶上同时检测到卫星RNA_Yi和卫星RNA_Yns;在系统叶上 ,接种 5d和 10d亦可同时检测到 2株卫星 ;但接种 15d ,在系统叶组织中只检测到卫星RNA_Yi。再将接种 5d的接种叶扩大接种到几种不同的指示植物后 ,经dsRNA抽提 ,也只获得 1条与卫星RNA_Yi大小相符的条带。通过假重组病毒株中分别获得卫星RNA并测序 ,确定2个卫星RNA的序列没有变化。卫星RNA_Yns和Yi在辅助病毒CMV_CNa作用下 ,表现出明显的竞争性 ,它们在辅助病毒中不能形成稳定的共存关系。     

黄瓜花叶病毒卫星RNA致弱辅助病毒的机理

分析了卫星RNA致弱的黄瓜花叶病毒 (CMV)侵染的烟草叶绿体内的CP浓度与花叶症状的严重程度成正相关 .用番茄不孕病毒 (TAV)接种表达CMV卫星RNA的转基因烟草叶绿体中 ,TAV- CP含量明显比不含卫星RNA的TAV株系侵染的低 ,而在细胞质中TAV -CP含量无差别 .用完整游离叶绿体进行体外跨膜运输试验 ,CMV- CP能快速进入离体叶绿体 ,CP降低叶绿体动力学荧光光谱 .将CMV的CP基因与 1 ,5 二磷酸核酮糖羧化酶小亚基引导肽基因进行体外拼接 .借助农杆菌转化烟草 .转基因烟草表现出黄化、根系发育受抑制 ,产生类似病毒侵染的症状 .     

黄瓜花叶病毒卫星RNA XJs1侵染性cDNA克隆构建及其生物学功能初步研究

利用RT_PCR的方法,获得了黄瓜花叶病毒卫星RNA XJs1的全长侵染性cDNA克隆pMSC20。序列分析显示,XJs1全长384nt(GenBank登录号:DQ070748),比较XJs1与具有代表性的CMV卫星RNA的序列结构表明,在XJs1核苷酸序列的325nt~350nt间,具有典型的坏死型卫星RNA保守序列。通过体外转录,将XJs1与不含卫星RNA的辅助病毒分离物CMV_AH组合接种普通烟和心叶烟并进行检测。初步研究结果表明,XJs1为一致弱卫星RNA。     

含卫星RNA的黄瓜花叶病毒弱株系的分离鉴定及在病毒病防治上的应用

从豌豆上分离获得黄瓜花叶病毒分离物ＣＭＶＰ１,摩擦接种９科２９种植物,ＣＭＶＰｌ在大多数植物上症状很轻或无任何症状,提纯的病毒颗粒为球形,直径约２８ｎｍ,病毒衣壳蛋白亚基分子量约２７．５ｋＤ,所含核酸有五个组份,即ＣＭＶＰ１含有卫星ＲＮＡ。ＣＭＶＰ１接种三生烟后８－１２天内呈轻花叶,此时组织中病毒含量最高,随后症状消失,去除卫星ＲＮＡ能加重ＣＭＶＰ１在番茄上的症状,因而是卫星ＲＮＡ减轻了ＣＭＶＰｌ的病状。当ＣＭＶＰ１保护接种番茄后攻强毒,番茄发病率低,病情轻,保护率达９０％以上,并有一定的刺激生长作用,还能提早开花４天,植株结果数增多,成熟果实的颜色、形态、品质和重量均正常。ＣＭＶＰ１对烟草亦具有很好的保护效果。保护接种的植株能明显减少强毒株侵染,可减少９０％以上。     

黄瓜花叶病毒株系间交叉保护作用与卫星RNA干扰作用的比较研究

用除了卫星RNA和含有卫星RNA的CMV分离物在烟草和甜椒上进行了两组不同设计的温室实验。一组在不同保护接种后,在不同时间攻强毒CMV;另一组在不同保护接种后,在同一时间攻强毒CMV。攻毒后进行寄主症状调查、病情指数统计以及强毒CMV的A蛋白夹层ELISA测定,发现交叉保护和卫星RNA干扰作用在体内都存在,但其作用时间和程度不同。交叉保护在保护接种后10—15d以前明显,15d以后很弱;而卫星RNA干扰作用则很强,尤其在保护接种10d以后保护很完全,并且维持到30d以后。     

黄瓜花叶病毒卫星RNA人工突变体的构建及其侵染性测定

从1个369nt的黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)卫星RNA的cDNA出发,采用DNA改组技术构建人工突变体,经过体外转录,将其与不携带卫星RNA的黄瓜花叶病毒株进行假重组,鉴定突变体的生物活性,结果显示所获得的4个卫星RNA的点突变子MS1、MS5、MS6和MS11中,只有MS11仍然具有复制能力;而其他3个点突变子,尽管均只有1个位点的替换,却不能在辅助病毒作用下复制。序列比较分析发现MS11的突变位点位于卫星RNA变异区内,发生的突变与自发突变一致,其他3个突变子的突变位点发生在卫星RNA的高度保守区。而且通过侵染性试验证实突变子MS11与野生型Yi没有明显的差异。由此可推测卫星RNA序列中的高度保守区与卫星RNA的生物活性密切相关,个别碱基的突变会导致RNA二级结构的改变,进而引起其复制能力或稳定性的完全丧失。     

引起番茄坏死病的黄瓜花叶病毒TN分离物的研究

从南京郊区田间番茄坏死病株中分离出黄瓜花叶病毒ＴＮ分离物,经人工接种１０科３９种植物,能侵染其中的８科２６种,接种番茄,辣椒和普通烟都引起坏死症状。ＴＮ分离物的失毒温度为５０℃,稀释限点５×１０￣（－３）－５×１０￣（－４）,体外存活期１－２天。蚜虫以非持久性方式传毒,经免疫双扩散测定,ＴＮ分离物与黄瓜花叶病毒抗血清呈阳性反应。用差速离心提纯的病毒粒子经电镜观察为廿面体,直径为２８ｎｍ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析病毒外壳蛋白为单一组份,分子量２７５００Ｄ。病毒核酸组份分析发现,该病毒分离物含有ＣＭＶ基因组核酸和一个低分子量的卫星ＲＮＡ。以上结果同已报道的引起番茄坏死的带卫星ＲＮＡ的黄瓜花叶病毒株系一致（Ｋｅａｒｎｅｙ,Ｃ．Ｍ．１９９０;Ｊｏｒｄａ,Ｃ．１９９２）。本文还讨论了该病害的发生和流行。     

表达黄瓜花叶病毒卫星RNA的转基因烟草耐烟草花叶病毒

表达黄瓜花叶病毒(CMV)的卫星RNA的转基因烟草可以抗CMV的侵染.为了决定这些植物对其它病毒,如烟草花叶病毒(CMV)的安全性,我们对这些植物接种CMV.结果发现 卫星RNA可减弱TMV引起的症状,井降低病情指数,然而却对TMV在植物中的积累没有明显影响.这一发现有助于对卫星RNA抗病机制的理解,有助于含卫星RNA的生防制剂及表达病毒卫星RNA的转基因植物的应用.本文在国际上首次报道卫星RNA可减弱非相关病毒引起的症状.1 材料和方法1.1 病毒及植物烟草花叶病毒(TMV),烟草G140种子及枯班三生烟种子均为中国科学院微生物研究所病毒室保存;含黄瓜花叶病毒卫星RNA-R1基因的烟草G140(烟Sat-G140)为中国科学院微生物研究所病毒室培育,所用材料为第三代种子.     

黄瓜花叶病毒坏死型卫星RNA的cDNA克隆和全序列分析

从田间发生坏死病害的番茄病株中分离得到黄瓜花叶病毒TN分离物,经研究证实TN分离物带有1株坏死型卫星RNA(TN-SatRNA).利用已知CMV卫星RNA的两端序列作引物扩增并克隆了TN-SatRNA的cDNA.序列分析显示TN-SatRNA全长为390个核苷酸.比较TN-SatRNA与富有代表性的CMV卫星RNA的结构表明,这几种卫星RNA中具有4个结构同源区(Ⅰ:1～81nt,Ⅱ:216～261nt,Ⅲ:278～338nt;Ⅳ:349～390nt),而在82～215nt的区域几种卫星RNA的结构变化较大.在TN-SatRNA的3’端具有已报道的坏死型卫星RNA特征性序列结构.经3’RACE方法确定TN-SatRNA的3’端自然序列,与PCR扩增引物有1个核苷酸的差别.     

黄瓜花叶病毒基因组不同部分及卫星RNA介导的对植株的保护及其作用机理

根据病原物介导的对自身抗性的理论,大量开展了将CMV基因组的单个或多个片断转入植物体内的研究,从而使该植株能够抵抗或延迟受CMV的侵染,CP,RP,MP基因是CMV基因组的重要组成部分,用来转化植株取得了不同程度的抗性效果,另外有些CMV株中存在着起致弱作用的卫星RNA,直接对植株接种含卫星RNA的CMV弱毒或用卫星RNA的cDNA转化植株都会减轻CMV强毒对该植株的侵害,CMV基因组不同组分进入植物体内后,它们对植株产生保护作用的机理不同,文中分别加以阐述。     

黄瓜花叶病毒卫星RNA生防制剂在烟草上的防病作用

用人工组装的黄瓜花叶病毒卫星RNA生防制剂在烟草生产品种进行了田间保护试验。由于使用了生防制剂,经处理的烟草发病率降低84.9～86.4％,同时比对照早熟5天,上等烟比率增加151.3～173.5％,平均每亩收入增加43.3～65.7％。另外发现生防制剂能增强烟草对真菌病害的抵抗作用。     

卫星RNA研究新进展：结构与功能表达

植物病毒卫星通常是指那些如果没有特定辅助病毒的帮助就不能复制,而它本身对于辅助病毒的复制是不必需的,且与辅助病毒的基因组无序列同源性的一类RNA分子。到目前为止,已报道有六组共26种植物病毒带有卫星。这些植物病毒卫星有的具有编码自身外壳蛋白的遗传信息,称卫星病毒;有的无此编码功能称为病毒卫星RNA。病毒卫星RNA在其发现的早期,其生物学功能尚不为人重视。然而,七十年代早期,在法国阿尔萨斯爆发的由黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus,CMV)侵染引起的番茄作物坏死病被确定与CMV卫星RNA有关,至此,关于卫星RNA的生物     

在系统侵染的烟草中假重组体病毒FMF的时序变化

构建了由黄瓜花叶病毒Fny株系RNA1、RNA3与M株系RNA2组合得到的假重组体病毒FMF,并用其侵染烟草幼苗,接种5 d后烟草幼叶上出现坏死环斑,接种5-30 d新生叶上没有呈现任何明显症状;30 d后新生叶上突然出现轻微绿斑驳。采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,监测不同时期展开的幼叶中病毒粒子含量和病毒基因组RNA含量的动态变化,结果显示,接种后5-25 d新生叶中病毒粒子含量保持较低水平,30 d时含量突然大幅度增长;接种后5-30 d新生叶中病毒基因组RNA1、RNA3和RNA4含量均经历骤减期和增长期;RNA2含量变化情况平缓,没有明显先减后增的趋势。病毒粒子、病毒基因组RNA含量及病症严重程度的动态变化规律及其相关性将为研究FMF侵染机制、病毒与寄主互作及病毒防控提供依据。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物全基因组序列测定

以感病组织总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增并测定黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)辽宁分离物(CGMMV-LN)的基因组全序列。CGMMV-LN基因组全长6 422 nt,5'非编码区(noncoding region,NCR)和3'NCR分别为59 nt和175 nt。CGMMV-LN编码的4个蛋白依次是186 kD和129kD的复制酶,29 kD的移动蛋白和17.4 kD的外壳蛋白。CGMMV-LN与其他4个CGMMV分离物基因组核苷酸序列同源性为97.6%～99.3%,与同属其他3种病毒基因组核苷酸序列同源性仅为61.7%～62.8%。基于186kD复制酶和外壳蛋白氨基酸序列的同源树显示:侵染葫芦科作物的烟草花叶病毒属病毒可分为2个亚组,亚组I包括所有CGMMV分离物,亚组II包括Kyuri绿斑驳花叶病毒(Kyuri green mottle mosaic virus,KGMMV)、黄瓜果实斑驳花叶病毒(Cucumber fruit mottle mosaic virus,CFMMV)和小西葫芦绿斑驳花叶病毒(Zucchini ...     

不同CMV分离物侵染寄主的超微结构变化

应用电镜观察了黄瓜花叶病毒CMV不同分离物侵染寄主的细胞 超微结构变化。来自一串红(Salvia splendens)的不含卫星RNA分离物M-22侵染心叶烟,病毒粒子散布于细胞质,在液泡中形成大片病毒粒子结晶,液泡膜边缘产生小泡结构,完整的病毒粒子穿过胞间连丝在细胞间运转,胞间连丝中央部分有扩张现象。自然感染三生烟的含坏死卫星RNA分离物8-S1侵染普通烟,病毒粒子分散于细胞质,在液泡中未观察到结晶体,叶绿体产生囊泡结构,部分病毒粒子处在叶绿体空泡中。田间寄主上受8-S1侵染的三生烟细胞质中分布着大量球形病毒粒子,叶绿体也产生含有病毒粒子的囊泡结构。表明含有卫星RNA和不含卫星RNA的CMV分离物引起的细胞病变特征存在差别,可能是CMV卫星RNA参与病理变化的依据之一。