高山被孢霉的基因组及转录组的提取技术研究

基因组和转录组的高通量测序对样品的纯度和含量要求较高,旨在通过研究高山被孢霉在不同培养条件下和采用不同菌丝处理方法对其基因组和转录组质量的影响来确定最佳提取方式。结果表明,PDA培养基培养的菌丝与发酵培养基培养的菌丝经基因组提取后在琼脂糖凝胶电泳中有明显不同的表现,使用发酵培养基培养的菌丝提取的基因组DNA无降解,而以PDA培养基培养的菌丝提取的基因组DNA出现部分降解。在使用国产试剂盒做高山被孢霉转录组RNA提取实验中发现,使用液氮速冻后破碎菌丝并结合使用β-疏基乙醇更易提取到高浓度且无降解的转录组样品。     

哈茨木霉的培养及其对烟草疫霉生长的抑制研究*

哈茨木霉是一类重要的植病生防因子。哈茨木霉TH-1分别在PDA培养基、麦芽糖培养基、查氏培养基和琼脂培养基上培养均能产孢,其中PDA培养基为最适培养基。PDA培养基上,菌丝生长适宜温度27.5℃~35℃,最适温度32.5℃,产孢最适温度27.5℃。菌丝生长适宜pH值为3~7,产孢适宜pH值为5~9,生长与产孢最适pH值为5。光照对菌丝生长影响不大但明显影响菌株的产孢数量,光照时间越长产孢量越大。对峙培养试验表明TH-1明显抑制疫霉菌的生长速率,其无菌滤液明显抑制烟草疫霉菌游动孢子的萌发,并抑制游动孢子芽管     

过表达亚甲基四氢叶酸脱氢酶对高山被孢霉脂质合成的影响

高山被孢霉是一种富含多不饱和脂肪酸的丝状真菌,但其脂质过程中NADPH的来源还没有研究透彻。以高山被孢霉(尿嘧啶营养缺陷型)作为出发菌株,研究亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD1)对高山被孢霉脂质合成的影响。首先构建了过表达载体pBIG2-ura5s-MTHFD1,采用根癌土壤杆菌介导转化真菌的方法,将二元表达载体转化进高山被孢霉CCFM501中,在筛选培养基SC-CS平板上进行筛选,进而得到稳定遗传MTHFD1基因的过表达菌株(MA-MTHFD1);其次提取MA-MTHFD1菌株基因组进行PCR鉴定,并结合qPCR分析结果,表明MTHFD1基因成功在高山被孢霉中实现了过量表达;最后通过对MA-MTHFD1中的脂肪酸含量、NADPH含量及NADPH合成途径中相关基因转录水平进行分析,研究MTHFD1基因过表达对脂质合成的影响。实验结果表明,过表达MTHFD1基因可以提高高山被孢霉脂质合成能力。与原养型高山被孢霉相比,MA-MTHFD1菌株中脂肪酸含量提高了40.13%,NADPH的含量提高了26.45%,而且NADPH合成途径中其他相关基因苹果酸酶(ME)和异柠檬酸脱氢酶(IDH)的转录水平也发生了上调。这一系列研究结果表明,在高山被孢霉脂质合成还原力形成中,MTHFD1基因起到了关键作用。这为解析高山被孢霉中NADPH来源及深入研究脂质合成机制,从而对其胞内脂肪酸代谢通路进行分子水平上的改建提供了一定的理论依据。     

通气量对气升式反应器培养高山被孢霉生产花生四烯酸的影响

高山被孢霉具有很强的积累花生四烯酸(ARA)的能力,通过对30 L气升式反应器发酵过程的通气量进行调控,结果发现:通气量对高山被孢霉菌体生长、形态及ARA合成具有显著影响。中等大小的球形菌丝形态有利于菌体持续生长和油脂积累,ARA占总油脂的含量最高,而羽状菌丝形态菌体中总油脂含量和ARA含量均小于球形菌丝形态菌体中的含量。通气量为1.0 vvm(1 vvm为每分钟通气量与罐体实际料液体积之比)时有利于菌体保持良好形态和生长,通气量为1.4 vvm有利于发酵对数期后(72~168 h)ARA的积累。提出一种两阶段通气量控制策略,在气升式发酵罐中高山被孢霉的菌丝形态得到显著改善,ARA产量达到4.72 g/L,比对照提高了40.1%。     

一种经济快速提取丝状真菌基因组DNA的方法

以螺旋木霉(Trichoderma SpiraleXX)、小克银汉霉(Cunninghamella phaeospora MK)和卵形孢球托霉(Gongronella butleri XT)3种丝状真菌为材料,采用改进的CTAB法提取基因组DNA.方法改进后无需液氮、聚乙烯砒咯烷酮(PVP)和NaAc等试剂,过程简洁,且所需菌体量少,提取的DNA纯度较好,适用于一次微量提取多个样品的基因组DNA.此方法得到的基因组DNA可用于PCR扩增.     

哈茨木霉的培养及其对烟草疫霉生长的抑制研究

哈茨木霉是一类重要的植病生防因子。哈茨木霉TH-1分别在PDA培养基、麦芽糖培养基、查氏培养基和琼脂培养基上培养均能产孢,其中PDA培养基为最适培养基。PDA培养基上,菌丝生长适宜温度27．5℃～35℃,最适温度32．5℃,产孢最适温度27．5℃。菌丝生长适宜pH值为3～7,产孢适宜pH值为5-9,生长与产孢最适pH值为5。光照对菌丝生长影响不大但明显影响菌株的产孢数量,光照时间越长产孢量越大。对峙培养试验表明TH-1明显抑制疫霉菌的生长速率,其无菌滤液明显抑制烟草疫霉菌游动孢子的萌发,并抑制游动孢子芽管的伸长,TH-1对游动孢子萌发的相对抑制率为12．7％,对芽管生长长度的相对抑制率为63．1％。水解酶平板活性测定显示,TH-1产生β-1,3葡聚糖酶与纤维素酶,从而使烟草疫霉菌细胞壁的消解,产生非挥发性抗生素抑制烟草疫霉菌孢子萌发,但对菌丝生长影响不大。     

一种从PAXgene全血RNA管内提取基因组DNA的方法

目的:从同一生物样本同步提取RNA和DNA,能提高样本的利用率,而且对于基因组学、转录组学和表观遗传学检测数据之间的比对和匹配分析也十分重要。本研究在不影响RNA样品制备的前提下,建立一种从PAXgene全血RNA管内提取基因组DNA的方法。方法:取一定量PAXgene全血RNA管血液样本,使用QIAamp DNA试剂盒提取血细胞基因组DNA,系统优化提取过程中的离心参数、洗脱量以及初始血液样本量等实验参数,并对提取的基因组DNA质量进行检测。结果:用PAXgene全血RNA管3 mL血液样本能够提取出8.918±1.100μg基因组DNA,紫外分光光度计检测DNA样品的OD 260/280比值为1.89±0.09,琼脂糖凝胶电泳结果显示DNA样品完整无降解。结论:利用本方法提取的DNA样品能够满足下游DNA芯片、DNA甲基化测序等实验要求。该方法有助于从有限的临床血液样本中获取全面的遗传信息,并且提高后续不同实验方法所生成数据之间的可比性和匹配度。     

高温胁迫对刺芹侧耳菌丝生长及其抗棘孢木霉能力的影响

耐高温性是食用菌抗逆性评价的重要指标。选取5个刺芹侧耳菌株为材料,通过观测常温培养和高温胁迫后恢复培养菌落的生长速率、生长势、恢复生长时间、菌丝显微形态特征以及受棘孢木霉侵染情况,研究高温胁迫对刺芹侧耳菌丝生长及其抗棘孢木霉侵染能力的影响。结果表明,刺芹侧耳不同菌株对高温胁迫的响应存在差异。供试PDA培养的菌丝经高温胁迫(37℃,2d)后,菌丝恢复生长时间2–3d,生长势变壮或无变化,顶端菌丝细胞长度、直径、菌丝体分支频率和菌丝生长速率等均呈现不同程度的降低。菌丝生长速率变化与其抗棘孢木霉能力的下降呈正相关。在此基础上,模拟生产试验发现,长满菌丝的菌棒经高温胁迫(35℃,7d)后,接种棘孢木霉菌丝的侵染率变为100%,接种棘孢木霉孢子的侵染率变为30%;未经高温胁迫的菌棒,接种棘孢木霉孢子/菌丝,未发生侵染。本研究表明,高温胁迫导致刺芹侧耳菌丝抗棘孢木霉侵染能力的下降。本研究将为科学指导食用菌菌种繁育、菌棒生产提供数据支撑,为食用菌育种提供基础数据。     

高山被孢霉亚甲基四氢叶酸脱氢酶的克隆、表达和功能鉴定

叶酸代谢途径中的亚甲基四氢叶酸脱氢酶（MTHFD）可将5,10-亚甲基四氢叶酸氧化为5,10-甲炔基四氢叶酸,此过程会生成NADH或NADPH。对高山被孢霉中的MTHFD基因进行克隆、表达和功能鉴定,可进一步阐明脂质合成所需还原力NADPH的来源。首先对MTHFD序列进行分析,并以pET28a（+）质粒为载体构建了MTHFD的表达载体,然后转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。进一步利用Ni金属螯合层析纯化目的蛋白,采用比色法分析酶反应产物,表明纯化蛋白质具有MTHFD活性。高山被孢霉MTHFD对NAD⁺和NADP⁺均具有催化能力,但更偏好于将NADP⁺转化为NADPH。最后对高山被孢霉进行发酵培养,发现MTHFD的转录水平在脂质开始积累后发生了明显的上调,表明MTHFD在高山被孢霉脂质合成过程中发挥重要作用,很可能是脂质合成所需NADPH的关键来源。这为对高山被孢霉进行分子改造,使之成为高产各种多不饱和脂肪酸的细胞工程提供了理论依据。     

双玻片插片诱导新西兰匍柄霉产生分生孢子的方法

匍柄霉属(Stemphylium)是重要无性丝孢真菌类群,多数种菌难以诱导产生适宜形态学分类研究的分生孢子。以新西兰匍柄霉(Stemphylium eturmiunum)为材料,经适宜培养后(PDA培养基,25℃培养3~4 d),将双玻片斜插入生长适量菌丝的平板,延续培养3~4周后,进行玻片制作和显微描述,结果发现双玻片插片诱导培养处理后,匍柄霉种菌易产生充分发育的产孢细胞、产孢梗及适量的无性分生孢子。该技术方法简便易行,避免了选择性培养基诱导产生的缺陷,适宜于匍柄霉及其近似属若干难以产生无性分类特征的分类研究,为系统开展该类真菌系统分类研究提供技术借鉴。     

分离自黄瓜的多主棒孢霉不同表型菌株对杀菌剂的敏感性

【目的】通过对分离自黄瓜的多主棒孢霉不同表型菌株适宜生长温度、产孢量等表型特征和对8种杀菌剂的敏感性研究,为多主棒孢霉侵染引起的黄瓜叶斑病和茎疫病的化学防治提供技术支持。【方法】采用温度梯度法测定病菌适宜生长温度;采用PDA培养基25°C黑暗培养5 d和21 d,计测不同表型菌株单位面积产孢量;采用含药平板法测定不同表型菌株对8种杀菌剂的敏感性。【结果】分离自黄瓜的多主棒孢霉不同表型菌株适宜生长温度为25-30°C;在PDA平板25°C黑暗培养5 d,气生菌丝稀少型菌株cu-4、cu-5即大量产孢,产孢量明显多于气生菌丝丰茂型菌株;在试验浓度下,5个试验菌株对8种杀菌剂的敏感性依次为:代森锰锌氟硅唑戊唑醇苯醚甲环唑速克灵百菌清嘧菌酯多菌灵。【结论】分离自黄瓜的多主棒孢霉不同表型菌株在适宜生长温度、菌丝生长速度、产孢量及对杀菌剂的敏感性等方面均存在差异。在试验浓度下,供试菌株对多菌灵和嘧菌酯的敏感性极低(抑制率40%),这2种杀菌剂已失去对该地区黄瓜褐斑病的防控作用。     

古银杏内生真菌的分离及其抑菌活性

采用组织分离法从古银杏健康组织中分离得到55株内生真菌, 其中28个分离菌株在PDA培养基上不产孢子, 占总分离菌株的50.9%, 其它菌株根据其在PDA培养基上的培养特征, 10株被鉴定为青霉、6株为曲霉、4株为交链孢霉、3株为简梗孢霉, 另外酵母、毛霉、小单头孢霉、镰孢霉各1株。考察内生真菌培养上清对7种受试指示菌的抑制作用, 共筛选得到23株至少对一种指示菌的生长有抑制作用的菌株, 其中11株为不产孢真菌, 占活性菌株的47.83%。对活性最强的一株菌进行形态学和分子生物学鉴定, 将其确定为Xyla     

高山被孢霉产花生四烯酸发酵条件的研究

通过一株高山被孢霉M_(20)(Mortierella alpina)产花生四烯酸的摇瓶发酵研究,确定了其最佳发酵培养基组成及最适摇瓶发酵工艺条件。摇瓶实验确定的最佳培养基组成为(g/L):玉米粉水解液葡萄糖150,酵母粉15,KH_2PO_4 3.0,NaNO_3 3.0,MgSO_4·7H_2O 0.5。最佳发酵工艺条件为:初始pH6.5,装液量为50ml/500ml摇瓶,摇床转速150r/min,温度在菌体生长前三天控制在25℃培养,以后调至20℃培养。在此条件下,发酵培养被孢霉的生物量、菌体总油脂及花生四烯酸分别高达35.5g/L、13.2g/L及2.2g/L,在15L及1000L自动机械搅拌罐进行发酵试验,AA产量分别高达1.86g/L及1.70g/L。     

氧化胁迫对粉红螺旋聚孢霉生长和产厚垣孢子的影响

通过改变液体发酵通气量和添加不同种类活性氧(O2-,H_2O_2,OH·),研究氧化胁迫对粉红螺旋聚孢霉67-1菌丝生长和产厚垣孢子的影响。结果表明,氧化胁迫对真菌菌丝和孢子的影响不同。低氧胁迫下,67-1菌丝生长状态发生改变,培养液装量越多,菌丝分枝越少,并且厚垣孢子产量越低。发酵过程中添加一定量的活性氧可以调控粉红螺旋聚孢霉厚垣孢子的形成。接种前添加5-6 mmol/L H_2O_2,菌株产厚垣孢子水平显著提高,浓度达到9 mmol/L时,67-1生长和产孢完全受到抑制。培养16 h后添加,67-1对H_2O_2的耐受力增强。培养基中添加甲萘醌能够抑制厚垣孢子的形成,培养16 h后添加350μmol/L甲萘醌则可以提高67-1厚垣孢子的产量。在Fe2+-H_2O_2体系中,不同添加时间高氧胁迫均能够显著促进厚垣孢子的生成(P0.05)。     

产银杏内酯内生真菌的筛选及培养条件研究

通过对内生真菌的发酵提取物进行TLC和HPLC-UV分析,进行菌株筛选;对该菌株在不同培养基上的生长情况、产孢量、银杏内酯类物质产量的测定,确定最佳培养基;并用HPLC-ELSD测定了不同时间段的发酵液中银杏内酯类物质含量。结果,筛选出一株产量较高的烟曲霉原变种(Aspergillus fumigatusvar.fumigatus)FG052;对其培养条件的研究表明,PDA培养基、查氏培养基分别为其最佳传代和发酵培养基,菌丝最大生物量在发酵168 h,产银杏内酯类物质高峰在发酵144 h,此时总内酯产量可达0.13 mg/mL,pH值为4.86。本实验筛选的菌株稳定性较好,筛选的培养基价格低廉,碳氮比明确,且总内酯的产量高,可作为规模生产银杏内酯类物质的培养基。     

γ—亚麻酸生产菌深黄被孢霉原生质体的形成和再生

采用2％的溶壁酶加4％的蜗牛酶,从深黄被孢霉的菌丝中获得了大量的原生质体。同时对菌丝的培养时间、渗透压稳定剂、酶解系统和酶解温度等因素进行了系统的观察,从而获得了制备深黄被孢霉原生质体的最适条件。并对该原生质体在高渗培养基上进行了再生实验,其再生率为32％。     

γ-亚麻酸生产菌深黄被孢霉原生质作的形成和再生

采用2％的溶壁酶加4％的蜗牛酶,从深黄被孢霉的菌丝中获得了大量的原生质体。同时对菌丝的培养时间、渗透压稳定剂、酶解系统和酶解温度等因素进行了系统的观察,从而获得了制备深黄被孢霉原生质体的最适条件。并对该原生质体在高渗培养基上进行了再生实验,其再生率为32％。     

一种改进的丝状真菌DNA提取方法

以丝状真菌雅致枝霉(Thamnidium elegans)和深黄伞形霉(Umbelopsis isabellina)为材料, 使用优化的CTAB法提取基因组DNA。改进后的方法使用液氮冻融以及玻璃珠振荡的方法代替了传统的液氮研磨, 所需菌体量少, 而得到的基因组DNA比用传统的CTAB法得到的基因组DNA产率高、纯度好、且步骤简单, 适用于一次微量提取多个样品的基因组DNA。这种方法得到的基因组DNA可用于大部分分子生物学基本实验如PCR和DNA的酶切等。     

γ——亚麻酸生产菌深黄被孢霉原生质体的形成和再生

采用２％的溶壁酶加４％的蜗牛酶,从深黄被孢霉的菌丝中获得了大量的原生质体,同时对菌丝的培养时间,渗透压稳定性,酶解系统和酶解温度等因素了进行了系统的观察,从而获得了制备深黄被孢霉原生质体的最适条件,并对该原生质体在高渗培养基上进行了再生实验,其再生率为３２％。     

一种改进的丝状真菌DNA提取方法

以丝状真菌雅致枝霉(Thamnidium elegans)和深黄伞形霉(Umbelopsis isabellina)为材料,使用优化的CTAB法提取基因组DNA.改进后的方法使用液氮冻融以及玻璃珠振荡的方法代替了传统的液氮研磨,所需茵体量少,而得到的基因组DNA比用传统的CTAB法得到的基因组DNA产率高,纯度好、且步骤简单,适用于一次微量提取多个样品的基因组DNA.这种方法得到的基因组DNA可用于大部分分子生物学基本实验如PCR和DNA的酶切等.