通用型转铁蛋白融合表达载体的构建及应用价值

构建通用型转铁蛋白融合表达载体,利用PCR方法扩增编码人转铁蛋白N端半分子的基因片段,通过酶切、连接、转化等分子克隆方法构建通用型转铁蛋白融合表达载体。PCR扩增了一个长约1.1 kb的包含ScaI酶切位点的基因片段,插入pPICZα的PmlI和XbaI酶切位点,转化后进行菌液PCR鉴定,成功获得重组子pPICZα-TfN,测序结果表明载体构建成功,重组质粒pPICZα-TfN能被ScaI酶切。本研究成功构建通用型转铁蛋白融合表达载体,构建的载体可以用于转铁蛋白融合表达载体的构建。     

跨膜型TNF-alpha单克隆抗体腺病毒表达载体的构建和鉴

目的：应用AdEasy-1 系统构建包含tmTNF-alpha单克隆抗体轻、重链序列的重组腺病毒表达载体。方法：首先PCR 合成抗体 轻、重链序列,分别将轻、重链序列插入经过改造的含有双启动子的穿梭质粒pShuttle-2CMV,将穿梭载体电转化转化AdEasy 系 统BJ5183 感受态,挑取单克隆扩增质粒后酶切鉴定。结果：成功构建重组腺病毒表达载体pAdEasy-tmTNF-alpha,抗体重链、轻链序 列酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳证实条带片段大小正确,电转化BJ5183 后挑选重组克隆提取质粒,PacI酶切后重组片段位于4.5 kb及3 kb位置,证明重组腺病毒质粒pAdeasy-1-tmTNF-alpha构建成功。结论：将腺病毒系统与单克隆抗体技术相结合,利用AdEasy-1 系统成功构建腺病毒重组tmTNF-alpha单克隆抗体表达载体,为进一步开展肿瘤基因治疗的研究提供基础。     

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中克隆的研究

在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨羧基端基因片段功能打基础.采用PCR扩增方法获取P1结构基因.扩增产物用SalI和EcoRI酶切消化,回收1kb大小的DNA片段并与pUC19DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株.用X-gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定.经PCR扩增MPDNA获得1条5.0kbDNA片段.重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出2条带,1条为pUC19载体DNA带,另1条是1kb的插入片段.实验获得肺炎支原体P1蛋白结构基因及含P1蛋白羧基端DNA片段的重组克隆株.     

跨膜型TNF-α单克隆抗体腺病毒表达载体的构建和鉴定

目的:应用AdEasy-1系统构建包含tmTNF-α单克隆抗体轻、重链序列的重组腺病毒表达载体。方法:首先PCR合成抗体轻、重链序列,分别将轻、重链序列插入经过改造的含有双启动子的穿梭质粒pShuttle-2CMV,将穿梭载体电转化转化AdEasy系统BJ5183感受态,挑取单克隆扩增质粒后酶切鉴定。结果:成功构建重组腺病毒表达载体pAdEasy-tmTNF-α,抗体重链、轻链序列酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳证实条带片段大小正确,电转化BJ5183后挑选重组克隆提取质粒,PacI酶切后重组片段位于4.5kb及3 kb位置,证明重组腺病毒质粒pAdeasy-1-tmTNF-α构建成功。结论:将腺病毒系统与单克隆抗体技术相结合,利用AdEasy-1系统成功构建腺病毒重组tmTNF-α单克隆抗体表达载体,为进一步开展肿瘤基因治疗的研究提供基础。     

不同区段HIV-1 env基因在Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统中的表达及检测

利用昆虫细胞杆状病毒表达系统,将从一株HIV-1阳性克隆质粒中获得的几个HIV包膜蛋白基因片段,克隆入转移载体中得到重组病毒.用此重组病毒感染昆虫细胞后表达出3种HIV包膜蛋白,即GP120-41P、GP41T、GP41P,分别含有HIV-1包膜糖蛋白GP120及部分GP41,删除了N端12个疏水氨基酸的GP41和仅有主要表位约240个氨基酸的GP41.收获后分别以Western-blotting和EIA检测,有较好的免疫学活性,其中GP41T的活性最强.该实验为HIV包膜蛋白的结构研究提供了依据,加以改进后可能有免疫检测的价值.     

平滑肌肌球蛋白轻链激酶的非激酶作用及对ATP 酶活性的调节

肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase, MLCK）具有激酶活性和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,以进一步阐明MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制.采用PCR技术构建MLCK部分氨基酸缺失的重组表达载体pGEX-F6-5/D,经大肠杆菌表达得到可溶性GST融合蛋白,利用SDS-PAGE及Western 印迹鉴定表达的MLCK在细胞中的分布,结果还显示,提取液的上清和沉淀中均有MLCK片段的表达.运用亲和层析技术分离并纯化删除前、后表达的MLCK片段（F6.5和F6-5/D）,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B 纯化,SDS-PAGE鉴定显示为单一表达条带.应用EnzChek磷分析试剂盒和孔雀绿两种方法分别测定不同浓度的MLCK对非磷酸化肌球蛋白Mg²⁺-ATP酶活性的影响.两种MLCK的片段均具有激活ATP酶活性的作用,并随MLCK浓度的增加,酶的活性增加.比较删除前后不同MLCK片段对ATP酶活性的影响结果显示,删除MLCK片段1002位丙氨酸至1019位亮氨酸后,对ATP酶的激活作用较删除前明显降低,表明删除的部分氨基酸序列为MLCK非激酶活性所必需的区域.利用电镜技术观察到MLCK片段（F6.5）使非磷酸化肌球蛋白构象发生明显的变化.加入MLCK片段后肌球蛋白的构象由非活性型转化为活性型,并且MLCK片段还具有促进肌球蛋白单体形成肌丝的作用.     

重组腺相关病毒介导的大鼠脂联素载体的构建与鉴定

目的:克隆大鼠脂联素基因(Acrp30),并对载有脂联素的重组腺相关病毒(AAV)载体进行构建及鉴定.方法:根据Acrp30的基因序列设计引物,上游引入EcoR Ⅰ位点,下游引入Sal Ⅰ位点,以EX-A0242-M01-Acrp30为模板扩增目的基因.将Acrp30基因克隆入pUC19载体中,获得重组质粒pUC19-Acrp30.然后用EcoR Ⅰ与sal Ⅰ酶切pUC19-Acrp30及质粒pSNAV,回收酶切片段,T4DNA连接酶16℃过夜,转化大肠杆菌DH5a感受肽细胞,筛选阳性克隆获得pSNAV-Acrp30,EcoR Ⅰ/Sal双酶切鉴定,并行全基因测序.结果:PCR电泳及酶切鉴定表明,pSNAV-Acrp30重组成功,基因测序显示装入pSNAV质粒中的Acrp30基因正确.结论:脂联素病毒栽体成功构建,可以满足脂联素基因研究和治疗的需要.     

粘虫颗粒体病毒增效因子的基因定位

参考粉纹夜蛾Trichoplusia ni 颗粒体病毒增强因子的基因序列,设计PCR引物,用PCR反应扩增出特异性产物。用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶酶切处理PCR反应产物,然后克隆到质粒pUC19中,构建重组质粒pUC19-SF;对重组质粒pUC19-SF中的外源片段测序,结果证明PCR扩增产物是粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps增效因子基因的一段序列。重组质粒pUC19-SF的插入片段标记为探针,通过Southern杂交将增效因子基因定位于PuGV-Ps病毒基因组的多种酶切片段上。     

黑木耳核糖体失活蛋白cDNA 3′-端的克隆与分析

为了克隆黑木耳核糖体失活蛋白cDNA 3′-端,根据随机测得的中间一段蛋白质序列设计简并引物,应用RT-PCR和3′-RACE反应方法,将得到的基因片段与质粒连接,并转化至大肠杆菌中,进行蓝白筛选,再通过琼脂糖凝胶电泳法和PCR法验证白斑,从而得到阳性重组质粒,最后克隆出该目的蛋白基因片段。结果表明,克隆出的cDNA 3′-端为330bp的开放阅读框(ORF),编码107个氨基酸和2个终止密码子。经试验证明和文献检索,克隆得到的cDNA 3′-端为一种新基因。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.