重组GM-CSF/IL-3融合蛋白表达菌发酵研究

基因工程菌的发酵技术是基因工程药物大规模生产所必备的关键技术,本文对于重组ＧＭ－ＣＤＦ／ＩＬ－３融合蛋白表达菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＦｕ）的生长及产物表达规律进行了探索,在此基础上进行高密度发酵研究,真体最终发酵密度达ＯＤ６００值６０以上,目的产物占菌体总蛋白２５％以上。     

重组大肠杆菌高密度、高表达研究进展

高密度发酵因其节约、高效等诸多优点而成为近年来发酵工业重要的研究热点之一。要实现重组大肠杆菌高密度发酵,不仅要考虑工程菌自身的表达性能,还必须兼顾能促进基因工程菌生长和产物表达的最适培养条件,包括较佳的培养基组成、适宜的补料策略、培养温度、pH值、溶解氧等。该文就影响大肠杆菌高密度发酵的影响因子、工艺条件等进行综述,并探讨了大肠杆菌高密度发酵的工艺改进方向。     

重组大肠杆菌高密度培养研究进展

大肠杆菌是基因工程中常用的宿主菌,许多有价值的多肽和蛋白在大肠杆菌中已成功地进行了表达,表达水平有些高达细胞总蛋白的３０％以上,为了提高单位体积设备产物的产量,除了提高表达水平外,还需提高重组大肠杆菌的培养密度。大肠杆菌高密度培养的早期工作主要是以宿主菌为模型进行研究的,而近年来,重组大肠杆菌高密度高表达的研究已经有了较大进展。本文着重综述了培养基成分、溶氧、比生长速率和代谢副产物乙酸等因素对工程菌生长和表达的影响,及提高菌密度和表达水平的培养方法。     

基因工程菌高密度发酵工艺研究进展

阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术。通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响。     

生技霉素稳定型基因工程菌的构建

运用同源重组技术将异戊酰基转移酶基因整合至螺旋霉素产生菌（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓＦ２１）的染色体上,构建了稳定的生技霉素基因工程菌。在不加压的情况下传代,菌种携带选择性遗传标记情况、生长、发酵效价及发酵产物的ＴＬＣ分析均表明此基因工程菌有较好的遗传稳定性,且发酵效价及产物的组分均得到改善。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明外源基因在螺旋霉素产生菌染色体上的整合情况。     

重组大肠杆菌高密度发酵研究进展

重组大肠杆菌的高密度发酵是提高基因工程产品产量的一个非常有铲的手段,是现代发酵工程研究的一个热点。本文就高密度发酵中影响重组大肠杆菌发酵产率的几个因素,包括宿主菌、培养基、培养条件、补料方法以及高密度发酵过程中存在的问题和对策加以讨论,着重探讨了高密度下大肠杆菌产生的有害代副产物－－乙酸的产生机制、抑制作用机理,以及控制乙酸机累的技术方法。     

Vgb在大肠埃希菌中表达及生物活性的研究

目的将vgb克隆到大肠埃希菌表达载体pQE-30中,研究vgb表达产物对细胞摄氧能力的影响。方法利用PCR和基因重组技术克隆vgb与大肠埃希菌表达质粒pQE V,大肠埃希菌转化采用CaCl2法,VHb活性分析采用CO示差光谱法。结果克隆了vgb和重组质粒pQE V,vgb基因在大肠埃希菌中获得表达,在A420 nm处达到典型吸收峰。结论 vgb在大肠埃希菌中表达产物加强了对氧的摄取能力,对解决细胞高密度发酵培养中氧需矛盾、促进代谢产物的产率具有非常重要的应用价值。     

重组大肠杆菌高表达高密度发酵研究

大肠杆菌高密度高表达发酵技术是现代发酵工程的重要研究课题,此项技术可以有效地提高大肠杆菌的产量和外源重组蛋白的表达量,该文就影响大肠杆菌高密度发酵的主要因素如宿主菌类型、培养基组成、培养条件、生长抑制物质、补料调控等进行了阐述和讨论。     

重组大肠杆菌高密度发酵研究进展

重组大肠杆菌的高密度发酵是提高基因工程产品产量的一个非常有效的手段,是现代发酵工程研究的一个热点。本文就高密度发酵中影响重组大肠杆菌发酵产率的几个因素,包括宿主菌、培养基、培养条件、补料方法以及高密度发酵过程中存在的问题和对策加以讨论,着重探讨了高密度下大肠杆菌产生的有害代谢副产物———乙酸的产生机制、抑制作用机理,以及控制乙酸积累的技术方法 。     

培养条件对重组大肠杆菌生长及外源基因表达的影响

重组DNA技术发展至今,已有许多外源基因在大肠杆菌中获得表达,其中一些产品已投放市场。这些产品所以能进行大量生产在很大程度上得益于发酵培养技术的完善。本文综述培养基、温度、pH、溶氧、比生长速率等对重组大肠杆菌生长、外源基因表达及产物存在形式的影响,并探讨了提高表达水平的途径。     

基因工程菌生产重组人组织因子的发酵研究

根据表达重组人组织因子基因工程菌的自身特点,在30L发酵罐上,通过控制发酵pH、葡萄糖浓度、诱导物磷酸浓度、搅拌速度及采用分批补料等方法,对重组人组织因子基因工程菌高密度发酵和高效表达的条件进行了研究。实验结果表明:诱导物终浓度低于0.1mmol/L,菌体密度OD60014,发酵周期10.5h,基因工程菌批发酵平均产量为37.41g/L,重组人组织因子表达量为6.56 mg/L。关键词:基因工程菌;高密度发酵;组织因子     

重组大肠杆菌高密度培养

重组大肠杆菌的高密度培养是增加单位时间,体积重组蛋白产率的最有效途径之一。如何在获得高密度的同时取得较高的单位时间／体积目的蛋白产率,是高密度培养（过程中亟待解决的问题,这与所选用的菌体、构建的表达系统、发酵时pH、溶氧、培养基成分及培养温度、质粒稳定性、代谢副产物的限制及时比生长速率的控制等因素有关。试从这些方面加以综述,分析这些条件对重组蛋白生产的影响,介绍大肠杆菌高密度培养领域的一些研究进展。     

两次诱导实现重组大肠杆菌高密度、高表达研究

通过不同温度诱导模式对大肠杆菌高密度,高表达的研究,确定两次升温诱导模式实现大肠杆菌高密度、高表达重组人载脂蛋白的目的。实验证实两次诱导成功的避免了乙酸对高密度、高表达的影响,最终发酵的细胞密度OD600达150,蛋白表达量4.8g·L-1,证明两次升温诱导的发酵方法在高密度、高表达外源蛋白上是成功的,从而为基因工程菌规模化生产奠定了基础。     

共表达伴侣蛋白对重组毕赤酵母产米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶发酵过程的影响

[目的]通过共表达伴侣蛋白Erolp和PDI获得米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达.[方法]利用毕赤酵母基因重组菌高密度发酵的方法,在7L发酵罐水平上分析共表达伴侣蛋白菌株(BH128)与非共表达伴侣蛋白菌株(H238)对脂肪酶表达的差异.[结果]在相同条件下,BH128发酵产酶能力高于H238,最高酶活可达到2 338.7U/mL,最大比生长速率达到0.02 h-1,最大产物比形成速率达到944.5 U/(gDCW·h),最大底物比消耗速率也能达到0.15 gmethanol/(gDCW·h),分别是H238的1.7、0.5、4.1和1.3倍,且发酵周期缩短了20h.[结论]毕赤酵母基因重组菌BH128通过共表达伴侣蛋白Ero1p和PDI,提高了米根霉脂肪酶的产量,而且缩短了发酵周期,为工业化生产奠定了基础.     

高密度发酵重组大肠杆菌产海藻糖合成酶

酶法催化是目前生产海藻糖的主要手段。本文中,笔者通过高密度发酵重组大肠杆菌产海藻糖合成酶,进而以麦芽糖为底物,催化生产海藻糖。首先根据大肠杆菌高密度发酵条件要求,在揺瓶中对基因工程菌进行了培养基、发酵条件和诱导条件的逐一优化;然后在5 L和50 L发酵罐中进行批次补料发酵的放大实验;最后采用变指数-恒pH法的策略发酵重组大肠杆菌,结果OD_(600)达到97,海藻糖合成酶酶活达到(24 000±350) U/mL,实现了海藻糖合成酶的重组大肠杆菌高密度发酵生产,极大提高了海藻糖的生产效率。     

重组大肠杆菌YK537/pSB┐TK高密度培养过程中有机酸的RP┐HPLC快速分析

采用高压液相色谱法（ＨＰＬＣ）,利用Ｃ１８反相柱快速检测重组大肠杆菌ＹＫ５３７／ｐＳＢ－ＴＫ高密度发酵过程中细菌代谢产生的各种有机酸。分析表明,经乙醚和水两次萃取处理后能去除样品中大部分的干扰峰,可获得理想的分离效果,并能定量测出发酵过程中各种有机酸的积累。不同培养方式的结果表明用甘油代替葡萄糖作为细菌生长的碳源可减少乙酸的积累,降低其对细菌生长和外源蛋白表达的抑制作用,从而更易实现重组大肠杆菌的高表达、高密度培养。     

重组毕赤酵母高密度发酵表达H5N1禽流感病毒糖蛋白

在10L发酵罐中,对高致病性禽流感病毒H5N1糖蛋白HA1在重组毕赤酵母中的表达发酵工艺进行了研究。通过分批补料培养方法探讨不同培养温度、诱导温度、补料方式、微量元素等因素对菌体的生长以及重组蛋白表达和活性的影响。结果表明,菌种培养和诱导温度均为25oC时,菌体的生长、分泌表达量和与广谱中和抗体的反应活性较好;微量元素是影响重组HA1蛋白生物活性的重要因素;通过优化高密度发酵工艺,H5N1病毒糖蛋白HA1在发酵罐中的表达量比摇瓶培养提高10.5倍,达到约120mg/L,为大规模制备高致病性禽流感病毒的HA1蛋白奠定了基础。     

同时利用AOX1和GAP启动子表达SAM合成酶促进重组毕赤酵母中S-腺苷甲硫氨酸积累

利用重组毕赤酵母(Richia pastoris)强化表达S-腺苷甲硫氨酸(S-adenvylmethionine,SAM)合成酶(SAM synthetase,SAMS),发酵生产SAM时,胞内SAMS活性和ATP水平是影响SAM合成的重要因素.为了同时保持较高的SAMS活性和ATP供应,我们构建了一株既含有AOX1诱导型表达单元,又含有GAP组成型表达单元的双SAMS表达单元P.pastoris重组菌株Gd.它既能受甲醇调控表达SAMS,又能以甘油为碳源表达SAMS.在培养过程中,先是以甲醇诱导SAMS表达,得到较高的酶活,然后在发酵中后期再将碳源换为甘油.这样不但可以维持较高的酶活,而且可以提高胞内ATP含量.实验结果显示,对于同时利用AOX1和GAP启动子表达SAMS的重组菌,可采取甲醇和甘油两阶段补料,该重组菌的SAMS比产率高于组成型重组茵Xg,Gd进入甘油补料期后胞内ATP含量高于诱导型重组菌Ga.双表达单元菌株Gd的SAM产量达到1.41 g/L,比诱导型表达SAMS的重组菌株提高了76.3%,比组成型表达SAMS的重组菌株提高了60.2%,.     

两次诱导实现重组大肠杆菌高密度、高表达研究*

通过不同温度诱导模式对大肠杆菌高密度,高表达的研究,确定两次升温诱导模式实现大肠杆菌高密度、高表达重组人载脂蛋白的目的。实验证实两次诱导成功的避免了乙酸对高密度、高表达的影响,最终发酵的细胞密度OD₆₀₀达150,蛋白表达量4.8g·L^-1,证明两次升温诱导的发酵方法在高密度、高表达外源蛋白上是成功的,从而为基因工程菌规模化生产奠定了基础。     

中性内切型纤维素酶在毕赤酵母中高水平表达的研究

中性内切型纤维素酶在纺织及造纸工业具有重要的应用,为了进一步提高从我国草菇中克隆的一种新的中性内切型纤维素酶(EG1)在Pichiapastoris中的表达水平,我们进行了提高基因拷贝数及高密度发酵等多种手段实现其高水平表达的研究。在前期研究的基础上,利用对已整合eg1的重组子再转化的方法,从含有2000μgLZeocin的YPDSZ平板上筛选到高抗Zeocin转化子,在摇瓶培养条件下,该转化子表达量比原来提高了3.8倍,在pH4～8条件下均有稳定表达,接种量(OD600=5.0)表达水平最好,提高甲醇的诱导浓度对表达有显著的促进作用。用3.2L发酵罐进行了高密度发酵,甲醇诱导95.5h后达到最高值,比摇瓶培养再提高了6.4倍,因此利用高抗Zeocin转化子及高密度发酵的手段,使EG1的表达水平提高了34倍,蛋白表达量达8.80mgmL,EG1酶活达到543.36IUmL,实现了中性内切纤维素酶的高水平表达,本研究将大大促进建立我国纺织用纤维素酶大规模高效生产技术。