干细胞因子逆转录病毒表达载体的构建及体外性质研究

目的通过逆转录病毒介导两种类型人干细胞因子在NIH3T3细胞中稳定表达,并研究它们对白血病细胞的作用。方法用DNA重组技术构建并鉴定可溶型及膜结合型干细胞因子的重组逆转录病毒表达载体MSCV—PGK—GFP—sSCF、MSCV—PGK—GFP—mSCF,与空载体对照MSCV—PGK—GFP分别转染Phoenix细胞包装病毒,并感染NIH3T3细胞,流式分选术获得3种阳性细胞,CCK8法分别检测与其共培养的K562细胞的增殖情况。结果成功构建了sSCF、mSCF逆转录病毒表达载体;经Phoenix包装的重组及对照逆转录病毒成功感染NIH3T3细胞,获得了稳定表达细胞株NIH3T3-S、NIH3T3-M和对照细胞株NIH3T3-V。共培养中NIH3T3-S、NIH3T3-M均可促进K562细胞的增殖,且在低血清条件下,NIH3T3-M的作用高于NIH3T3-S。结论可溶性及膜结合SCF分别通过旁分泌和并置性作用促进白血病细胞的增殖。     

人源μ型阿片受体的cDNA克隆及转染CHO细胞的活性分析

μ型阿片受体是阿片类药物镇痛与成瘾的分子基础。从人脑组织总RNA通过RTPCR扩增获得μ型阿片受体的cDNA,将其克隆至pcDNA31(+)中,用酶切鉴定正确的重组质粒转染CHO细胞。筛选的单克隆细胞株,检测阳性的细胞克隆表达的μ型阿片受体介导胞内信号转导的能力。通过与激动剂和拮抗剂的信号转导分析证实,阳性的细胞克隆表达的μ型阿片受体与天然的μ型阿片受体具有基本一致的生物学特性,因此可以用来作为高效镇痛低成瘾药物筛选平台的候选细胞株。     

可溶性人 SCF 在大肠杆菌中高效表达

干细胞因子(SCF)是一种参与机体生长发育过程中多种细胞生长调控的多功能细胞因子,该因子是 c-kit 原癌基因编码受体的配体,主要由基质细胞产生.研究发现 SCF 在机体内以两种形式存在,一种是表达于细胞膜表面的膜型 SCF,另一种为分泌至细胞外的可溶性SCF,后者相当于膜型 SCF 的膜外活性区域,由164—165个氨基酸(aa)组成,目前国外用于研究的重组 SCF 产品主要指在大肠杆菌或真核系统中表达的分泌型 SCF,此研究首次在国内报道在大肠杆菌中表达这种类型的重组人 SCF.     

人源μ型阿片受体与激动剂慢性作用介导的cAMP上调作用研究

μ型阿片受体是阿片类药物镇痛与成瘾的分子基础。从人脑组织总RNA通过RT-PCR法扩增获得μ型阿片受体的cDNA,将其克隆至pcDNA3．1( )中,转染CHO细胞后筛选单克隆细胞株,检测重组细胞株表达的μ型阿片受体与激动剂慢性作用介导的胞内信号转导能力。通过激动剂慢性作用信号转导分析证实,DAMGO能够明显抑制吗啡慢性给药引起的重组细胞株胞内cAMP水平的上调作用,初步揭示了阿片受体与特异性配体相互作用的信号转导机制。     

URI基因稳定表达对肝癌SMMC-7721细胞增殖能力的影响

目的:瞬转以及筛选出能够稳定表达URI(RPB5-mediating protein)基因的SMMC-7721细胞株,以其为模型研究URI基因对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响.方法:首先,抽提URI的重组质粒并转染到SMMC-7721细胞中,在G418药物的筛选下选出能够稳定表达URI基因的细胞株,RT-PCR法和酶切检测该稳定细胞中URI基因的表达效率以确认URI是否稳定表达,MTT法和克隆形成实验检测URI基因对SMMC-7721细胞增殖的影响.结果:成功建立URI基因过表达的稳定细胞株.与SMMC-7721细胞对照组比较,其URI mRNA表达水平显著上调,能稳定表达URI细胞株的增殖,克隆形成率明显升高.结论:pFLAG-CMV-4-URI重组质粒能使URI在肝癌SMMC-7721细胞内稳定表达,过表达URI基因有可能帮助细胞通过G2/M期检验点来提高肝癌细胞SMMC-7721的增殖能力.     

增龄引起复制性衰老细胞胞内钙信号转导的变化

为了观察血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )引起复制性衰老细胞胞内游离钙的变化以及衰老对其的影响 ,初步阐明衰老引起胞内游离钙变化的机制 .选用人胚肺二倍体成纤维细胞WI 38细胞株 ,利用逆转录PCR(RT PCR)技术及Northern杂交技术检测衰老细胞血管紧张素Ⅱ 1型受体 (AT1R)、血管紧张素Ⅱ 2型受体 (AT2R)mRNA水平的表达 ;利用激光共聚焦显微成像技术 (LSCM )观察WI 38细胞在AngⅡ刺激 ,Valsartan阻断条件下细胞内钙离子荧光强度的改变 .AngⅡ通过AT1受体介导增加WI 38细胞内游离钙的水平 ,并随着WI 38细胞传代增加至衰老状态 ,AT2受体高表达 ,AT1受体介导的钙离子信号转导的活性逐渐降低 .提示WI 38细胞衰老过程中钙离子信号的转导活性降低 ,并且AT1R和AT2R在血管紧张素Ⅱ介导的细胞内钙信号活性中具有不同的作用与机制 .为探讨WI 38衰老细胞内钙信号变化机制提供了实验依据     

SOCS-3过表达对红系基因表达的影响

目的:建立能稳定、高效表达细胞因子信号转导抑制因子-3(SOCS-3)的细胞株SOCS-3-K562,为探讨SOCS-3在造血发育中的作用奠定基础。方法:通过重组慢病毒系统感染人红白血病细胞K562,采用流式细胞分选术,根据绿色荧光蛋白表达情况,获得稳定高表达SOCS-3的K562细胞;利用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹实验,比较分选获得的细胞与对照细胞的SOCS-3表达差异;利用半定量PCR检测SOCS-3表达升高对K562红系发育相关基因GATA-1、β-globin表达水平的影响。结果:构建了人SOCS-3慢病毒表达载体;与对照组相比,通过流式细胞分选获得的K562细胞的SOCS-3基因表达水平升高8.05倍,蛋白表达水平升高3倍;SOCS-3表达升高后,K562细胞的GATA-1、β-globin基因表达受到明显抑制。结论:SOCS-3在造血发育中有重要的调控作用,而对其表达进行改变将在规模化的造血细胞定向诱导研究中发挥重要作用。     

干细胞因子在消化系统肿瘤细胞中的表达及意义

以SGC7901、SW480、HepG2 3种细胞株为研究对象,分析顺铂(CDDP)对干细胞因子(stem cell factor,SCF)基因和蛋白质表达的影响,探讨SCF与消化系统肿瘤的关系.采用MTT方法筛选药物半数抑制浓度,用RT-PCR方法检测SCF mRNA表达量,并用Western Blotting方法检测SCF蛋白质表达水平.结果表明,CDDP可以抑制SCF mRNA在3种细胞株中的表达,差异均有统计学意义(P<0.05).SCF蛋白质在SGC7901细胞实验组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);SW480、HepG2细胞实验组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).因此,SCF在消化系统肿瘤细胞增殖过程中可能起重要作用.     

携带人NFBD1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

建立逆转录病毒介导的NFBD1基因RNA干扰表达体系,并观察其在宫颈癌SiHa细胞中对NFBD1表达的影响.将人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段重组到pSUPER Retro质粒中,构建携带人NFBD1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-NFBD1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株SiHa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用实时荧光定量PCR和Westernblotting检测细胞中NFBD1 mRNA和蛋白表达的变化.重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染SiHa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;实时荧光定量PCR和Westernblotting检测人NFBD1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组.携带人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染SiHa细胞后能明显抑制NFBD1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究NFBD1在宫颈癌中的作用奠定了基础.     

全长及缺失VLDL受体基因转染的CHO细胞与β-VLDL的结合效应

为探讨 VLDL受体结合域中 8个重复序列在结合 VLDL中所起的作用 ,利用构建的全长VLDL受体 c DNA和缺失 5个重复序列的该受体 c DNA重组表达载体分别导入 CHO细胞中 .RT- PCR可检测到外源性 VLDL受体基因的表达 .受体与配体结合研究表明 ,转染全长 VLDLR重组体的 CHO细胞结合β- VLDL的能力明显高于转染 VLDLR缺失重组体的 CHO细胞 ,表明人VLDL受体在 CHO细胞中能有效表达 ,而缺失 5个重复序列的 VLDL受体基本失去了结合β-VLDL的能力     

Effect of adeno-associated virus-mediated transfer of low density lipoprotein receptor gene on treatment of hypercholesterolemia

ＬＤＬＲｐｌａｙｓａｖｉｔａｌｒｏｌｅｉｎｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇｐｌａｓｍａｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ.ＫｎｏｃｋｉｎｇｏｕｔＬＤＬＲｇｅｎｅｃａｎｃａｕｓｅｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ.Ｐｅｒｓｏｎｓｗｉｔｈｆａｍｉｌｉａｌｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ(ＦＨ)ｈａｖｅｂｅｅｎｆｏｕｎｄｔｏｈａｖｅｇｅｎｅｔｉｃｄｅｆｅｃｔｓｉｎＬＤＬＲｇｅｎｅ.ＩｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇＬＤＬＲｇｅｎｅｔｏｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｉｍａｌｓｗｉｔｈｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａｃｏｕ…     

Involvement of death receptor Fas in germ cell degeneration in gonads of Kit-deficient Wv/Wv mutant mice

Kit and its ligand stem cell factor (SCF) play a fundamental role in hematopoiesis, melanogenesis and gametogenesis. Homozygous W(v) mutant mice with a mutation in kit show abnormalities in these cell lineages. Fas is a member of the death receptor family inducing apoptosis. In this study, we generated double-mutant mice (W(v)/W(v):Fas(-/-)) and analyzed histologically their reproductive organs. In testes and ovaries of the double-mutant mice, testicular germ cells and oocytes were detected, respectively, whereas the same-aged W(v)/W(v) mice contained neither cells. In addition, inhibition of Kit signals by administration of anti-Kit mAb, which induces degeneration of testicular germ cells in vivo in wild-type mice, did not cause degeneration in Fas-deficient mice. In testicular germ cells of W(v)/W(v) mutant mice, an increase of Fas expression was observed in spermatogonia. Further, in vitro treatment with SCF was shown to downregulate Fas on fibroblasts expressing exogenous Kit through activation of PI3-kinase/Akt. All the results clearly indicate that Fas-mediated apoptosis is involved in germ cell degeneration accompanied by defects in Kit-mediated signals, and Kit signaling negatively regulates Fas-mediated apoptosis in vivo.     

Regulation of cellular function through stem cell factor and c‐Kit receptor in the cerebellar cell culture

Evidence that stem cell factor (SCF) and c‐Kit receptor tyrosine kinase expressed in the cerebellum during postnatal development, suggests a possible contribution of the SCF/Kit signaling pathway in the cerebellar development. In the present study, we prepared cerebellar cultures from C57Bl/6J mouse at postnatal day 6 to investigate the role of c‐Kit receptor and SCF in regulation of cell growth and viability in the postnatal cerebellar cells. SCF increased the number of survival cells and density of calbindin and GFAP expression in the immunoblot analysis. Treatment with c‐Kit antibody accelerated cellular loss in serum‐free media and decreased the expression of calbindin and GFAP. The recovery effects of SCF on the cellular proliferation and the expression of functional proteins in the cultures containing c‐Kit antibody suggest an involvement of SCF/Kit pathways in the control of postnatal development of cerebellar cells.     

大鼠bcl-x_L cDNA的克隆和高滴度重组bcl-x_L腺相关病毒的制备

 以RT PCR法从大鼠脑组织中克隆bcl XL 基因 ,将其定向插入带rep cap基因和neu基因的三功能腺相关病毒 (AAV)载体 ,转染HeLa细胞并以G4 18筛选 ,然后用腺病毒感染筛选后的细胞克隆 ,包装成重组腺相关病毒 .用带rep cap基因的C12细胞筛选和滴定产生重组腺相关病毒的细胞克隆 ,粗制细胞裂解物中病毒滴度最高只有 3× 10 5IU ml.从产病毒量较高的克隆大量制备重组病毒 ,经肝素柱高压液相亲和层析法纯化、浓缩病毒后获得了高达 4× 10 11IU ml的重组病毒 .为研究脑缺血动物模型中BCL XL 的抗脑细胞凋亡作用打下了基础     

人可溶性血管内皮细胞生长因子受体Flt-1基因在链霉菌中的克隆表达

应用RT－PCR技术,从人脐静脉内皮细胞中扩增出编码人可溶性血管内皮细胞生长因子（VEGF）受体Flt-1胞外区前四个结构域的基因片段,亚克隆至pUC18质粒进行测序,将目的基因片段连接至链霉菌表达载体pSGLgpp,获得重组质粒pSGLgpp-F,将其转化至Streptomyces lividans TK24,获得基因工程菌株Sreptomyces lividans(pSGLgpp-F),对其培养上清液进行SDS－PAGE及Western blot分析,结果显示,在63．6kD处有特异性条带出现,表明sFLT-1在链霉菌中获得了成功表达,受体配基结合实验显示表达产物与VEGF可特异性结合,表明其具有配基结合生物活性。     

EB病毒LMP-1在鼻咽癌细胞中通过JNK介导AP-1活化

 EB病毒潜伏膜蛋白 1 (latentmembraneprotein 1 ,LMP 1 )活化激活蛋白 1 (activatorprotein 1 ,AP 1 )信号传导途径与其致瘤作用密切相关 .为了探讨LMP 1活化AP 1信号传导的分子机制 ,在可诱导调控LMP 1表达的鼻咽癌细胞系L7中 ,首先通过荧光酶双报道系统确定了LMP 1表达能激活AP 1 ;在此基础上 ,用c JunPathDetect系统确定LMP 1表达活化AP 1是通过c Jun的磷酸化 (活化 )介导 .虽然LMP 1不能上调c Jun上游主要调节激酶c JunN端激酶 (c JunN terminalkinase ,JNK)的蛋白表达 ,但能显著促进JNK的磷酸化 (活化 ) ;在L7细胞中导入JNK相互作用蛋白 (JNK interactingprotein ,JIP)基因 ,抑制JNK的核移位能显著抑制LMP 1诱导的AP 1活化 ,同时对NFкВ活化也有部分抑制作用 .结果表明 ,EB病毒LMP 1在鼻咽癌细胞中通过JNK介导AP 1活化     

Expression, purification, and characterization of a novel recombinant fusion protein, rhTPO/SCF, in Escherichia coli

Thrombopoietin (TPO) is the principal regulatory cytokine of megakaryopoiesis and thrombopoiesis and promotes all aspects of megakaryocyte development. Stem cell factor (SCF) is mainly a pleiotropic cytokine acting on hematopoiesis by promoting the survival and proliferation of hematopoietic stem cells and has a potent synergistic effect on megakaryopoiesis in the presence of TPO. Here, we report the construction, expression, and purification of a novel recombinant human thrombopoietin/stem cell factor (rhTPO/SCF) fusion protein, which consists of a truncated human thrombopoietin (1-157 a.a.) plus a truncated human stem cell factor (1-145 a.a.), linked by a peptide (GGGGSPGGSGGGGSGG). The TPO/SCF gene was cloned into the Escherichia coli expression vector pET28a and expressed in BL21(DE3) strain. The rhTPO/SCF constituted up to 6% of the total bacterial protein. Co-expression with E. coli chaperones, Trigger Factor (TF) and GroES/GroEL, and lowering cultivation temperature cooperatively improved the solubility of expressed rhTPO/SCF, resulting in about fourfold increase in the yield soluble rhTPO/SCF. The rhTPO/SCF was purified to homogeneity using anion exchange followed by metal affinity chromatography. Western blot analysis confirmed the identity of the purified protein. rhTPO/SCF stimulated a dose-dependent cell proliferation in both TF1 and Mo7e cell lines.     

RARβ在胃癌细胞生长调节中的作用

为探讨 RARβ受体介导全反式视黄酸 ( ATRA)抑制胃癌细胞生长的作用机理 ,用 Northern印迹测定 RARβ m RNA表达水平 ,脂质体介导的转染方法将含有 RARβ基因的表达载体转染MKN- 45细胞并稳定表达 ,MTT和软琼脂集落形成等实验测定细胞生长速率和生长状态 ,氯霉素乙酰转移酶活性 ( CAT)测定视黄酸应答元件βRARE的转录活性以及 AP- 1 ( activator protein- 1 )活性 .RARβ在 ATRA敏感细胞株 MGC80 - 3、BGC- 82 3和 SGC- 790 1中表达 ,而在 ATRA抗性细胞株 MKN- 45中不表达 .当 RARβ基因转染 MKN- 45细胞时 ,细胞变为 ATRA敏感 ,由此导致ATRA抑制 MKN- 45细胞生长和软琼脂集落形成 .ATRA可以加强诱导 MGC80 - 3、BGC- 82 3和SGC- 790 1细胞βRARE的转录活性 ,但对 MKN- 45细胞影响不大 ,不能抑制细胞 AP- 1活性 .当RARβ基因转染 MKN- 45细胞后 ,ATRA则能够诱导细胞 βRARE的转录活性 ,并抑制细胞的 AP-1活性 .RARβ表达与 ATRA抑制胃癌细胞生长密切相关 .ATRA诱导 βRARE转录活性和抑制AP- 1活性可能是其调控胃癌细胞生长的机制之一 .