全反式维甲酸调控自噬促进肝祖细胞成熟分化的作用研究

该研究探讨全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)体外诱导小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19细胞成熟分化及ATRA对细胞自噬水平的调控作用。应用1μmol/L ATRA处理小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19细胞,不同时间点进行荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc活性,Real-time PCR检测肝细胞相关标志基因的表达,吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)及过碘酸–希夫(periodicacid-schiff,PAS)染色检测细胞的成熟功能;透射电镜观察自噬体及细胞连接,ptf LC3质粒转染细胞,激光共聚焦显微镜观察自噬流,Western blot检测自噬相关标志蛋白质水平等综合分析自噬的变化情况。结果显示,与对照组相比,ATRA可显著增强HP14-19细胞ALB-Gluc活性,抑制肝前体细胞标志DLK和AFP的表达,促进成熟肝细胞标志ALB、CK18、TAT和Apo B的表达,ICG及PAS染色阳性细胞数显著增多(P0.05);透射电镜结果可见ATRA诱导组出现大量自噬体和自噬溶酶体,同时细胞间紧密连接增多,并且自噬相关标志蛋白质Beclin1、LC3-II、RAB7水平增高,P62水平无显著变化,LC3-II/LC3-I的比值明显增加(P0.05);激光共聚焦显微镜可见ATRA组细胞质内黄色斑点的自噬体及红色斑点的自噬溶酶体均较对照组明显增多,自噬抑制剂3-MA和Baflomycin可抑制ATRA诱导的HP14-19细胞的ICG摄取和糖原合成功能。综上所述,ATRA可能通过调节细胞自噬水平有效诱导小鼠胚胎肝祖细胞的分化成熟。     

真菌次级代谢产物11’-deoxyverticillin A(C42)通过降低自噬基因的表达抑制肝炎病毒(HBV)复制

C42属于epipolythiodioxopiperazines(ETPs)二酮呱嗪类化合物,具有多种生物学活性,包括抑制病毒复制;不过其对hepatitis B virus(HBV)复制的影响及机理鲜有报道。自噬是广泛存在于真核细胞、通过溶酶体降解长半衰期蛋白的现象,参与多种生理、病理过程。有研究发现自噬对HBV的复制至关重要。C42是否通过改变自噬来影响此病毒的复制目前还未见报道。在该研究中,我们发现表达HBV基因组的Hep G2.215细胞较原始的Hep G2细胞,自噬体明显增加并伴随着Akt磷酸化的增高。C42可以降低自噬基因LC3-II和p62的水平,同时会影响Akt信号通路。氯喹是一种自噬抑制剂,它的存在可以抑制C42导致的LC3-II降低,表明C42可以引起该细胞的自噬。敲降自噬基因和抑制Akt磷酸化均可以减少HBV-X蛋白表达。而利用氯喹抑制自噬体与溶酶体的融合却提高了HBV-X蛋白水平。由于HBV-X对该病毒的复制至关重要,因此,我们认为,C42通过自噬和Akt信号通路来抑制HBV的复制。     

富马酸二甲酯对人角质形成细胞HaCat生长和自噬的影响

该文探讨了富马酸二甲酯(dimethyl fumarate,DMF)对人角质形成细胞Ha Cat增殖、细胞周期和细胞自噬的调节作用以及相关机理的影响。应用MTT实验和流式细胞术分别检测细胞增殖和细胞周期的变化。并用免疫荧光染色、Western blot技术检测自噬相关蛋白的水平与分布。结果显示,DMF在25μmol/L时,可较明显地抑制Ha Cat细胞的增殖,当浓度达到150μmol/L时,细胞几乎完全失去增殖能力。低剂量DMF(25~50μmol/L)同时也可显著抑制Ha Cat细胞DNA合成,与对照组相比,S期细胞减少50%(P0.01),而G1期细胞增高近20%(P0.05);高剂量DMF(100μmol/L)可导致G2与M期阻滞(P0.01),而氧自由基抑制剂NAC(N-Acetyl-L-cysteine)预处理则几乎完全逆转这一现象。DMF处理诱导细胞出现明显的自噬特征,表现为LC3-II(microtubule associated protein 1light chain 3-II)免疫荧光染色呈点状分布并与溶酶体颗粒重合,LC3蛋白质脂化为LC3-II以及自噬相关蛋白成熟型Cathepsin D、LAMP1(lysosome-associated membrane glycoprotein 1)、p62水平增加。此外,DMF对ERK(extracellular regulated protein kinases)、AKT(phosphatidylinositol 3 kinase)以及m TOR(mammalian target of rapamycin)信号相关蛋白的磷酸化也有显著的抑制作用。这些结果表明,DMF可显著抑制人角质形成细胞增殖、抑制DNA合成、诱导细胞发生自噬,其机理可能与DMF抑制AKT/m TOR、ERK信号功能有关。     

Pravastatin激活自噬抑制糖皮质激素引起的髓核细胞凋亡

地塞米松注射可以缓解椎间盘退变引起的腰痛症状,但是具有一定的副作用。普伐他汀(Pravastatin)被发现可以缓解骨关节炎的炎症和症状,但是其对髓核细胞及椎间盘退变的作用及其机制尚不清楚。该文培养SD大鼠原代髓核细胞,用不同浓度地塞米松(dexamethasone,DXM)作用髓核细胞48 h后, DCFH-DA和MitoSOX Red染色分析细胞总活性氧(reactive oxygen species, ROS)和线粒体ROS水平, Annexin V/PI流式和DAPI染色分析细胞凋亡水平, N-acetyl-Lcysteine(NAC)抑制ROS水平。Western blot检测LC3-II、Beclin-1和P62等自噬相关蛋白质水平,ATG5 siRNA转染抑制自噬。结果显示,随着DXM处理浓度的增加,髓核细胞内总ROS和线粒体ROS水平及凋亡率升高(P0.05)。Pravastatin增加DXM处理下髓核细胞中LC3-II和Beclin-1蛋白质水平,降低P62蛋白质水平(P0.05)。Pravastatin可以抑制DXM诱导的髓核细胞中的ROS产生和细胞凋亡,而ATG5 siRNA抑制自噬后,显著逆转Pravastatin对细胞的保护作用(P0.05)。该研究结果提示, Pravastatin可能通过激活髓核细胞自噬抑制DXM诱导的ROS产生从而减少细胞凋亡。     

紫檀芪通过激活自噬缓解脊髓神经元细胞氧化应激损伤的作用及其机制

自噬在保护脊髓神经元细胞氧化应激损伤中具有重要的作用。紫檀芪(pterostilbene,PTE)是具有抗氧化作用的天然植物的提取物,但其对神经元细胞的作用及其机制尚不清楚。该文采用CCK-8分析PTE对大鼠原代脊髓神经元细胞的细胞毒性;不同浓度PTE作用神经元细胞24 h和48 h,透射电镜和Western blot检测微管相关蛋白轻链3-II(microtubule-associated protein 1 light chain3-II,MAP1LC3-II)、Beclin-1和P62蛋白质水平并分析自噬水平。PTE处理H2O2作用下的神经元细胞24 h,Western blot检测LC3-II水平,GFP-LC3转染观察自噬的数量。2′,7′-二氯二氢荧光素乙酰乙酸(2′,7′-dichloro-djhydrofl uorescein diacetate,DCFDA)和Mito SOX染色分析细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,自噬相关基因5(autophagy related gene 5,ATG5)si RNA转染分析自噬在其中的作用。结果显示,20μmmol/L PTE对于神经元细胞无细胞毒性,PTE作用下神经元细胞中LC3-II、Beclin-1蛋白质水平呈剂量依懒性升高,而P62则呈剂量依懒性下降(P0.05)。PTE增加H2O2作用下的神经元细胞中LC3-II蛋白质水平(P0.05),自噬体数量增加,PTE可提高神经元细胞中自噬体数量。PTE明显降低神经元细胞中ROS水平,但ATG5 si RNA转染抑制自噬后显著逆转PTE的保护作用。该研究结果提示,PTE可能通过提高氧化应激状态下的脊髓神经元细胞自噬水平来抑制细胞ROS的产生。     

氯喹抑制自噬增强宫颈癌细胞SiHa对CPT处理的敏感性

自噬诱导是肿瘤细胞对化疗药物抵抗性的原因之一,该研究探讨溶酶体抑制剂氯喹对喜树碱(camptothecin,CPT)诱导的宫颈癌细胞Si Ha死亡的增敏效果。CPT和/或氯喹处理宫颈癌Si Ha细胞,MTT法检测细胞增殖,DAPI和TUNEL染色观察细胞凋亡,Western blot和免疫荧光检测自噬及凋亡相关蛋白。结果发现,CPT处理后,Si Ha细胞MAP1LC3B荧光点和LC3II(microtubuleassociated protein light chain 3II)蛋白水平增加,p62荧光点和蛋白质水平则减少;而采用氯喹特异抑制自噬后,可明显提高CPT诱导的细胞凋亡、caspase-9的激活和PARP(poly ADP-ribose polymerase)的切割,而全长caspase-2水平显著下降。以上结果提示,氯喹可通过抑制细胞自噬而增强宫颈癌细胞株Si Ha对CPT诱导细胞凋亡的敏感性。     

真菌次级代谢产物11’-deoxyverticillin A（C42）通过降低自噬基因的表达抑制肝炎病毒（HBV）复制

C42属于epipolythiodioxopiperazines（ETPs）二酮呱嗪类化合物,具有多种生物学活性,包括抑制病毒复制;不过其对hepatitis B virus（HBV）复制的影响及机理鲜有报道。自噬是广泛存在于真核细胞、通过溶酶体降解长半衰期蛋白的现象,参与多种生理、病理过程。有研究发现自噬对HBV的复制至关重要。C42是否通过改变自噬来影响此病毒的复制目前还未见报道。在该研究中,我们发现表达HBV基因组的HepG2.215细胞较原始的HepG2细胞,自噬体明显增加并伴随着Akt磷酸化的增高。C42可以降低自噬基因LC3-II和p62的水平,同时会影响Akt信号通路。氯喹是一种自噬抑制剂,它的存在可以抑制C42导致的LC3-II降低,表明C42可以引起该细胞的自噬。敲降自噬基因和抑制Akt磷酸化均可以减少HBV-X蛋白表达。而利用氯喹抑制自噬体与溶酶体的融合却提高了HBV-X蛋白水平。由于HBV-X对该病毒的复制至关重要,因此,我们认为,C42通过自噬和Akt信号通路来抑制HBV的复制。     

自噬对氧化应激引起的脊髓神经元细胞损伤的作用及其机制

氧化应激是脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后脊髓神经元细胞继发性损伤的重要机制,但是如何缓解氧化应激目前仍然不明确。该文培养SD(Sprague Dawley)大鼠原代脊髓神经元细胞,使用不同浓度的H-2O_2作用于神经元细胞12 h后,Western blot检测LC3-II、Beclin-1和P62蛋白质水平变化,分析自噬水平,电镜和绿色荧光蛋白标的记微管相关蛋白轻链3(green fluorescent proteinmicrotubule-associated protein 1 light chain 3,GFP-LC3)转染观察自噬的数量。ATG5 si RNA转染抑制自噬和雷帕霉素(rapamycin)促进细胞自噬,并使用CCK-8和TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP-biotin nick end labeling)染色分析自噬对氧化应激下神经元细胞的作用。结果显示,随着H-2O_2浓度增加,LC3-II和Beclin-1蛋白质水平显著升高,而P62蛋白质水平显著下降(P0.05)。透射电镜和共聚焦观察发现,10、50μmol/L H-2O_2可以增加神经元细胞中自噬体的数量。与对照组比较,H-2O_2明显抑制神经元细胞的活力(P0.05),ATG5 si RNA抑制自噬水平后,H-2O_2作用下的细胞活力进一步下降,而雷帕霉素促进自噬后却可以提高细胞的活力(P0.05)。TUNEL和膜联蛋白V/PI(annexin V/PI)染色结果发现,雷帕霉素可以抑制H-2O_2引起的神经元细胞凋亡(P0.05)。该研究结果提示,脊髓神经元细胞处于氧化应激状态下时,自噬代偿性激活并保护神经元细胞。     

低频超声联合微泡造影剂通过激活自噬和凋亡对乳腺癌细胞活力的影响

自噬和凋亡是乳腺癌细胞数量和活力减少的重要因素,低频超声对肿瘤细胞的作用引起了研究者们的广泛兴趣,但是低频超声对乳腺癌细胞自噬和凋亡的作用尚不清楚。该文采用功率0.5 W/cm2的1 MHz低频超声联合微泡造影剂,作用于人乳腺癌细胞株MDA-MB-231 60s后,吖啶橙染色,电镜观察自噬的数量,Western blot检测微管相关蛋白轻链3-II(microtubule associated protein1 light chain 3-II,LC3-II)、自噬相关基因5(autophagy related 5,ATG5)和SQSTM1(sequestosome 1)/p62蛋白质水平变化,分别分析自噬的水平。Western blot检测caspase-3,膜联蛋白V/PI染色和DAPI染色方法分析MDA-MB-231细胞凋亡水平。ATG5 si RNA转染细胞可抑制自噬,caspase抑制剂Z-VAD-FMK可抑制凋亡,使用CCK-8分析自噬和凋亡对MDA-MB-231细胞的作用。结果显示,低频超声联合微泡造影剂促使LC3-II和ATG5蛋白质表达水平显著升高,而使SQSTM1/p62蛋白质表达水平显著下降(P0.05)。透射电镜和共聚焦观察发现,MDA-MB-231细胞自噬体数量增加。低频超声联合微泡造影剂促使caspase-3蛋白质表达水平升高,凋亡率增加。抑制自噬和凋亡后均明显缓解低频超声联合微泡造影剂对细胞活力的抑制作用(P0.05)。该研究结果说明,低频超声联合微泡造影剂通过激活自噬和凋亡抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖活力。     

自噬抑制剂3-MA上调H2O2损伤的PC12细胞氧化应激水平

为探究自噬抑制剂6-氨基-3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）对损伤细胞氧化应激水平的影响,将3-MA作用于H2O2诱导的PC12细胞损伤模型,以自噬增强剂雷帕霉素（rapamycin,Rap）作为对照,探讨自噬与氧化应激的关系。测定线粒体的膜电位和细胞内的活性氧（reactive oxygen species, ROS）与丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量,以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,评价损伤细胞的氧化应激状态。单丹(磺)酰戊二胺（monodansylcadaverine,MDC）染色,观察损伤细胞的自噬情况。蛋白质印迹分析损伤细胞中的自噬相关蛋白质LC3-II/LC3-I比值变化。实验结果显示：与正常组相比,H2O2损伤细胞的ROS水平上升到正常组的141%,MDA含量增加(P<0.001);CAT与SOD酶活力显著降低(P<0.001),差异均有统计学意义,证明损伤细胞氧化应激水平增加;MDC染色结果表明,H2O2组自噬明显增加。Western印迹结果表明,LC3-II/LC3-I值显著升高（P<0.05）;与损伤组相比,3-MA组MDC染色结果表明,自噬水平降低。Western印迹结果表明,LC3-II/LC3-I值下降;细胞内ROS水平升高,增加到正常组的208%。MDA含量增加(P<0.001),CAT、SOD酶活力降低(P<0.001)。综上结果表明,自噬抑制剂可增加H2O2诱导的PC12细胞损伤模型的氧化应激水平,增加细胞凋亡。     

SIRT3抑制线粒体自噬并减轻高糖加重的神经元缺氧再灌注损伤*

目的:探讨SIRT3调控的线粒体自噬对高糖加重神经元缺氧再灌注损伤的影响及机制。方法:高糖(50 mmol/L)干预HT22细胞后,构建细胞缺氧/复氧模型,利用SIRT3抑制剂3-TYP抑制SIRT3表达。倒置显微镜观察细胞形态改变,CCK8法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,TMRE荧光试剂盒检测细胞线粒体膜电位,RT-qPCR、Western blot检测相关分子的基因和蛋白质表达。结果:高糖使神经元缺氧再灌注后的细胞碎片进一步增加,细胞存活率降低,细胞凋亡率升高(P<0.05)。此外,高糖降低了神经元缺氧再灌注后的线粒体膜电位(P<0.05)。进一步研究发现,高糖上调神经元缺氧再灌注后线粒体分裂相关蛋白DRP1的表达水平,降低了线粒体融合相关蛋白OPA1和线粒体外膜蛋白TOM20的表达;并且增加了自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1和线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin的表达;同时,高糖升高了SIRT3的基因和蛋白质表达(P<0.05)。而SIRT3抑制剂3-TYP使神经元高糖缺氧再灌注损伤加重,同时进一步上调DRP1、LC3Ⅱ和PINK1的蛋白质表达(P<0.05)。结论:高糖可显著加重神经元缺氧再灌注损伤,破坏细胞线粒体功能,激活细胞线粒体自噬;SIRT3可抑制PINK1-Parkin通路介导的线粒体自噬并减轻神经元高糖缺氧再灌注损伤。     

MiR-147a通过抑制细胞自噬促进HIF-1α蛋白的积累

目的:HIF-1α是由低氧诱导表达的一个重要的调节肿瘤生长、代谢的转录因子,它的降解除了通过泛素-蛋白酶体途径降解之外还与可以通过细胞自噬途径降解。通过研究miR-147a对细胞自噬的影响从而进一步研究miR-147a对HIF-1α降解的影响。方法:在HeLa细胞中过表达miR-147a,用Western blot和Q-PCR检测细胞自噬相关的标志物LC3B、P62、LAMP-2A的变化。再通过溶酶体-自噬泡共定位实验共聚焦显微镜观察自噬泡的数量以及共定位情况。最后通过加入自噬诱导剂(EBSS)和自噬抑制剂(Bafilomycin A1),用Western blot检测转染NC与miR-147a后HIF-1α蛋白的表达情况。结果:过表达miR-147a后自噬相关的标志物LC3B、P62表达量上升,LAMP-2A表达量下降,且溶酶体与自噬泡的共定位增多;加入自噬诱导剂和自噬抑制剂后HIF-1α蛋白的表达量增加。结果表明miR-147a可以抑制细胞自噬的巨自噬途径以及分子伴侣介导的自噬途径,积累HIF-1α蛋白。结论:miR-147a通过抑制细胞自噬从而减少HIF-1α蛋白的降解,但是miR-147a作用靶点的分子机制需要进一步研究。     

MiR-147a 通过抑制细胞自噬促进HIF-1alpha蛋白的积累

目的：HIF-1alpha是由低氧诱导表达的一个重要的调节肿瘤生长、代谢的转录因子,它的降解除了通过泛素- 蛋白酶体途径降解 之外还与可以通过细胞自噬途径降解。通过研究miR-147a 对细胞自噬的影响从而进一步研究miR-147a 对HIF-1alpha降解的影响。 方法：在HeLa 细胞中过表达miR-147a,用Western blot 和Q-PCR 检测细胞自噬相关的标志物LC3B、P62、LAMP-2A的变化。再 通过溶酶体- 自噬泡共定位实验共聚焦显微镜观察自噬泡的数量以及共定位情况。最后通过加入自噬诱导剂（EBSS）和自噬抑制 剂（Bafilomycin A1）,用Western blot 检测转染NC 与miR-147a 后HIF-1alpha蛋白的表达情况。结果：过表达miR-147a 后自噬相关的 标志物LC3B、P62 表达量上升,LAMP-2A 表达量下降,且溶酶体与自噬泡的共定位增多;加入自噬诱导剂和自噬抑制剂后 HIF-1-alpha蛋白的表达量增加。结果表明miR-147a 可以抑制细胞自噬的巨自噬途径以及分子伴侣介导的自噬途径,积累HIF-1-alpha蛋 白。结论：miR-147a通过抑制细胞自噬从而减少HIF-1-alpha蛋白的降解,但是miR-147a 作用靶点的分子机制需要进一步研究。     

缺氧通过SIRT1调控结直肠癌细胞自噬

目的:探究缺氧调控结直肠癌细胞自噬的分子机制。方法:分别在常氧及缺氧(1%氧气浓度)条件下处理细胞,western blot检测细胞内沉默信息调节因子1(Silencing Information Regulator 1,SIRT1)及自噬相关标志分子的表达情况;慢病毒转染构建SIRT1稳定过表达或敲减细胞株,利用透射电镜观察细胞内自噬体形成的情况;使用m RFP-GFP-LC3双标腺病毒感染细胞,在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞自噬流的进展。结果:Western blot结果显示,缺氧条件下,HCT116及SW480细胞内SIRT1的表达水平随着缺氧时间的延长而降低,自噬特异性底物p62蛋白水平降低且LC3-I/II转换增加;与对照组相比,SIRT1过表达细胞内自噬特异性底物p62的表达水平升高而LC3-I/II转换受到抑制;相反在SIRT1敲减细胞内,p62的表达水平降低而LC3-I/II转换进一步促进。透射电镜结果发现SIRT1过表达后,细胞内自噬溶酶体形成减少、自噬体数量增多;激光共聚焦结果显示,SIRT1过表达细胞内绿色荧光淬灭减少、自噬体与自噬溶酶体的融合收到明显抑制,说明SIRT1通过抑制自噬溶酶体的形成,阻断自噬流的进展。结论:缺氧通过抑制SIRT1的表达促进结直肠癌的细胞自噬。     

COPII囊泡衣被蛋白SEC24A在巨自噬通路中的功能研究

细胞自噬是一种重要且保守的细胞内降解过程,通过形成双层膜的自噬体包裹细胞内容物进行降解。内质网来源的COPII囊泡被认为是饥饿诱导的应激过程中自噬体的膜源。探究了COPII囊泡衣被蛋白SEC24A在巨自噬通路中的作用。利用siRNA干扰技术敲低SEC24A的表达,EBSS饥饿处理对照组和SEC24A敲低组HeLa细胞2 h诱导自噬发生,经Western blot和免疫荧光实验检测自噬底物蛋白p62和自噬标志蛋白LC3-II的蛋白水平变化,以确定SEC24A是否参与自噬。通过RFP-GFP-LC3串联荧光检测自噬体和自噬溶酶体的数目,利用蛋白酶K保护实验验证自噬缺陷发生在自噬体闭合之前或者之后,利用免疫荧光实验检测敲低SEC24A对自噬通路上ATG复合物的影响,以确定SEC24A调控自噬通路的位点。通过免疫共沉淀实验验证SEC24A与自噬相关蛋白ATG9A是否存在相互作用。蛋白检测实验发现,饥饿条件下与对照细胞相比,敲低SEC24A细胞内自噬底物蛋白p62积累,而标志蛋白LC3-II减少。RFP-GFP-LC3串联荧光实验显示,敲低SEC24A后自噬体及自噬溶酶体的数目均减少。蛋白酶K保护实验显示,SEC24A敲低细胞中受膜结构保护的p62和GFP-LC3均减少,提示SEC24A作用位点在自噬体闭合之前。免疫荧光实验显示,敲低SEC24A的表达后ATG14L、ATG16L1点状结构减少,而ATG9A点状结构的数量没有明显变化,提示SEC24A作用于ATG14L、ATG16L1上游。免疫共沉淀实验显示SEC24A与ATG9A存在相互作用。研究结果不仅有助于深化对自噬体形成过程和分子机制的了解,也为全面解读COPII囊泡及其衣被蛋白在自噬中的重要作用提供了信息。     

Nogo-B抑制Ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化

Nogo-B在血管损伤、组织修复和炎症反应中发挥重要作用。然而,Nogo-B在动脉粥样硬化中的作用仍不明确。本研究拟在巨噬细胞中探讨Nogo-B对巨噬细胞泡沫化的影响。在RAW264.7细胞中沉默Nogo-B后,采用氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)或DiI修饰的Ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化;通过激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞中荧光脂质,并在透射电镜下观察各组细胞中自噬泡;采用Western 印迹分析Plin2、p62和LC3-II的蛋白质水平;采用实时荧光定量PCR检测p62 mRNA水平;采用氯喹处理以及mRFP-GFP-LC3双荧光体系分析自噬流功能;进一步过表达Nogo-B后,比较巨噬细胞中脂质负荷程度以及Plin2、p62和LC3-II的蛋白质水平。结果显示,DiI-Ox-LDL处理后,Nogo-B沉默组细胞中脂质负荷程度高于对照组（2.34±0.67 vs. 0.69±0.14,P＜0.05）;Ox-LDL处理后,Nogo-B沉默组细胞中自噬泡数量（8.67±0.58 vs. 4.33±0.58,P＜0.01）、Plin2（4.65±0.50 vs. 3.24±0.71,P＜0.05）、p62（10.13±1.79 vs. 5.76±1.84,P＜0.05）和LC3-II（4.38±0.20 vs. 2-33±1.56,P＜0.01）的蛋白质水平均显著高于对照组,而p62 mRNA水平无差异（P＞0.05）;进一步研究发现,Nogo-B沉默组的自噬流被抑制了;过表达Nogo-B后,虽然p62蛋白质水平无明显变化,但是细胞中脂质负荷程度显著低于对照组（1.68±1.06 vs. 4.94±0.70,P＜0.05）,Plin2和LC3-II的蛋白质水平也明显降低。上述结果表明,Nogo-B通过促进自噬流抑制了Ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化,Nogo-B可能具有抗动脉粥样硬化的作用。     

Nogo-B抑制Ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化

Nogo-B在血管损伤、组织修复和炎症反应中发挥重要作用。然而,Nogo-B在动脉粥样硬化中的作用仍不明确。本研究拟在巨噬细胞中探讨Nogo-B对巨噬细胞泡沫化的影响。在RAW264.7细胞中沉默Nogo-B后,采用氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)或DiI修饰的Ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化;通过激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞中荧光脂质,并在透射电镜下观察各组细胞中自噬泡;采用Western 印迹分析Plin2、p62和LC3-II的蛋白质水平;采用实时荧光定量PCR检测p62 mRNA水平;采用氯喹处理以及mRFP-GFP-LC3双荧光体系分析自噬流功能;进一步过表达Nogo-B后,比较巨噬细胞中脂质负荷程度以及Plin2、p62和LC3-II的蛋白质水平。结果显示,DiI-Ox-LDL处理后,Nogo-B沉默组细胞中脂质负荷程度高于对照组（2.34±0.67 vs. 0.69±0.14,P＜0.05）;Ox-LDL处理后,Nogo-B沉默组细胞中自噬泡数量（8.67±0.58 vs. 4.33±0.58,P＜0.01）、Plin2（4.65±0.50 vs. 3.24±0.71,P＜0.05）、p62（10.13±1.79 vs. 5.76±1.84,P＜0.05）和LC3-II（4.38±0.20 vs. 2-33±1.56,P＜0.01）的蛋白质水平均显著高于对照组,而p62 mRNA水平无差异（P＞0.05）;进一步研究发现,Nogo-B沉默组的自噬流被抑制了;过表达Nogo-B后,虽然p62蛋白质水平无明显变化,但是细胞中脂质负荷程度显著低于对照组（1.68±1.06 vs. 4.94±0.70,P＜0.05）,Plin2和LC3-II的蛋白质水平也明显降低。上述结果表明,Nogo-B通过促进自噬流抑制了Ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化,Nogo-B可能具有抗动脉粥样硬化的作用。     

细胞病变型牛病毒性腹泻病毒对宿主细胞自噬作用的研究

细胞自噬(Autophagy)是一种真核生物细胞内损伤的细胞器和长寿命蛋白通过双层膜结构的自噬小泡包裹后,送入溶酶体或液泡中进行降解并得以循环利用的高度保守的分解代谢过程。本研究旨在了解细胞病变型(CEP)牛病毒性腹泻病毒(BVDV NM)对宿主细胞MDBK细胞自噬作用的影响。实验使用BVDV NM株感染宿主细胞MDBK,在不同时间点分别通过透射电镜观察自噬体形成、报告荧光GFP-LC3自噬底物检测以及Western blot方法鉴定细胞自噬标记物LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ和P62的表达等试验方法对自噬进行检测。结果显示,感染BVDV NM株的MDBK细胞出现了明显的细胞病变;透射电镜能观察到细胞中存在大量的双层膜结构的自噬泡;转染GFP-LC3荧光质粒后,在感染病毒的细胞内出现增多的聚集绿色荧光自噬小体;此外,随着BVDV NM株感染MDBK时间的延长可以发现LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白的量逐渐增加以及P62蛋白的降解。试验表明BVDV NM株感染MDBK可以促进细胞自噬的发生。     

饥饿及雨蛙素诱导的AR42J 细胞中自噬基因LC3及beclin-1 表达的变化

目的:观察饥饿及雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞AR42J中自噬基因LC3及beclin-1表达的变化,初步探讨吞噬(autophagy)在急性胰腺炎中的作用。方法:选择体外培养的生长状态良好的大鼠胰腺腺泡AR42J细胞,随机分为3组,饥饿组(N=10),雨蛙素处理组(N=10),空白对照组(N=10)。饥饿组加入充足的平衡盐溶液,雨蛙素处理组加入含10-7mol/L雨蛙素的全营养培养液,空白对照组加入含20%灭活胎牛血清的F12-K培养液(p H7.2-7.4),各组分别于处理后2、4、6 h收集细胞并提取蛋白质。采用免疫印迹法检测三组不同时点胰腺腺泡细胞AR42J中自噬基因Beclin-1和LC3的蛋白表达。结果:空白对照组不同时点beclin-1和LC3-II均呈低表达,且各时点比较差异无统计学意义(P<0.05)。饥饿组和雨蛙素处理组beclin-1和LC3-II的表达随处理时间的延长逐渐增加,且不同时点beclin-1和LC3-II的表达均较空白对照组显著增高,差异均具统计学意义(P<0.05)。结论:雨蛙素和饥饿刺激可导致大鼠胰腺腺泡细胞AR42J中LC3-II及beclin-1蛋白表达随作用时间的延长而增加,自噬可能参与了胰腺炎的发生发展过程。     

肠道病毒A71型亚单位蛋白对RD细胞自噬活化的影响

肠道病毒A71型（Enterovirus-A71, EV-A71）能够活化宿主细胞的自噬并依赖自噬促进其复制,然而EV-A71的亚单位蛋白对自噬的活化目前仍不清楚。为探讨EV-A71亚单位蛋白对人横纹肌肉瘤（Human rhabdomyosarcoma, RD）细胞自噬活化的影响,将EV-A71的亚单位蛋白重组真核质粒转染至RD细胞,采用抑制剂MK-2206阻断PI3K/Akt途径,共聚焦显微镜和免疫印迹检测自噬活化。过表达EV-A71亚单位蛋白的RD细胞中PI3K/Akt途径、p38、JNK和ERK途径均呈现不同程度活化,同时RD细胞呈现出绿色荧光表明自噬发生活化,特别是EV-A71的VP2和2A。EV-A71亚单位蛋白使LC3-II/LC3-I的转化水平提升,EV-A71亚单位蛋白（VP2、VP3、VP4、2A、2B和2C）显著提升p62的表达水平,EV-A71 VP1显著下调p62的表达水平但显著上调LAMP-1和LAMP-2的表达水平。阻断PI3K/Akt途径后,过表达EV-A71亚单位蛋白的RD细胞绿色荧光强度显著减弱、自噬被阻断,同时LC3-II/LC3-I的转化水平显著降...