大豆深加工产品两种荧光定量PCR检测方法的比较研究

以内源基因Lectin作为内参照,根据RR大豆中外源基因CP4-EPSPS和内源基因Lectin设计TaqMan和SYBR GreenⅠ引物和荧光探针,使用定量PCR仪对大豆深加工产品中RR大豆的含量使用两种FQ-PCR方法进行定量检测,建立了RR大豆标准品CP4-EPSPS和Lectin之间的△Ct与样品中RR大豆含量百分比之间的校正曲线和线性回归方程,并对5种未知大豆深加工样品进行检测,同时比较二者的检测结果。结果表明,说明TaqMan和SYBR GreenⅠ两种FQ-PCR检测技术的检测结果可靠,且均可用于转基因深加工产品的检测。     

CP4-EPSPS转基因棉花植株鉴定方法比较分析

CP4-EPSPS是从土壤农杆菌CP4菌株中分离得到的抗除草剂草甘膦基因,是转基因植物研究中最为常用的一种筛选标记基因。但是在CP4-EPSPS转基因植物后期筛选过程中仅凭简单的草甘膦抗性筛选并不能得到完全准确的鉴定结果,常会出现假阳性或漏选的情况。本研究以抗草甘膦转CP4-EPSPS基因棉花为材料,对PCR扩增、ELISA、CP4-EPSPS蛋白检测试纸条及草甘膦抗性四种转基因阳性植株筛选方法进行比较,从筛选结果的准确性、时效性、易用性及实惠性等不同方面综合分析了各种筛选方法的优缺点,结果表明ELISA、试纸条检测方法的准确性显著高于PCR检测与0.3%浓度草甘膦抗性检测,而试纸条检测操作更加便捷,因此建议将草甘膦抗性与试纸条检测方法结合起来使用。本研究结果为以CP4-EPSPS基因为标记筛选的转基因植物的室内及大田筛选提供实验依据。     

转基因大豆豆粕外源基因和蛋白在SD大鼠体内消化吸收分析

为了评估转基因抗草甘膦除草剂大豆的食用安全性,以20%的比例将转基因抗草甘膦除草剂大豆GTS40-3-2和其亲本非转基因大豆A5403豆粕分别添加到基础饲料中喂养两代Sprague-Dawley(SD)大鼠,采用定性、定量PCR和ELISA方法检测转基因大豆成分相关基因和蛋白在长期饲喂的大鼠体内代谢残留状况。结果表明,大鼠喂养转基因大豆豆粕后,除了大鼠肠粪和盲肠内容物检测到有转基因成分的残留,肠道菌群和实质脏器均未发现相关基因和蛋白。结果提示,长期饲喂转基因抗草甘膦除草剂大豆GTS40-3-2与亲本A5403大豆豆粕对SD大鼠具有同样的食用安全性。     

抗草甘膦转基因大豆PCR的检测

目的:建立快速、有效的鉴别转基因作物与非转基因作物及其产品的检测方法体系。方法:用抗草甘膦转基因大豆中的外源CaMV35S启动子和CP4-EPSPS基因引物,应用PCR方法,从中扩增出预期大小的DNA片段,将扩增产物回收后测序。结果:经同源性分析,扩增产物为CaMV35S启动子和CP4-EPSPS基因的一部分序列。结论:初步建立了转基因大豆的检测方法,同时讨论了PCR检测过程中假阴性和假阳性的原因。     

CP4-EPSPS蛋白的模拟胃肠液消化稳定性分析

CP4-EPSPS蛋白与草甘膦亲和力低,使草甘膦不能阻断生物体内的莽草酸合成途径,成功用于培育抗草甘膦转基因作物。[目的]为评价CP4-EPSPS蛋白的食用安全性,分析了CP4-EPSPS蛋白在模拟胃肠液消化中的稳定性研究。[方法]根据NCBI公布的基因序列信息,人工合成CP4-EPSPS基因并构建原核表达载体p ET-CP4,转化大肠杆菌菌株Transetta(DE3)并表达CP4-EPSPS蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。根据国家标准建立体外模拟胃肠液消化体系,对照和样品蛋白均以5 g/L的浓度进行模拟胃液消化,以2 g/L的浓度进行模拟肠液消化。在消化0 s、15 s、2 min、30 min和60 min后分别进行取样,然后将其进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,并进行Western Blot杂交分析。[结果]模拟胃肠液消化实验结果表明,CP4-EPSPS蛋白在模拟胃肠液中均在15 s内即被消化,SDS-PAGE与Western Blot杂交未检测到蛋白残留。[结论]说明CP4-EPSPS蛋白在胃肠液体系中极易被消化。     

PCR技术定性检测转基因大豆方法的建立与研究

以转基因大豆(RRS品系)为材料,采用PCR技术,通过特异性引物和探针,对转基因大豆中的内源性基因Lectin和外源基因35S启动子、NOS终止子及CP4-EPSPS进行定性检测,旨在建立一种简单、快速、高效的检测方法,并将该方法用于我国进口自美国大豆实施检测,以评判是否为转基因大豆,为我国的商业谈判提供依据,同时也可满足百姓的知情权。     

转基因抗草甘膦油菜的检测方法

目的:建立检测田间转基因抗草甘膦油菜的方法。方法:用CTAB法提取DNA,经PCR分别扩增内参基因BnACCg8,及抗草甘膦外源基因CP4-EPSPS、FMV 35S启动子和E9 3’终止子等4种基因的片段,以琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析比对。结果:抗草甘膦油菜中分别扩增出与外源基因FMV 35S启动子、E9 3’终止子和CP4-EPSPS大小一致的片段。结论:该方法能有效地用于转基因抗草甘膦油菜的检测。     

大豆油中转基因成分的Nested PCR和Semi-nested PCR检测方法研究

对大豆油中DNA提取方法进行了研究,结果表明CTAB、SDS和Wizard试剂盒提取大豆油DNA均具有良好的效果。利用nested PCR和semi—nested PCR检测大豆（Roundup Ready）油中的转基因成分发现,该方法能够检测到大豆原油中的Lectin基因（112bp）、CaMV35S基因（147bP）和CP4-EPSPS基因（205bp）,检测灵敏度达到10^-6ng／μl;但该方法未能从人豆成品油（一级）中扩增到上述基因,当中的转基因成分DNA含量低于10^-12ng／μl。     

以草甘膦为筛选标记的大豆转基因体系的建立及抗除草剂转基因大豆的培育

抗草甘膦转基因大豆能显著提高大豆生产效率,具有重大的应用前景.本实验室前期研究建立了农杆菌介导、草胺膦为筛选剂的大豆转基因体系,转化效率在4%以上.在此基础上,利用G6-EPSPS和G10-EPSPS 2个具有自主知识产权的草甘膦抗性基因,通过优化转化体系,成功建立了以草甘膦为筛选剂的大豆遗传转化体系,转化效率达1%以上.浓度梯度实验发现,当草甘膦的筛选浓度为100 mg/L时,虽然丛生芽的再生率下降了50%～60%,但最终转化效率不受影响.进一步通过基因表达分析、Western blot、Southern blot和除草剂抗性鉴定等方法对转基因大豆进行了分子检测和验证,最后获得了分子特征明确、对草甘膦抗性稳定的抗草甘膦转基因大豆后代.结果对国内抗草甘膦转基因大豆转基因方法研究及抗除草剂新品种选育具有意义.     

核酸层析法转基因快速检测体系的建立及应用

随着我国转基因研究及产业化进程提速,转基因检测的重要性日益凸显,因而快速、高效的分子检测新方法的研发具有重要的生产实践及科研意义。在转基因检测中,常规PCR技术具有检测范围广的特点,但较为费时费力,且对实验条件要求较高;而胶体金蛋白试纸法检测方便、快捷,但可检范围窄。基于此,建立了一套基于核酸层析法快速转基因检测的方法体系。将经液氨研磨后的样品通过一管法提取DNA后直接进行PCR扩增,再将PCR扩增产物滴加到胶体金检测卡上,通过直接观察胶体金卡条显色状况进行结果判别。此方法最终检验出玉米内参基因ZSSⅡB及Zein、大豆内参基因SPS、水稻内参基因Lectin,转基因元件启动子CaMV35S及终止子NOS,以及抗虫基因Cry1Ab/1Ac、抗除草剂基因Bar、Pat、CP4-EPSPS及选择标记基因NPTⅡ、Pmi等外源基因;并成功检出特异性转基因事件Mir604及Bt11。研究获得的核酸层析检测方法具有灵敏度高、省时省力且对检测条件要求低等优点,集PCR法与蛋白试纸检测法二者优势于一身,可广泛应用于转基因产品的精确快速检测,为我国转基因生物安全监管提供了良好的技术支撑。     

进口转基因抗草甘膦油菜籽和大豆中CP4—EPSPS基因的检测比较研究

由于国际上对转基因产品的安全性存在的较大争议,因此对没有加施标签予以声明的情况下大量进入中国市场的转基因产品进行检测就显得十分迫切且意义重大。本研究以进口转基因抗草甘膦油菜籽和大豆为材料,通过比较分析外源的CP4－EPSPS基因的核苷酸序列和表达的氨基酸序列,设计出两对不同的引物,采用PCR方法分别对转基因油菜籽和大豆中外源的CP4－EPSPS基因进行了检测。     

抗草甘膦转基因大豆PCR检测及问题探讨

转基因植物的检测具有重要的意义。用抗草甘膦转基因大豆中的外源CaMV35S启动子、CP4 EPSPS和巢式PCR引物,应用PCR方法,从中扩增出预期大小的DNA片段。将扩增产物回收后测序,经同源性分析扩增产物为CaMV35S启动子和CP4 EPSPS的一部分序列。与常规PCR相比,巢式PCR在检测转基因大豆中具有更高的特异性。讨论了PCR检测过程中假阴性和假阳性的原因。     

Lack of glyphosate resistance gene transfer from Roundup Ready soybean to Bradyrhizobium japonicum under field and laboratory conditions

A field study was conducted at the Russell E. Larson Agricultural Research Center to determine the effect of transgenic glyphosate-resistant soybean in combination with herbicide (Roundup) application on its endosymbiont Bradyrhizobium japonicum. DNA of bacteroids from isolated nodules was analysed for the presence of the transgenic 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (CP4-EPSPS) DNA sequence using polymerase chain reaction (PCR). To further assess the likelihood that the EPSPS gene may be transferred from the Roundup Ready (RR) soybean to B. japonicum, we have examined the natural transformation efficiency of B. japonicum strain 110spc4. Analyses of nodules showed the presence of the transgenic EPSPS DNA sequence. In bacteroids that were isolated from nodules of transgenic soybean plants and then cultivated in the presence of glyphosate this sequence could not be detected. This indicates that no stable horizontal gene transfer (HGT) of the EPSPS gene had occurred under field conditions. Under laboratory conditions, no natural transformation was detected in B. japonicum strain 110spc4 in the presence of various amounts of recombinant plasmid DNA. Our results indicate that no natural competence state exists in B. japonicum 110spc4. Results from field and laboratory studies indicate the lack of functional transfer of the CP4-EPSPS gene from glyphosate-tolerant soybean treated with glyphosate to root-associated B. japonicum.     

Development of antibiotic marker-free creeping bentgrass resistance against herbicides

Herbicide-resistant creeping bentgrass plants (Agrostis stolonifera L.) without antibiotic-resistant markers were produced by Agrobacterium-mediated transformation. Embryogenic callus tissues were infected with Agrobacterium tumefaciens EHA105, harboring the bar and the CP4-EPSPS genes for bialaphos and glyphosate resistance. Phosphinothricin-resistant calli and plants were selected. Soil-grown plants were obtained at 14-16 weeks after transformation. Genetic transformation of the selected, regenerated plants was validated by PCR. Southern blot analysis revealed that at least one copy of the transgene was integrated into the genome of the transgenic plants. Transgene expression was confirmed by Northern blot. CP4-EPSPS protein was detected by ELISA. Transgenic plants remained green and healthy when sprayed with Basta, containing 0.5% glufosinate ammonium or glyphosate. The optimized Agrobacterium-mediated transformation method resulted in an average of 9.4% transgenic plants. The results of the present study suggest that the optimized marker-free technique could be used as an effective and reliable method for routine transformation, which may facilitate the development of varieties of new antibiotic-free grass species.     

Variability of CP4 EPSPS expression in genetically engineered soybean (<Emphasis Type="Italic">Glycine ma</Emphasis>x L. Merrill)

The expression of the CP4 EPSPS protein in genetically engineered (GE) soybean confers tolerance to the Roundup^® family of agricultural herbicides. This study evaluated the variability of CP4 EPSPS expression using an enzyme-linked immunosorbent assay in soybean tissues collected across diverse germplasm and 74 different environments in Argentina, Brazil and the USA. Evaluated material included single and combined (stacked) trait products with other GE traits in entries with cp4 epsps gene at one or two loci. The highest level of CP4 EPSPS was observed in leaf tissues, intermediate in forage and seed, and lowest in root tissues. Varieties with two loci had approximately twice the level of CP4 EPSPS expression compared to one locus entries. Variable and non-directional level of CP4 EPSPS was observed with other factors like genetic background, trait stacking, growing region or season. The maximum and average CP4 EPSPS expression levels in seed provided large margins of exposure (MOE of approximately 4000 and 11,000, respectively), mitigating concerns over exposure to this protein in food and feed from soybean varieties tolerant to Roundup^® herbicides.     

转基因植物快速检测方法的研究

本试验对转基因植物检测中的DNA提取和PCR扩增程序作了改进。经试验,本研究建立的DNA快速提取法与目前广泛使用的CTAB法相比更为简便,快速和经济,提取的DNA质量主扩增效果无明显差异,可用于多种转基因植物,多种植物组织的DNA提取,利用复合PCR法可在同一反应管中同步检测35N,NOS及CP4－EPSPS基因,明显提高了检测效率。应用本试验建立的DNA快速提取－复合PCR扩增－银染检测技术可在6小时内得出结果,达到了快速,简便,灵敏,可靠的检测目的。     

固定化胰蛋白酶亲和层析法制备低STI残存大豆分离蛋白质

聚苯乙烯阴离子交换树脂(GM201)经预处理除去杂质后先与戊二醛(2—6％)反应,再与胰蛋白酶(5000u/mg,8—10mg/mL,pH 8.0)反应即制得固定化胰蛋白酶。此法得到的固定化胰蛋白酶具有良好的热稳定性,贮藏稳定性和操作稳定性,可用于工业化目的。脱脂豆粉经萃取(PH9.0)后,稀释4倍,在pH5.0下沉淀分离出大豆球蛋白,然后用酸性水(pH5.0)洗涤两次,并进行碱溶与酸沉淀两次,即可将大豆分离蛋白质的STI残留降低到1.85％,比活性降到1u/mg以下。最后再用固定化胰蛋白酶亲和层析,就可以除去大豆分离蛋白质中残留的STI。