大鼠脂肪间充质干细胞的鉴定及肝内移植的研究

目的:从脂肪组织中获取间充质干细胞(ADMSCs)并验证其多向分化潜能,探讨ADMSCs在肝再生中的作用。方法:获取大鼠脂肪组织,用胶原酶消化法获取干细胞,并进行体外扩增、传代,取第3代细胞分别用不同诱导培养液进行成骨、成脂诱导,诱导后通过细胞形态学和特殊染色观察诱导效果。用PKH26标记细胞,制作部分肝切除模型,将标记的自体ADMSCs经门静脉植入体内,2周后切下取肝脏制成冰冻切片,荧光显微镜观察植入细胞在肝脏的定位,免疫荧光染色观察其白蛋白的表达。结果:从脂肪组织中分离出的细胞能在体外大量扩增,能被诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞,ADMSCs移植2周后,可见PKH26标记细胞散在分布于肝内,免疫荧光染色显示标记细胞白蛋白染色阳性。结论:大鼠脂肪组织中可以获取具有多向分化潜能的间充质干细胞,该细胞在肝再生环境中能向肝细胞分化,参与肝再生。     

大鼠脂肪间充质干细胞在体内向肝细胞样细胞方向的转化

目的:探讨大鼠脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)在体内向肝细胞样细胞转化的可能性.方法:将从4周龄雄性SD大鼠腹股沟分离得到的原代脂肪间充质干细胞传至第3代,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)在体外标记后,通过门静脉注射的方法移植入由四氯化碳造成慢性肝损伤的雄鼠体内.移植术后2周处死受体雄鼠,取其肝组织.通过免疫荧光双染色的方法观察BrdU标记细胞的存在和白蛋白的表达,以确定所注入的脂肪间充质干细胞在受鼠体内向肝细胞样细胞转化的情况.结果:在经门静脉注射法进行移植的实验组SD大鼠的肝组织内检测到同时表达BrdU和白蛋白的细胞.讨论:本研究证明了脂肪间充质干细胞在体内有向肝细胞样细胞转化的可能.     

大鼠脂肪间充质干细胞诱导为类肝细胞及其细胞片的制备

成体多能干细胞,如来自骨髓和脂肪组织的间充质干细胞等具有多向分化的潜能。虽然自体干细胞移植已经发展成为器官移植的有效代替疗法之一,但是由于移植位点细胞的流失和分化条件的限制等问题使得这种疗法的效率大大降低。本研究目的是将由脂肪干细胞分化而来的类肝细胞制备成具有稳定细胞性状的可移植的肝细胞片。首先在体外分离扩增脂肪干细胞,并通过控制严格地分化条件获得类肝细胞。然后将此细胞接种到聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)结合的细胞培养皿表面,通过调节培养温度到20oC,使细胞成片脱离培养皿形成细胞片。对细胞片进行了常规HE染色和免疫组化观察,结果显示:这类细胞片中平均含有2～3层细胞,并且保持了细胞外基质的完整。同传统的胰酶消化收集移植用细胞相比,细胞片方法极大地减少了对移植用细胞的细胞膜和细胞外基质的损伤,这将大大促进细胞片和原位组织的相互作用,增加细胞利用效率,从而有望提高治疗效果。     

脂肪间充质干细胞体外分化成心肌样细胞

探讨大鼠脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,AMSC）体外分化成心肌样细胞的潜能,为自体干细胞移植治疗心肌梗死提供理论基础.采用消化法分离大鼠AMSC,培养于RPMI1640生长培养基中,倒置相差显微镜观察细胞形态发现,随着培养时间的延长,细胞形态趋向于心肌细胞,SQ RT-PCR检测表达心肌特异性基因：β-肌球蛋白重链（β-MHC）、α-肌球蛋白重链（α-MHC）、心房利钠肽（ANP）、心肌肌钙蛋白（cTnT）、心肌肌动蛋白、肌肉增强因子和GATA-4;免疫细胞化学和免疫荧光染色检测表达心肌细胞特异性蛋白：结蛋白、横纹肌辅肌动蛋白、心肌肌动蛋白和间隙连接蛋白45(connexin 45);Western印迹检测表达心肌特异性蛋白Nkx2.5. 实验表明,大鼠AMSC在体外培养条件下能分化成心肌样细胞,在组织工程学及干细胞移植领域有着良好的应用前景.     

谷氨酸对大鼠脂肪干细胞诱导分化神经细胞的影响及机制

目的:研究谷氨酸(Glu)对大鼠脂肪干细胞Adipose-derived stem cells(ADCSs)诱导分化神经细胞的作用及机制。方法:取成年大鼠腹股沟脂肪组织进行体外细胞培养,采用免疫组化方法检测证实为ADSCs。对照组为正常培养的ADSCs并诱导分化神经细胞,谷氨酸(Glu)处理组加入不同浓度的Glu,MTT比色法观察脂肪干细胞的存活率。结果:从ADSCs诱导分化的细胞包括神经元及神经胶质细胞,免疫组化结果显示神经元特异性烯醇化酶(NSE)染色阳性和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色阳性。Glu处理组给药24h后,与对照组比较ADSCs存活率明显降低,50μmol·L-1Glu组细胞存活率为83.98%,与对照组比较差异无显著性(P>0.05);100及1000μmol·L-1Glu组干细胞存活率(分别为66.82%和17.08%)低于对照组(P<0.05,P<0.01)。结论:Glu对ADSCs有损伤作用,随着Glu剂量的增加,ADSCs的存活率逐渐降低,二者呈剂量依赖关系。     

一种体外快速分离脂肪来源干细胞的方法

目的:以小鼠为模型,建立一种基于流式细胞仪为检测手段的快速分离脂肪来源干细胞的方法,解决间充质干细胞进入实际应用过程中遇到的难题。方法:取BALB/c小鼠腹股沟内侧的皮下脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶消化等系列措施,获取脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)。所得细胞分离培养4代后,流式细胞仪分选出CD73+CD45-ADSCs后成骨诱导分化。碱性磷酸酶染色和实时荧光定量PCR检测其分化情况。结果:刚分离培养的ADSCs细胞普遍呈圆形或椭圆形,传至第三代的细胞,非MSCs细胞逐渐被淘汰,剩余的细胞形态逐渐变得一致,细胞形态呈梭形。流式细胞仪检测发现ADSCs细胞表面抗原标记CD73+CD45-为20.7%。所得的ADSCs成骨诱导分化后碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色呈阳性,实时荧光定量PCR检测成骨标志基因发现它们表达上调,其中ALP的表达高达22倍。结论:本方法可以获得纯度较高的ADSCs,且耗时少成本低;且提示可采用该方法来获得大量的人源ADSCs用于组织工程修复。     

体外诱导大鼠脂肪间充质干细胞向肝细胞方向分化的研究

目的:探讨大鼠脂肪间充质干细胞(ADMSCs)是否可以在体外被诱导向肝细胞方向分化。方法:从大鼠脂肪组织中分离出干细胞,行体外扩增、传代;用免疫荧光染色法检测其表面标志,用成纤维细胞生长因子(FGF-4)和肝细胞生长因子(HGF)诱导其向肝细胞分化;倒置显微镜观察细胞形态变化,诱导后14天和21天分别用免疫荧光检测法检测肝细胞标志物白蛋白的表达,每次换液时留取培养上清用尿素氮测试盒检测尿素氮含量。结果:免疫荧光检测显示从脂肪组织所获取的细胞表面标志CD29阳性,而CD31和CD145均为阴性;诱导14天后可逐渐观察到肝细胞样形态改变;免疫荧光检测到白蛋白表达;尿素氮检测显示诱导组尿素氮含量随时间延长而逐渐升高。结论:从大鼠脂肪组织中获取的脂肪间充质干细胞能在体外被诱导分化成形态、表型及功能与肝细胞相似的细胞。     

大鼠脂肪间充质干细胞的分离鉴定与生物学特性研究

脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞,在组织器官修复方面具有潜在应用前景。体外培养条件下脂肪间充质干细胞增殖活性和分化潜能的维持对其应用研究具有重要意义。该研究通过大鼠腹股沟部脂肪组织分离获得了脂肪间充质干细胞,并对其细胞生长曲线、细胞群体倍增时间、细胞克隆形成等进行了检测,从而筛选出细胞生长最适的血清及浓度;再进一步对筛选条件下培养的大鼠脂肪间充质干细胞进行了免疫荧光检测、流式细胞术分析和诱导分化能力鉴定。结果显示,大鼠脂肪间充质干细胞在20%血清浓度下生长状态最好,增殖较快,细胞群体倍增时间较短,细胞克隆形成率可达(27.33±0.58)%。分离的大鼠脂肪间充质干细胞中CD44、CD90、CD106的阳性率分别为99.12%、99.59%、65.81%,CD34分子呈阴性。诱导后,细胞经油红O、碱性磷酸酶、阿新兰染色,结果表明,细胞具有向脂肪、骨、软骨方向分化的潜能。以上结果表明,成功建立了大鼠脂肪间充质干细胞系。     

尿源性干细胞移植修复慢性肝损伤裸鼠肝脏功能

该研究探讨尿源性干细胞(urine-derived stem cells, USCs)的生物学性状及移植治疗慢性肝损失模型的可能。分离培养USCs,观察细胞形态、流式细胞术检测干细胞表面标记,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色、茜素红染色、油红O染色、ICG(indocyanine green)摄取实验、PAS(periodic acid-Schiff)染色等评估其成骨、成脂和成肝分化。建立四氯化碳(carbon tetrachloride,CCL4)诱导的慢性肝损伤模型,尾静脉4次移植USCs,计算肝脏指数,检测血清ALT、AST, HE及Masson染色,评估治疗效果。结果表明, USCs为米粒状贴壁生长细胞,表达多种间充质干细胞标志物:CD24、CD29、CD73、CD90和CD105,表达细胞周期表面标志物CD146,不表达造血细胞表面标志物CD31、CD34、CD45。成骨成肝诱导的USCs后ALP染色、茜素红染色、油红O染色阳性,单纯成肝诱导后几乎无ICG摄取及PAS染色阳性的细胞,而与肝干细胞共培养的USCs诱导组中,约10%细胞有ICG摄取及PAS染色阳性。与模型组相比, USCs移植组肝脏指数显著降低, ALT、AST降低但无统计学意义,肝细胞退行性变及纤维增生明显改善。该研究成功分离培养出增殖能力强并具有多向分化潜能的USCs,移植入慢性肝损伤裸鼠,可在一定程度上修复肝脏损伤。     

脂肪来源干细胞体外成骨和成脂及成神经的诱导分化研究

目的:探讨脂肪来源干细胞体外成骨和成脂及成神经的诱导分化情况。方法:选取10只SPF级雄性SD大鼠,将其不同部位的脂肪组织取出,分别采用不同方法对其向成骨、成脂及成神经等方向进行诱导分化并对其结果进行鉴定。结果:ADSC表达中,CD29占(99.11±0.13)%,CD44占(95.94±0.71)%,CD45占(0.12±0.09)%。经4周的成骨诱导后,茜素红S染色在细胞团中央发现红色钙化结节存在,碱性磷酸酶染色在细胞的胞质内观察到紫红色颗粒,经7d成脂诱导后,油红"O"染色在细胞质内观察到橙红色脂滴;经过6d的神经干培养基诱导后,通过免疫荧光染色证明诱导的Nestin细胞、神经丝蛋白-200以及GFAP等均出现阳性表达。结论:ADSC具备向脂肪、成骨及神经元等细胞进行多向分化的潜能,具有来源广、易于操作、体外增殖快速等优越性,并且不存在免疫排斥及医学伦理学问题,发展前景广阔。     

磁纳米颗粒标记脂肪干细胞向软骨分化及体外MRI示踪的实验研究

目的:探讨磁纳米颗粒(magnetic iron oxide particles,MIOP)体外标记脂肪间充质干细胞(ASCs)向软骨分化及MRI示踪的可行性。方法:从小鼠脂肪组织中分离培养、扩增脂肪间充质干细胞(ASCs),流式鉴定细胞表型后,分别采用不同浓度(25μg/mL,50μg/mL)的MIOP标记ASCs并向软骨细胞诱导分化。普鲁士蓝染色和透射电镜(TEM)鉴定细胞内磁纳米铁颗粒分布情况,应用3.0T MRI体外检测标记软骨细胞MRI信号。结果:从脂肪组织中可以分离获得大量高表达CD90、CD105、Sca-1的ASCs,不同浓度(25μg/mL,50μg/mL)的MIOP与ASCs共同孵育24小时后,普鲁士蓝染色发现ASCs随MIOP浓度的增加,蓝染程度逐渐加深且标记的ASCs可以向软骨细胞分化;TEM证实细胞内分布大量的黑色纳米铁颗粒。体外MRI T2序列证实随着MIOP浓度(25μg/mL,50μg/mL)的增加MRI信号值逐渐减低且具有统计学差异(P0.05)。结论:MIOP可以标记ASCs向软骨分化,体外应用MRI可以对其进行示踪。     

大鼠脂肪干细胞向雪旺细胞诱导分化能力的研究

目的：研究脂肪干细胞（ADSCs）向雪旺细胞的诱导分化,为神经组织工程提供新的种子细胞。方法：取SD大鼠项背处的皮下脂肪,分离出脂肪干细胞并培养传代,流式细胞仪检测细胞表面特异标记CD29,CD34,CD44,CD45,CD90,以评价干细胞的生物学特性;采用b-FGF和forskolin等诱导脂肪干细胞向雪旺细胞分化,光镜观察诱导后细胞形态的变化;免疫荧光染色鉴定雪旺细胞特异性标记物S100、P75和GFAP的表达;PCR检测诱导前后雪旺细胞特异性标记物S100、P75的表达。结果：分离培养的鼠脂肪干细胞CD29、CB90表达呈阳性,而CD34、CD44和CD45表达呈阴性,具有脂肪干细胞的生物学特性;脂肪干细胞经过胶质细胞生长因子的作用,光镜下发现诱导的细胞形态与雪旺细胞相似;免疫荧光染色S100、P75和GFAP阳性;RT-PCR结果显示诱导的雪旺细胞标记物S100和P75表达上调。结论：脂肪干细胞可诱导分化成雪旺细胞,其表型和分子特征与雪旺细胞相似,诱导分化的脂肪干细胞是一种理想的神经组织工程的种子细胞。     

大鼠ASC体外分离培养、鉴定及其双报告基因标记示踪

[目的]探索ASC高效分离方法,采用荧光基因标记法对分离的ASC进行标记、功能检测和示踪研究。[方法]通过优化脂肪组织的酶解消化条件,分别采用胶原酶、胰蛋白酶及组合对脂肪组织消化,检测细胞产量,并用流式细胞术进行鉴定。之后利用GFP-Fluc双报告基因对体外分离培养的ASC进行标记,鉴定其多项分化潜能。[结果]胶原酶、胰蛋白酶复合酶消化能够显著提高ASC分离效率,细胞产量较单一酶消化提高4~5倍。体外扩增培养ASC以表达CD29、CD90等为主。GFP-Fluc基因标记后的ASCs具有成脂肪、成骨分化潜能,可用于活体干细胞移植后的定量追踪。[结论]胶原酶、胰蛋白酶复合酶解法可以显著提高脂肪干细胞的原代分离效率4~5倍。     

脂肪干细胞在泌尿系统疾病中的研究进展

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是一类从脂肪分离出来的具有自我更新及多向分化潜能的成体干细胞,ADSCs具有高度的可塑性,可分化成多种类型的细胞。与其他干细胞相比,ADSCs具有来源充足,取材方便,供体易接受等独特优势,已成为基础医学及临床治疗的研究热点。ADSCs诱导分化和移植可有效治疗多种组织损伤性疾病,改善或修复器官功能,近年来ADSCs作为细胞疗法及组织工程的新型种子细胞在泌尿系统疾病治疗中取得了重大进展。本文重点讨论ADSCs的生物学特性及其在泌尿系统疾病中的应用前景。     

Exendin-4通过JNK和ERK信号通路增强大鼠脂肪来源干细胞的增殖

目的:探讨Exendin-4对大鼠脂肪来源干细胞的(Adipose-derived stem cells,ADSCs)增殖作用及其机制。方法:体外分离培养SD大鼠腹股沟处脂肪组织,流式细胞学方法鉴定分离的ADSCs,使用Exendin-4(Ex-4,0-50 nm/L)对P4代(第四代)ADSCs进行干预,采用MTT检测ADSCs的增殖情况,Western blot检测MAPK通路中JNK和ERK的磷酸化水平,使用相应的阻断剂来观测JNK和ERK通路对ADSCs增殖作用的影响。结果:分离培养的ADSCs高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD31、CD34和CD45,符合间充质干细胞的表型。Ex-4以浓度依赖方式促进ADSCs体外增殖,10 nm/L为最适促增殖处理浓度。同时,Ex-4可以提高细胞中c-Jun和ERK的磷酸化水平,而给予相应阻断剂后,磷酸化蛋白表达减弱,细胞增殖能力也明显减弱。结论:Ex-4可以通过JNK和ERK通路增强大鼠脂肪来源干细胞的增殖。     

脂肪干细胞上清液培养雪旺细胞的实验研究

目的:研究应用脂肪干细胞上清液培养新生小鼠雪旺细胞的可行性。方法:取新生(出生5-7天)C57BL/6小鼠的坐骨神经,采用0.2%的复合胶原酶NB4消化法分离获取细胞,然后应用雪旺细胞条件培养基(SCCM)和C57BL/6小鼠的脂肪干细胞上清液(ADSC-CM)分别培养雪旺细胞。用0.2%复合胶原酶NB4差速分离纯化这两种方法培养的雪旺细胞,每48 h纯化1次,共进行2次纯化。应用P75免疫荧光染色方法鉴别两组P2代雪旺细胞并比较两组雪旺细胞的纯度和生长情况。结果:脂肪干细胞上清液培养的雪旺细胞纯化两次后,数量明显增多,其纯度与雪旺细胞条件培养基相比没有明显差异(P0.05)。结论:脂肪干细胞上清液可以较好的培养雪旺细胞,可以作为一种新的廉价方便的培养基代替雪旺细胞条件培养基来培养许雪旺细胞。     

Nurr-1基因转染促进脂肪干细胞的神经分化

目的:研究孤儿核受体相关基因1(Nurr-1)对脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cells,ADSC)向神经元方向分化的潜在作用。方法:流式细胞术与成骨、成脂诱导技术鉴定脂肪干细胞;Nurrr-1基因转染脂肪干细胞后,应用神经特异性标志物MAP-2,β-tubulin的免疫荧光染色评估其向神经方向分化的能力。结果:流式细胞术结果表明培养的细胞CD29,CD44表达90%以上,CD45,CD90表达均低于1.5%,经过诱导后,油红O、茜素红S染色均呈阳性,表明所培养的细胞为脂肪干细胞;慢病毒转染Nurr-1基因后,免疫荧光染色检测MAP-2,β-tubulin的免疫荧光强度显著增加;RT-PCR结果显示Nurr-1转染的脂肪干细胞的MAP-2、β-tubulin、NF200的表达量显著提高。结论:Nurr-1基因转染能促进脂肪干细胞向神经方向分化,为神经损伤和神经退行性病变的治疗提供了新途径。     

羊膜细胞共培养诱导人脂肪干细胞向表皮分化

目的探讨羊膜细胞体外诱导人脂肪干细胞向表皮方向分化的可能性。方法体外分离培养人脂肪来源的干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs),将P3代hADSCs与人羊膜细胞(human amniotic cells,HACs)共培养,培养液中添加EGF,光镜下观察hADSCs细胞形态变化,并对细胞进行鉴定。结果随时间延续,hADSCs细胞数量逐渐减少,同时细胞突起逐渐变短,胞体由长梭形逐渐变为上皮样,21d后,经免疫荧光染色鉴定,发现所获细胞高表达CK19。结论通过人脂肪干细胞与人羊膜细胞共培养可获得CK19阳性的表皮干细胞。     

间充质干细胞对肝纤维化进展的调控机制

肝纤维化是各种病因引起肝损伤后细胞外基质沉积或瘢痕形成的过程,可持续进展为肝硬化,甚至肝癌等终末期肝脏疾病,严重危害人类健康。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一类具有多向分化潜能的多能干细胞,近年来被广泛应用于多种疾病治疗。现今,MSCs移植已被运用于肝纤维化治疗研究,治疗结局众说纷纭,其作用机制莫衷一是。现就MSCs通过免疫、炎症、归巢等途径对肝纤维化进展的调控机制做一综述。     

脂肪干细胞治疗心肌梗死的机制与新策略

介绍脂肪干细胞（ADSCs）治疗心肌梗死机制及用于提高心肌梗死治疗效果的新策略。广泛查阅近年关于ADSCs用于治疗心肌梗死的基础与临床实验研究文献,并进行整理、综合与分析。ADSCs移植治疗心肌梗死的机制研究取得了一定的进展,其机制主要包括分化为心肌细胞、参与梗死区血管形成、通过旁分泌功能改善梗死区微环境等。对ADSCs进行缺氧耐受预处理、使用新型生物材料、联合细胞因子以及药物等,可以大大提高移植细胞的存活率,促进细胞的增殖与分化,改善心肌梗死治疗效果,加快心脏功能的恢复。ADSCs可能通过多种机制发挥治疗心肌梗死的作用,进一步提高移植细胞成活率和性能稳定性是增加ADSCs治疗心肌梗死效果的关键。随着研究的不断深入,ADSCs可能为未来心肌梗死的临床治疗带来新的希望。