一株凡纳滨对虾源鳗弧菌群体感应信号分子的检测

旨在检测从凡纳滨对虾体内选取的一株鳗弧菌的群体感应信号分子。利用报告菌株结合薄层层析法鉴定鳗弧菌(Vibrio anguillarum,VA)分泌的高丝氨酸内酯类(AHLs)信号分子,利用哈维氏弧菌V.harveyi JMH597和V.harveyi JAF375作为报告菌株分别检测了VA分泌的AI-2和CAI-1信号分子活性与细菌密度的关系。结果表明,VA能分泌3种类型的信号分子:AHLs信号分子、AI-2信号分子和CAI-1信号分子,其中分泌的AHLs有N-3-羟基-己酰基-高丝氨酸内酯(3-OH-C6-HSL)、N-3-辛酰基-高丝氨酸内酯(C_8-HSL)和N-3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯(3-oxo-C_8-HSL)。VA分泌的AHLs、AI-2和CAI-1均具有密度依赖性。     

一株沙雷氏菌的分离及其群体感应现象

从腐败的凡纳滨对虾中分离得到一株具有群体感应的菌株,利用16S rRNA和生理生化试验鉴定其为黏质沙雷氏菌,但不产灵红素,命名为Serratia marcescens AK1。通过生物检测方法对菌株AK1进行群体感应检测,薄层层析法鉴定该菌株的信号分子类型。结合菌株生长规律,测定不同时间段信号分子的含量。结果显示,菌株AK1能诱导紫色杆菌CV026产生紫色杆菌素,诱导根癌农杆菌A136分解X-gal产生蓝色;薄层层析检测结果显示该菌能产生两种群体感应信号分子C6-HSL和3-oxo-C6-HSL,并具有密度依赖性,信号分子含量在生长对数后期达到最大值。     

凡纳滨对虾源不动杆菌群体感应信号分子分离鉴定及其调控

【目的】鉴定凡纳滨对虾源不动杆菌(Acinetobacter spp.M1)分泌的N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)类型,探究细菌生长阶段及环境因素对其分泌信号分子的影响。【方法】报告菌株平板法检测M1的AHLs的活性;采用报告平板与薄层层析(TLC)相结合法对M1分泌的AHLs类型进行鉴定。【结果】菌株M1分泌N-3-氧代-己酰基-高丝氨酸内酯和N-3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯两种信号分子。在适宜条件下AHLs活性随着培养时间的延长先升高后降低,在对数末期(30 h)达到最大。弱酸和弱碱环境能够降低M1分泌AHLs的能力,p H 7.0是M1分泌AHLs的最适p H。较高浓度的Na Cl促进了个体M1分泌AHLs的能力,但是Na Cl浓度对M1总体分泌AHLs没有显著的影响。菌株M1分泌AHLs的最佳温度为30°C,温度过高或过低都会影响其分泌。【结论】菌株M1主要产生N-3-氧代-己酰基-高丝氨酸内酯和N-3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯两种类型信号分子。M1的QS系统受菌体密度和环境因素的双重调控。     

仿刺参“腐皮综合症”病灶处优势菌的分离鉴定及AHLs信号分子的检测

仿刺参"腐皮综合症"是一种由细菌引起的高传染性、高死亡率疾病.为了研究仿刺参"腐皮综合症"病灶处优势菌以及其是否存在N-酰基高丝氨酸内酯类化合物(AHLs)介导的群体感应系统,本文从患病仿刺参病灶处分离纯化出7株优势菌,生理生化指标测定和16S rDNA序列分析表明:菌株C6属Tenacibaculum属,菌株4属于腐败希瓦菌群(Shewanella putrefaciens group),菌株TB属于弧菌属(Vibrio),菌株BP2、BP3、BP4及BP6属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas).采用AHLs的高效检测菌株根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens KYC55)对优势菌的AHLs活性进行检测,其中菌株C6、4、TB、BP3及BP4存在以AHLs为信号分子的群体感应系统,菌株BP2与BP6则无AHLs活性;不同细菌AHLs活性不同,AHLs活性从高到低顺序为4＞TB＞BP4＞BP3＞C6.     

不动杆菌属中aidE基因编码高丝氨酸内酯酶

群体感应(Quorum sensing,QS)是细菌在进化过程中形成的依赖于群体密度的细菌间交流方式。许多革兰氏阴性细菌以N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)为信号分子,感应自身群体密度并调控致病基因表达。因此,淬灭AHLs信号分子可防治此类细菌引起的植物病害。本实验室前期已筛选得到了一株具有AHLs信号降解能力的不动杆菌菌株Acinetobacter sp.77,本研究通过基因组文库筛选,自菌株77中克隆得到具有AHLs降解活性的基因aidE。该基因编码268个氨基酸。序列一致性比较发现aidE的氨基酸序列与吉伦伯不动杆菌Acinetobacter gyllenbergii CIP110306中β-内酰胺酶一致性高达95%,但与已知的AHLs降解酶序列一致性较低,最高为缓黄分支杆菌Mycobacterium lentiflavum中AHL内酯酶Att M/Aii B家族蛋白(CQD23908.1),一致性仅为33%。通过高压液相色谱(HPLC)分析Aid E蛋白处理N-己酰基高丝氨酸内酯(C6-HSL)的反应产物,证明aidE为AHL内酯酶。序列比对研究发现,aidE基因在不动杆菌属中并不保守,其在菌株77基因组中的上下游的基因排列存在菌株水平的特异性,且aidE基因下游存在疑似IS插入序列,上述证据表明aidE基因有可能是通过水平转移进入Acinetobacter sp.77基因组中,或其在基因组中的位置发生过重排。表达aidE的软腐果胶杆菌Z3-3中完全检测不到AHLs信号产生,且致病力明显降低。综上所述,aidE为新发现的AHL内酯酶。在防治依赖QS系统表达致病性的细菌病害中具有应用潜力。     

群体感应信号分子及其抑制剂快速检测方法的建立

细菌能自发产生、释放一些特定的信号分子,并能感知其浓度变化,调节微生物的群体行为,这一调控系统称为群体感应。细菌群体感应参与包括人类、动植物病原菌致病力在内的多种生物学功能的调节,群体感应抑制剂成为抗感染药物开发的靶点。利用紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)作为指示菌,建立检测高丝氨酸内酯(AHLs)及其抑制剂的简便方法。结果表明,通过平板交叉划线接种,使用指示菌能够有效地检测AHLs,并且通过薄层层析(TLC)与细菌生物感应器相结合的方法可以快速、方便地鉴定AHLs的种类;通过双层平板法观察指示菌色素产生情况,能够有效地检测群体感应信号分子AHLs抑制剂,且该方法简单易行。     

花椒提取物对嗜水气单胞菌群体感应的抑制作用

以紫色杆菌(Chromobacterium violaceum) CV026作为研究菌株,研究食品香辛料花椒提取物的群体感应抑制活性及其对冷藏凡纳滨对虾腐败菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)群体感应的影响。结果表明,花椒提取物可有效抑制C. violaceum CV026紫色色素的产生,在亚致死浓度下,花椒提取物可降低嗜水气单胞菌N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)的分泌及有效抑制其生物膜形成和胞外蛋白酶活性。嗜水气单胞菌经质量浓度为16. 0 mg/m L的花椒提取物处理后,其生物膜、胞外蛋白酶活性分别比对照降低了72. 11%和73. 30%,差异达显著水平(P0. 05),且花椒提取物对嗜水气单胞菌群体感应呈现出浓度依赖性抑制效果。这表明花椒提取物具有良好的群体感应抑制活性,有望开发成一种新型群体感应抑制剂用于食品防腐保鲜。     

醋杆菌中群体感应分布与遗传进化分析

醋杆菌耐酸性能是制约高酸度食醋发酵的关键因素,为更好地探究醋杆菌耐酸调控机制,笔者选取巴氏醋杆菌为主要研究对象,采用指示菌生物检测和仪器分析方法研究了其群体感应特性。同时,结合生物信息学分析,在基因组水平揭示醋杆菌中群体感应的分布与遗传进化。结果表明,巴氏醋杆菌Ab3和CICC 20001不能合成AHLs类和AI-2信号分子。AHLs合成酶Lux I和受体蛋白LuxR的编码基因在巴氏醋杆菌遗传进化过程中普遍丢失,同时也未在其基因组中发现AI-2合成和响应体系中关键蛋白的编码序列。相比于巴氏醋杆菌,在其他菌种(如A. malorum和A. tropicalis)中同样不存在AI-2合成体系,但拥有完整的AHLs合成和感受体系,表明这些菌株中群体感应仍发挥重要的调控作用。群体感应系统在醋杆菌中的分布与生存环境和基因组稳定性密切相关,其中分离于自然环境和宿主肠道内的菌株拥有更多完整的群体感应体系。     

两种微藻对凡纳滨对虾幼体成活率的影响

试验旨在研究钝顶螺旋藻(Sprinulian platensis)和Picochlorum sp.两种微藻培育凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼体效果, 为开发凡纳滨对虾开口饵料提供参考依据。实验对照组D0 投喂商品螺旋藻粉, 实验组D1、D2 分别投喂钝顶螺旋藻和Picochlorum sp., 每组3 个重复,每个重复2 万尾凡纳滨对虾幼体, 在300 L 育苗桶中饲养七天。 结果表明, D0 和D1 组间凡纳滨对虾存活率无显著差异(P＞0.05), 但两组极显著高于D2 组(P＜0.01)。在凡纳滨对虾育苗过程中, 水体总氨氮浓度小于50 umol·L^-1、亚硝酸盐氮浓度小于2 umol·L^-1。钝顶螺旋藻可以保证较高的幼体变态存活率, 可以作为凡纳滨对虾开口饵料新资源开发利用。     

内生菌Pseudomonas sp. G5 phzIR基因的克隆与表达

假单胞菌菌株G5是分离自香菜(Coriandrum sativumL.)茎内的一株内生菌,经BIOLOG系统分析其底物利用图谱,初步鉴定为桔黄假单胞菌Pseudomonas aurantiaca。大量研究已表明许多革兰氏阴性细菌应用群体感应系统,通过感应扩散性小信号分子―乙酰基高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactones,AHLs),以种群密度依赖的方式调控基因表达,控制植物相关细菌的多种表型。本研究组合应用AHLs检测菌株Chromobacterium violaceum CV026和薄层层析分析,初步检测出菌株G5可产生几种可检测水平的AHLs信号分子,其中以N-hexanoyl-homoserine lactone(C6-HSL,HHL)为主,迁移率Rf值为0.4。进一步克隆和测序了该菌株中由PhzI和PhzR组成的群体感应quorumsensing系统的编码基因phzIR,并在大肠杆菌中异源表达了AHLs信号分子合成酶基因phzI。序列和系统进化分析表明它们与假单胞菌属其他的phzIR基因有高度同源性和进化上的保守性。     

碳源及温度对食源假单胞菌群体感应信号分子产生的影响

许多革兰氏阴性菌通过产生N-酰基-高丝氨酸内酯（AHLs）类信号分子来调控某些性状的表达,即群体感应（quorum sensing）。假单胞菌是一种导致食品腐败的重要腐败细菌,也产生AHLs。本文研究了不同温度及碳源对食源假单胞菌AHLs产生的影响。结果表明,该假单胞菌在25℃条件下,产生两种AHL信号分子,而在4℃条件下,所产生的短链AHL分子消失,主要产生长链AHL分子。而且在不同碳源（葡萄糖,果糖,木糖,麦芽糖等）的培养基中生长,所产生的AHLs分子种类也不同。同时发现当pH>7.5时,AHLs的稳定性下降。由此得出,在不同的环境条件(碳源及温度)下假单胞菌所产生的AHLs种类不同。为进一步研究群体感应现象在食品腐败中的作用以及开发基于干扰腐败菌群体感应的新型食品防腐技术提供研究基础。     

食源假单胞菌群体感应信号分子的研究

从市售鲜鱼中分离的3株革兰氏阴性菌,经16S rDNA鉴定为假单胞菌属,该菌是一种导致食品腐败的重要腐败细菌。N-酰基-高丝氨酸内酯(AHLs)是革兰氏阴性菌群体感应(QS)系统中一类重要的信号分子,以密度依赖的方式调控某些生理性状的表达。利用AHLs检测菌株对3株假单胞菌进行检测发现,均产生AHLs类信号分子,且FML05-1和FML05-2至少产生两种AHLs,主要的信号分子是N-3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯(N- 3-oxo-C_8-HSL)。同时对菌株FML05-2在生长过程中所产生的AHLs的活性变化进行研究,发现AHLs活性在菌体生长至12h时达到最大。首次对食源假单胞菌所产生的AHLs进行了研究,为以干扰腐败细菌群体感应为靶点的食品防腐保鲜策略提供研究基础。     

青岛近海沉积物生物被膜中密度感应及密度感应淬灭细菌多样性

【背景】细菌密度感应(Quorum sensing,QS)是指细菌利用分泌的信号分子进行相互交流的现象,而密度感应淬灭(Quorumquenching,QQ)是指通过干扰信号分子的产生、释放、积累或应答从而阻抑密度感应通路。【目的】探究青岛近海沉积物生物被膜中密度感应和密度感应淬灭细菌的多样性。【方法】采用海水培养基2216E从青岛近海沉积物生物被膜中分离获取可培养细菌,采用平板交互划线和高通量筛选的方法分别筛选具有密度感应和密度感应淬灭的菌株。【结果】共分离获得83株共54种具有密度感应和密度感应淬灭的细菌,分属于四大细菌门类:变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门。其中,38株(45.8%)可以产生酰基高丝氨酸内酯(Acyl-homoserine lactone,AHL)类信号分子,它们分属于变形菌门(37株,15种)和拟杆菌门(1株,1种),优势属为弧菌属和鲁杰氏菌属;能够降解AHL类信号分子的有57株(68.7%),在变形菌门(41株,23种)、拟杆菌门(14株,10种)、厚壁菌门(5株,5种)以及放线菌门(1株,1种)中均有分布。【结论】在青岛近海沉积物生物被膜可培养细菌中,具有密度感应和密度感应淬灭现象的菌株具有很高的丰度和多样性,为后续生态学意义的研究与海洋微生物的开发提供了参考。     

华癸根瘤菌中自体诱导物的初步研究

群体感应 (Quorumsensing)是细菌通过产生可扩散的小分子量自体诱导物信号分子感知细胞群体密度变化 ,进行基因表达调控的生理行为。将根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)构建为超量表达群体感应调节蛋白TraR的检测菌株JZA1,试验证明该检测菌株能检测纳摩尔浓度的自体诱导物 ,利用该菌株对 3株不同华癸根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)进行自体诱导物活性检测 ,发现该 3株华癸根瘤菌均能产生自体诱导物 ,其表达量与菌体密度成正相关 ,但 3株菌在相同培养条件下自体诱导物的表达量存在差异 ,结果表明自体诱导物在种内水平上存在一定的多样性 ;同时发现高pH条件能大大降低自体诱导物的稳定性 ,为进一步研究群体感应调节在共生固氮上的作用提供理论及实践依据     

细菌群体感应信号分子——酰基高丝氨酸内酯的检测

革兰氏阴性菌根据信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)的浓度可以监测周围环境中自身或其他细菌的数量变化,当信号分子达到一定浓度阈值时,能启动相关基因的表达来适应环境的变化,这一调控系统被称为细菌的群体感应(quorumsensing,QS)系统。快速简便而有效地检测细菌是否以及产生何种信号分子成为深入研究和了解细菌群体感应的重要手段。现对信号分子AHLs敏感的用于检测不同的信号分子AHLs的微生物传感菌进行综述,并对其检测能力进行了讨论。     

A probable aculeacin A acylase from the Ralstonia solanacearum GMI1000 is N-acyl-homoserine lactone acylase with quorum-quenching activity

Background  

The infection and virulence functions of diverse plant and animal pathogens that possess quorum sensing systems are regulated by N-acylhomoserine lactones (AHLs) acting as signal molecules. AHL-acylase is a quorum quenching enzyme and degrades AHLs by removing the fatty acid side chain from the homoserine lactone ring of AHLs. This blocks AHL accumulation and pathogenic phenotypes in quorum sensing bacteria.     

N-acylhomoserine lactonase producing Rhodococcus spp. with different AHL-degrading activities

N-acylhomoserine lactones (AHLs) are conserved signal molecules that control diverse biological activities in quorum sensing system of Gram-negative bacteria. Recently, several soil bacteria were found to degrade AHLs, thereby interfering with the quorum sensing system. Previously, Rhodococcus erythropolis W2 was reported to degrade AHLs by both oxido-reductase and AHL-acylase. In the present study, two AHL-utilizing bacteria, strains LS31 and PI33, were isolated and identified as the genus Rhodococcus. They exhibited different AHL-utilization abilities: Rhodococcus sp. strain LS31 rapidly degraded a wide range of AHLs, including N-3-oxo-hexanoyl-l-homoserine lactone (OHHL), whereas Rhodococcus sp. strain PI33 showed relatively less activity towards 3-oxo substituents. Coculture of strain LS31 with Erwinia carotovora effectively reduced the amount of OHHL and pectate lyase activity, compared with coculture of strain PI33 with E. carotovora. A mass spectrometry analysis indicated that both strains hydrolyzed the lactone ring of AHL to generate acylhomoserine, suggesting that AHL-lactonases (AHLases) from the two Rhodococcus strains are involved in the degradation of AHL, in contrast to R. erythropolis W2. To the best of our knowledge, this is the first report on AHLases of Rhodococcus spp.     

Detection of quorum sensing systems of bacteria isolated from fouled marine organisms

N-Acyl homoserine lactones (AHLs or N-AHLs) are a class of signaling molecules involved in bacterial quorum sensing (qs) that have recently been proposed as mediators of the fouling process. In this study, we determined the presence of AHLs in the following marine bacteria strains, which were collected in Santa Marta Bay (Colombia) from heavily fouled surfaces: Ochrobactrum sp., Vibrio sp. (23-6PIN), Vibrio campbellii, Vibrio sp. (11-6DEP), Ochrobactrum pseudogringnonense, Shewanella sp., Vibrio harveyi and Alteromonas sp. The detection and identification of AHLs was conducted using the microbial biosensor Escherichia coli (pSB401) and GC–MS and HPLC-MS analyses. We found that all isolated marine strains had quorum sensing systems mediated by either N-butanoyl homoserine lactone or N-hexanoyl homoserine lactone and in some cases by both. These results are in agreement with the theory that qs is involved in the fouling process. It is noteworthy to mention that we identified qs systems for the first time in bacteria of the genera Ochrobactrum and Alteromonas.     

Bacillus megaterium CYP102A1 oxidation of acyl homoserine lactones and acyl homoserines

Quorum sensing, the ability of bacteria to sense their own population density through the synthesis and detection of small molecule signals, has received a great deal of attention in recent years. Acyl homoserine lactones (AHLs) are a major class of quorum sensing signaling molecules. In nature, some bacteria that do not synthesize AHLs themselves have developed the ability to degrade these compounds by cleaving the amide bond or the lactone ring. By inactivating this signal used by competing bacteria, the degrading microbe is believed to gain a competitive advantage. In this work we report that CYP102A1, a widely studied cytochrome P450 from Bacillus megaterium, is capable of very efficient oxidation of AHLs and their lactonolysis products acyl homoserines. The previously known substrates for this enzyme, fatty acids, can also be formed in nature by hydrolysis of the amide of AHLs, so CYP102A1 is capable of inactivating the active parent compound and the products of both known pathways for AHL inactivation observed in nature. AHL oxidation primarily takes place at the omega-1, omega-2, and omega-3 carbons of the acyl chain, similar to this enzyme's well-known activity on fatty acids. Acyl homoserines and their lactones are better substrates for CYP102A1 than fatty acids. Bioassay of the quorum sensing activity of oxidation products reveals that the subterminally hydroxylated AHLs exhibit quorum sensing activity, but are 18-fold less active than the parent compound. In vivo, B. megaterium inactivates AHLs by a CYP102A1 dependent mechanism that must involve additional components that further sequester or metabolize the products, eliminating their quorum sensing activity. Cytochrome P450 oxidation of AHLs represents an important new mechanism of quorum quenching.