桃蛀螟成虫Orco嗅觉受体基因的克隆及组织表达谱分析

【目的】克隆桃蛀螟Conogethes punctiferalis (Guenée)的Orco嗅觉受体基因, 并研究其在不同组织的表达谱。【方法】利用PCR技术克隆桃蛀螟触角Orco基因, 对该基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析, 并利用荧光定量PCR技术分析该基因在的表达量。【结果】获得桃蛀螟成虫Orco的cDNA全长序列, 并命名为CpunOrco（GenBank登录号： JX101681）。该基因的开放阅读框全长1 425 bp, 编码475个氨基酸, 序列中有7个跨膜区。对桃蛀螟成虫不同组织中CpunOrco的荧光定量PCR结果表明, CpunOrco主要在触角和下颚须中表达, 雄虫触角中的表达量高于雌虫, 并且该基因在其他组织中也有一定的表达。【结论】本研究明确了该嗅觉受体基因在桃蛀螟成虫不同组织内的表达水平, 为进一步研究其功能提供了理论依据。     

棉铃虫齿唇姬蜂嗅觉受体基因 CchlOrco 的克隆及组织表达谱分析

【目的】昆虫的嗅觉受体（olfactory receptors, ORs）一般以气味分子特异的ORs与共受体（ co-Receptor, Orco）通过形成异质二聚体在嗅觉感受中发挥关键作用,其中Orco由于具有序列的保守性而受到广泛的重视。本研究旨在克隆棉铃虫齿唇姬蜂 Campoletis chlorideae 的Orco基因,并对其组织表达谱进行分析。【方法】利用RT-PCR技术和转录组分析技术克隆棉铃虫齿唇姬蜂的Orco基因,并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;利用Real-time PCR技术对该基因在该蜂成虫不同组织中的表达量进行分析。【结果】获得了棉铃虫齿唇姬蜂 Orco 的全长cDNA序列,命名为 CchlOrco（GenBank登录号：KP255444）。序列分析表明, 该基因开放阅读框全长1 437 bp,编码478个氨基酸,预测该氨基酸序列具有7个跨膜区。CchlOrco 主要在成虫触角中表达,且在雄蜂触角中的表达量最高,是雌蜂触角中表达量的8.0倍,而在其他组织中表达量极低。【结论】本研究克隆了棉铃虫齿唇姬蜂 CchlOrco 序列全长,明确了其在成虫不同组织中的表达水平,为进一步研究该基因及其他嗅觉受体基因功能奠定了基础。     

绿豆象气味受体基因的克隆和时空表达谱

【目的】本研究旨在克隆绿豆象Callosobruchus chinensis触角4个普通气味受体(odorant receptor, OR)基因,明确这些OR基因在绿豆象不同日龄雌雄成虫组织中的表达谱,为进一步研究基因功能奠定基础。【方法】基于绿豆象成虫触角转录组数据,预测绿豆象OR候选基因;利用RT-PCR克隆绿豆象4个OR基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;利用qPCR检测这4个OR基因在绿豆象雌雄成虫不同组织(触角、不含触角的头、腹、足和翅)中以及1, 3和5日龄雌雄成虫触角中的表达量。【结果】根据预测的基因序列,克隆得到4个绿豆象气味受体基因的cDNA全长序列,分别命名为CchiOR8,CchiOR10,CchiOR16和CchiOR39,GenBank登录号分别为MW732665, MN832705, MW732664和MN832706;编码的氨基酸数目分别为369, 352, 400和367。系统发育树分析表明,CchiOR8, CchiOR10和CchiOR16均与大猿叶甲Colaphellus bowringi的同源蛋白亲缘关系较近,而CchiOR39与果...     

双委夜蛾气味结合蛋白AdisOBP6的原核表达抗体制备及表达谱分析

【目的】本研究旨在对双委夜蛾Athetis dissimilis气味结合蛋白OBP6进行原核表达、抗体制备以及表达谱分析,便于今后对AdisOBP6功能展开研究。【方法】利用生物信息学软件分析AdisOBP6蛋白结构特征;利用通过原核表达获得的重组蛋白4次免疫新西兰大白兔,制备AdisOBP6抗体;采用荧光定量PCR和Western blot技术检测AdisOBP6在双委夜蛾雌雄成虫触角、不同时期精巢以及受精卵和未受精卵中的表达情况。【结果】同源建模预测显示,AdisOBP6具有6个保守半胱氨酸残基和7个α-螺旋结构,并 折叠成一个结合口袋。原核表达结果显示,在20℃下0.5 mmol/L IPTG诱导重组蛋白表达量最多、最稳定。4次免疫重复中,抗体效价分别超过1∶512 000, 1∶512 000, 1∶512 000和1∶64 000。Westernblot检测获得的抗体与AdisOBP6蛋白能够特异性结合。荧光定量PCR结果显示,AdisOBP6在双委夜蛾精巢中的表达量远高于在触角中的,在幼虫期精巢中AdisOBP6就已经开始表达,在蛹期精巢中表达量低于在幼虫期的, 成虫羽化后精巢中的表达量逐渐进入高峰,在未受精卵和受精卵中几乎不表达或表达量极低。Western blot分析发现,AdisOBP6蛋白也主要在精巢中表达,在雌雄成虫触角、受精卵和未受精卵中表达量很低。【结论】本研究实现了AdisOBP6的原核表达,成功地制备了抗体;并证实AdisOBP6在双委夜蛾精巢中大量表达,成虫羽化后表达量达到高峰,推测AdisOBP6可能参与了授精过程。本研究结果为今后进一步研究AdisOBP6的功能奠定了基础。     

绿豆象气味结合蛋白基因的克隆及表达分析

【目的】对绿豆象Callosobruchus chinensis气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)基因进行克隆、鉴定和组织表达分析,为研究OBPs在绿豆象嗅觉感受过程中的功能奠定基础。【方法】基于绿豆象触角转录组数据,通过RT-PCR克隆绿豆象6个OBP基因并进行生物信息学分析;通过qRT-PCR分析OBP基因在绿豆象雌雄成虫头(不含触角)、触角、腹、足和翅各组织中的表达情况。【结果】获得了6个绿豆象OBP基因的开放阅读框,命名为CchiOBP1-CchiOBP6(GenBank登录号: MN832700-MN832703, MN901841-MN901842);CchiOBP5为一段C端不完整的Minus-C OBP,其余均属于完整的Classical OBPs,预测6个CchiOBPs均含有信号肽。系统发育分析表明CchiOBP1, CchiOBP2和CchiOBP5与叶甲科(Chrysomelidae)昆虫OBPs的亲缘关系较近,CchiOBP3, CchiOBP4和CchiOBP6与天牛科(Cerambycidae)昆虫OBPs的亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明,6个CchiOBPs基因在绿豆象成虫的触角、头(不含触角)、腹、翅和足部均有不同的表达量,CchiOBP1-4和CchiOBP6在雌雄成虫触角中均呈现高表达,且极显著高于在其他组织中的。CchiOBP5在雌成虫触角和头部(不含触角)中呈现高表达,但在雄成虫中表现为在足部的表达量显著高于在其他组织中的,在触角中的表达量最低。【结论】确定了绿豆象6个CchiOBPs基因的核苷酸和氨基酸序列组成,其中有5个CchiOBPs基因在绿豆象雌雄成虫触角中高表达,推测其在绿豆象嗅觉识别寄主植物过程中发挥重要作用。     

利用原核表达系统制备家蚕非典型嗅觉受体Orco抗原蛋白

【目的】探索建立一种有效制备昆虫非典型嗅觉受体Orco抗原的方法,为Orco蛋白组织定位及功能研究奠定基础。【方法】设计带有BamH I和Hind III酶切位点的引物,采用RT-PCR方法扩增家蚕Bombyx mori Orco第 4-5跨膜区之间的基因片段,将其与原核表达载体pET-28a(+)双酶切处理后进行连接,然后转化大肠杆菌Escherichia coli感受态细胞DH5α,重组质粒再转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE检测诱导蛋白,用 HisTrap HP亲和层析对诱导表达的大量蛋白进行纯化。【结果】 在大肠杆菌原核表达系统中,用IPTG诱导获得了与预测蛋白大小相符的目的蛋白,经SDS-PAGE检测发现目的蛋白以包涵体形式表达,在变性条件下经HisTrap HP亲和层析获得大量可用于抗体制备的纯化蛋白。【结论】利用原核表达系统可获得制备家蚕Orco抗体的抗原蛋白。     

中华蜜蜂Orco嗅觉受体基因的克隆、表达及亚细胞定位

【目的】克隆鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana的Orco嗅觉受体基因, 并对其在工蜂触角上进行免疫荧光定位。【方法】利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂Orco基因, 并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析, 使用Real-time PCR技术鉴定其在中华蜜蜂不同发育时期及不同组织的表达谱; 利用免疫荧光定位技术在中华蜜蜂工蜂触角中对Orco进行亚细胞定位。【结果】获得中华蜜蜂Orco基因的全长cDNA序列, 命名为AcerOrco (GenBank登录号： JF968610.1), 其全长为1 434 bp, 编码477个氨基酸, 预测其含7个跨膜结构以及4个位于细胞膜外的亲水区。表达谱分析显示, AcerOrco在卵、 幼虫和蛹期呈低丰度表达, 1日龄及内勤蜂时期主要在触角和足中表达, 且在1日龄的触角中表达量最高; 采集蜂时期的触角、 头(去除触角)、 胸、 腹和翅中均有较高丰度的表达。亚细胞定位结果显示, AcerOrco不仅在采集蜂触角鞭节上大量表达（尤其在触角鞭节第1亚节中表达量较高）, 而且常成对出现, 并且发现AcerOrco可能主要在触角毛形感器的外部神经元(outer dendrite, OD)以及板形感器的树突神经元中表达。【结论】成功克隆了AcerOrco基因全长, 获得了其表达谱, 且将其定位于工蜂采集蜂的触角感器神经元上, 最终推测AcerOrco与中蜂嗅觉发育和触角感器功能密切相关。     

悬铃木方翅网蝽触角气味结合蛋白基因鉴定

【目的】悬铃木方翅网蝽Corythucha ciliata是专性危害悬铃木属Platanus植物的外来入侵害虫,本研究旨在获得该害虫触角中气味结合蛋白(OBPs)基因信息,以期寻求有效控制害虫的嗅觉分子靶标。【方法】利用Illumina HiSeq~(TM) 4000高通量测序技术对悬铃木方翅网蝽雌雄成虫触角进行转录组测序并对测序结果进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR(qPCR)方法,分析OBP基因在悬铃木方翅网蝽雌雄成虫触角中的表达模式。【结果】对悬铃木方翅网蝽雌雄成虫触角6个样品的转录组测序,共获得40.87 Gb clean reads,各样品的序列长度均达到6.31 Gb。转录组数据分析共鉴定出26个推测的悬铃木方翅网蝽OBP基因,其编码蛋白中24个(CcilOBP1-24)属于Classic OBPs,CcilOBP25/26属于Plus-C OBPs;与半翅目其他昆虫相关OBPs系统发育分析表明,大部分CcilOBPs形成独立一簇,少数与其他半翅目昆虫OBPs直系同源。qPCR分析显示,有11个OBP基因在雌雄成虫触角中表达量差异显著,其中有9个OBP基因(CcilOBP5/6/9/10/17/18/21/24/25)在雄成虫触角中显著高表达,有2个OBP基因(CcilOBP14/16)在雌成虫触角中显著高表达。【结论】本研究获得了悬铃木方翅网蝽成虫触角气味结合蛋白基因信息,研究结果为生物控制该害虫提供了重要基础数据和候选分子靶标。     

梨小食心虫Minus-C气味结合蛋白的分子克隆、表达谱及结合特性分析

【目的】通过克隆梨小食心虫Grapholita molesta的Minus-C气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,并测定其在成虫不同组织中的表达量及其重组蛋白对气味配体的结合能力,推测其嗅觉生理功能。【方法】基于梨小食心虫雌虫触角转录组测序数据,利用RT-PCR克隆MinusC OBP基因的完整编码区;qPCR测定该基因在成虫不同组织[触角、头(去除触角)、胸、腹、足、翅]中的表达量;构建原核表达系统表达重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达和纯度;运用荧光竞争结合实验测定重组蛋白与35种气味配体的结合能力。【结果】成功克隆了梨小食心虫的一个Minus-C OBP基因,命名为GmolOBP14(GenBank登录号:MF066361)。GmolOBP14开放阅读框长411 bp,编码136个氨基酸,成熟蛋白具有4个保守的半胱氨酸残基,属于Minus-C OBP亚家族。GmolOBP14在雌雄成虫的不同组织中均有表达,但在雄成虫翅和雌成虫触角中的表达量显著高于同性别的其他组织。重组蛋白GmolOBP14与气味配体的结合谱较窄,仅能与16种配体表现出不同程度的结合活性,其中与梨酯和十二醛的结合能力较强,解离常数Ki分别为6.92和12.74μmol/L;与癸醛、十四醛、顺-3-己烯-1-醇、苯甲醇和己酸丁酯有中等程度的结合活性,Ki分别为25.54,20.61,24.35,23.44和23.33μmol/L;GmolOBP14对性信息素组分没有结合活性,提示该蛋白不参与对性信息素的感受和识别。【结论】根据GmolOBP14基因的组织表达特点及其重组蛋白的结合特性,推测GmolOBP14除具有选择性结合和运输寄主植物挥发物的作用外,还参与与嗅觉无关的生理过程。     

疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7的组织表达谱及配体结合特性分析

【目的】明确疆夜蛾Peridroma saucia Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7在不同化学感受器官中的表达谱，解析PsauOBP7重组蛋白的气味结合特异性。【方法】通过qRT-PCR检测PsauOBP7在疆夜蛾雌蛾和雄蛾的触角、口器、足和翅中的表达谱。原核表达并纯化PsauOBP7重组蛋白，利用Western blot检测PsauOBP7在疆夜蛾不同龄期幼虫头部及成虫不同组织中的表达情况；通过荧光竞争结合实验检测PsauOBP7重组蛋白对39种气味化合物的结合能力。【结果】成功表达并纯化PsauOBP7重组蛋白。qRT-PCR及Western blot检测显示PsauOBP7表达于4-6龄幼虫头部及雌雄成虫的触角、口器、足和翅中。荧光竞争结合实验显示PsauOBP7与反-2-己烯醛的结合能力最强，Ki=1.4 μmol/L。此外，PsauOBP7与5种酯类化合物乙酸月桂酯、顺-3-己烯乙酸酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸己酯和肉桂酸甲酯有一定的结合能力，Ki值分别为5.7, 6.5, 8.9, 9.5和10.2 μmol/L。PsauOBP7与两种醇类化合物顺-3-己烯-1-醇和法尼醇也有较强的结合能力, Ki值分别为5.8和5.9 μmol/L。【结论】疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7表达于其幼虫和成虫的多种化学感受器官中，且能结合多种植物气味化合物，说明其在疆夜蛾寻找寄主植物过程中发挥重要作用。     

小地老虎化学感受蛋白AipsCSP8的表达及配体结合特性分析

【目的】本研究旨在解析小地老虎Agrotis ipsilon化学感受蛋白AipsCSP8的表达谱及配体结合特征。【方法】利用qRT-PCR方法测定了AipsCSP8在小地老虎成虫头、胸、腹、足、翅、性腺(附腺)、触角、喙和下唇须以及雌雄虫羽化前后触角中的表达水平。体外重组表达AipsCSP8蛋白,通过荧光竞争结合实验测定重组蛋白AipsCSP8对24种性信息素、22种植物挥发物和10种化学农药的结合特性。【结果】qRT-PCR检测结果显示,AipsCSP8在小地老虎雄成虫的足和下唇须中表达量最高,在附腺和触角中的表达量次之;在雌成虫的触角中表达量最高,在足、性腺、下唇须中的表达量次之。另外,雄、雌虫触角中AipsCSP8表达量分别在成虫羽化前1 d和羽化当天达到顶峰。荧光竞争结合实验结果表明,重组蛋白AipsCSP8对植物挥发物邻苯二甲酸-丁酯(解离常数Ki=14.6 μmol/L)、苯乙醛(Ki=17.2 μmol/L)以及化学农药阿维菌素(Ki=12.9 μmol/L)均有较强的结合能力。【结论】化学感受蛋白AipsCSP8可能参与小地老虎嗅觉行为及味觉识别,并可能在小地老虎感受化学农药的过程中发挥作用。     

中华按蚊气味结合蛋白基因AsinOBP1的克隆和表达分析

【目的】蚊虫的行为在很大程度上依赖于嗅觉系统, 例如寻找宿主和产卵场所等。中华按蚊Anopheles sinensis是我国最重要的传疟媒介之一, 但有关中华按蚊嗅觉信号传递过程的研究甚少。本研究旨在克隆和表达分析中华按蚊的气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）基因, 为进一步研究中华按蚊嗅觉传递的分子机制奠定基础。【方法】通过分析中华按蚊的转录组数据克隆气味结合蛋白基因, 采用RT-PCR和实时定量PCR技术分析该基因在成虫不同组织和在吸血前后的表达模式。【结果】克隆到一个气味结合蛋白基因, 命名为AsinOBP1 (GenBank登录号为KJ958382)。AsinOBP1基因开放阅读框长435 bp, 编码144个氨基酸, 具有典型的6个半胱氨酸位点。RT-PCR组织表达谱分析发现, AsinOBP1在检测的所有成虫触角、下颚须、喙和头部组织中都有表达, 而在足和去掉头部以外的躯体组织中不表达。定量分析发现AsinOBP1在雌蚊触角中的表达水平最高, 吸食血液后, AsinOBP1的表达水平显著下降; 仅用小鼠气味处理后, AsinOBP1的表达水平也显著下降。【结论】研究结果说明AsinOBP1可能是嗅觉组织特异性表达的基因, 与雌蚊寻找宿主等行为有关, 其功能还需深入研究。     

花椒窄吉丁触角转录组及嗅觉相关基因分析

【目的】建立花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi成虫触角转录组数据库,挖掘嗅觉相关基因,为今后研究其触角的化学感受机制及生物防控提供理论支撑。【方法】采用高通量测序平台IlluminaNovaSeq 6000对花椒窄吉丁雌雄成虫触角进行转录组测序,用Trinity软件对获得的高质量reads进行序列拼接与组装;使用BLAST软件将触角转录组数据比对NR, NT, Swiss-Prot, GO, KEGG, BLASTX,eggNOG, Pfam, TmHMM, SignalP, KO, Map, BLASTP和RNAMMER公共数据库;基于初步筛选到的花椒窄吉丁候选气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)和化学感受蛋白(chemosensory protein, CSP)以及其他鞘翅目昆虫的同源蛋白的核苷酸序列,利用MEGA软件进行系统进化分析。运用RPKM (reads perkilobase per million mapped reads)值对嗅觉相关基因表达量进行分析。【结果】花椒窄吉丁雌雄成虫触角转录组测序共获得36 209条基因和90 982条转录本,其N₅₀分别为2 103和2 523 bp,组装完整性较高。注释到NR数据库的基因最多(41.62%),其中与赤拟谷盗Tribolium castaneum相似基因所占比例最高(19%)。在GO数据库中比对到11 614个基因,按功能分为细胞组分、分子功能与生物学进程三大类57个分支,其中分子功能大类中的结合(70.57%)与催化活性(45.51%)相关基因占比最多;KEGG代谢途径分析表明,7 427条基因参与了5类代谢通路,其中涉及信号转导的基因最多,为815条;筛选到7个候选OBP基因和5个具有全长开放阅读框的CSP基因,其编码蛋白均具有化学感受蛋白家族的典型特征。系统进化分析表明,花椒窄吉丁OBPs和CSPs分别与苹果小吉丁A. mali的OBPs和CSPs氨基酸序列一致性最高。RPKM值表明,嗅觉相关基因AzanOBP1和AzanOBP2在雌成虫触角中不表达,在雄成虫触角中微量表达;AzanOBP3在雄成虫触角中高丰度表达。【结论】首次获得了花椒窄吉丁成虫触角转录组数据,筛选到了花椒窄吉丁OBP, CSP, Or, IR和SNMP等的嗅觉相关基因。推测触角中高丰度表达的OBPs对雄成虫识别同类异性释放的信息素或寄主植物释放的挥发物起关键作用。研究结果可为花椒窄吉丁化学感受基因功能分析及嗅觉感受机制研究奠定分子基础。     

梨小食心虫普通气味受体基因GmolOR20的克隆及表达分析

【目的】通过克隆梨小食心虫Grapholita molesta触角中的普通气味受体(odorant receptor, OR)OR20基因,明确其在不同发育期及成虫不同组织中的表达特征,为进一步研究其功能提供理论依据。【方法】根据梨小食心虫雌虫触角转录组数据,利用RT-PCR克隆梨小食心虫OR20基因的完整开放阅读框;采用qRT-PCR检测该基因在不同发育期(卵、1-5龄幼虫、蛹和雌雄成虫)、成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足、翅)以及不同日龄(1, 3, 5和7日龄)成虫触角中的表达量。【结果】克隆获得梨小食心虫GmolOR20基因cDNA序列(GenBank登录号:MH898864)。该基因完整开放阅读框为1 284 bp,编码427个氨基酸,预测蛋白分子量为49.83 kD,理论等电点为8.57,具有7个跨膜结构域。序列比对和系统进化树结果表明,梨小食心虫GmolOR20与苹果蠹蛾Cydia pomonella CpomOR15和豆荚小卷蛾Cydia nigricana CnigOR15亲缘关系较近,氨基酸序列一致性分别为87%和84%。发育表达模式结果显示,GmolOR20在不同发育时期均有表达,雌雄成虫中的表达量显著高于其他发育期的表达量(P<0.05),但雌、雄虫间的表达量差异不显著。组织表达模式结果表明,GmolOR20主要在成虫触角中高丰度表达,且雌虫触角中的表达量极显著高于雄虫触角中的表达量(P<0.01);GmolOR20在不同日龄成虫的触角中均有表达,且在1和3日龄成虫触角中的表达水平显著高于其他日龄(P<0.05)。【结论】根据GmolOR20基因的表达谱分析结果,推测GmolOR20可能参与梨小食心虫对植物挥发物和性信息素的识别。