猪链球菌2型烯醇化酶的分子克隆与免疫学特性

对新近测定的猪链球菌2型(S. suis 2) 05ZYH33全基因序列进行生物信息学分析, 并与相关家族蛋白进行同源性比较, 设计合成引物, PCR法扩增出约1.3 kb的烯醇化酶编码基因 (enolase, eno), 将其克隆入pMD-18T载体中, 进一步亚克隆入表达载体pET32a。将重组表达质粒pET32a::eno转化E. coli BL21 (DE3), 经IPTG诱导表达后, SDS-PAGE初步检测到分子量约为75kD的蛋白带。通过His-Tag亲和层析纯化, 获得融合蛋白His-ENO。Western-blot表明该表达产物具有免疫原性。基于ELISA进行的细胞定位实验证实了Enolase可以部分存在S. suis 2 05ZYH33细菌的表面。这提示了Enolase作为一种新发现的抗原对于引发猪链球菌相关疾病可能发挥着重要的作用。     

猪链球菌2型烯醇化酶的分子克隆与免疫学特性

对新近测定的猪链球菌2型(S.suis 2)05ZYH33全基因序列进行生物信息学分析,并与相关家族蛋白进行同源性比较,设计合成引物,PCR法扩增出约1.3 kb的烯醇化酶编码基因(enolase,eno),将其克隆入pMD-18T载体中,进一步亚克隆入表达载体pET32a.将重组表达质粒pET32a::eno转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE初步检测到分子量约为75kD的蛋白带.通过His-Tag亲和层析纯化,获得融合蛋白His-ENO.Western-blot表明该表达产物具有免疫原性.基于ELISA进行的细胞定位实验证实了Enolase可以部分存在S.suis 2 05ZYH33细菌的表面.这提示了Enolase作为一种新发现的抗原对于引发猪链球菌相关疾病可能发挥着重要的作用.     

核糖体蛋白SA介导猪链球菌2型毒力因子烯醇化酶损伤宿主细胞线粒体

【背景】正常生理状况下核糖体蛋白SA (ribosomal protein SA, RPSA)主要在细胞内表达,参与多种细胞功能。在发生感染性疾病时,RPSA往往会异位于胞膜,介导微生物的感染。【目的】全面揭示RPSA在猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2, SS2)感染宿主过程中的作用。【方法】首先利用本课题组已有的脑脊液和血清蛋白组学数据库(SS2脑膜炎感染模型的仔猪和健康仔猪),借助生物信息学手段分别筛选脑脊液和血清中的差异表达蛋白(differentially expressed proteins, DEPs),并对其涉及的信号通路进行分析。通过体外烯醇化酶(enolase, ENO)刺激宿主细胞,检测宿主细胞线粒体膜电位、钙离子含量和活性氧(reactive oxygen species, ROS)等指标变化,揭示RPSA介导SS2-ENO对宿主细胞主要能量细胞器——线粒体功能的影响。【结果】生物信息学揭示SS2感染宿主后,RPSA和相关蛋白显著富集在代谢和糖酵解/糖异生等能量有关通路。SS2-ENO刺激导致宿主细胞线粒体膜电位下降、钙离子和ROS水平升高。封闭RPSA后缓解了ENO对线粒体膜电位、细胞活性氧和细胞内钙离子含量的影响。【结论】RPSA介导SS2毒力因子ENO损伤宿主细胞线粒体功能。本研究丰富了SS2感染时RPSA的作用机制,为SS2脑膜炎疾病的防治提供了理论基础。     

人肌型特异烯醇化酶放免分析法及初步应用

建立了人肌型特异烯醇化酶(hMSE)的放免分析法,抗血清的亲和常数为5.1×10⁹L/mol,采用改良的BHR法制备了 ¹²⁵I-hMSE,后者非特异结合率为3%,与抗血清(1∶10³)结合率达50.16%;批内和批间CV分别为8.6%和13%.回收率为95%-105%.标准曲线范围为5-320μg/L.最小检出率为5μg/L.最佳反应条件:0.1mol/LpH7.4PBS(含5mmol/L MgSO₄,0.1%吐温-20,0.1%NaN₃);反应温度和时间:37℃反应0.5h和4℃,0.5h,作为快速测定;或选用4℃反应24h.65例健康人血清hMSE浓度为23.9±10.9μg/L(x±s).hMSE超过57μg/L(x+3s).为阳性值.测定了AMI和肌病患者,血清hMSE明显升高.     

稻瘟菌Ⅰ型烯醇化酶基因全长cDNA的电子克隆

利用电子克隆技术从稻瘟菌中克隆到一个新的Ⅰ型烯醇化酶全长cDNA,暂命为MgEno-1。MgEno-1全长1571核薯酸,其预测的ORF为1317核苷酸,共编码438个氨基酸。起始密码子ATG位于第53位,终止密码子TAA位于第1369位。序列分析表明该烯醇化酶与丝状真菌中已报道的其它烯醇化酶高度同源,且长度一致,这暗示烯醇化酶基因进化上高度保守,甚至有可能像18SrRNA一样可作为进化尺度。这将是第一个用电子克隆技术从稻瘟菌中克隆到的基因。     

猪链球菌2型对扁桃腺上皮细胞的黏附和侵袭作用

猪链球菌2型(SS2)是重要的人畜共患病病原体,溶菌酶释放蛋白（MRP）是SS2的主要毒力因子之一。用天然表达MRP的江苏分离株HA9801和不表达MRP的上海分离株SH006444,研究SS2对仔兔扁桃腺上皮细胞的黏附和侵袭作用。黏附计数结果表明,HA9801（MRP+）和SH006444（MRP-）均能对扁桃腺上皮细胞高水平黏附。扫描和透射电镜均观察到HA9801的高水平黏附现象,黏附部位是细胞膜和细胞微绒毛,并观察到细胞膜上有链球菌正处于内化过程中。裂解记数结果表明,HA9801有低度侵袭力,SH006444未检测到侵袭力。结果提示,扁桃腺是SS2的定殖器官和感染门户;MRP＋菌株黏附后直接侵入细胞内是其穿过扁桃腺上皮细胞屏障的机制之一。     

猪链球菌2型硫氧还蛋白还原酶介导细菌应激与致病作用

【背景】硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase,TRR）是硫氧还蛋白系统关键组成部分,对病原菌应对体内外氧化应激、调节细菌稳态和介导致病过程具有重要作用。【目的】探究硫氧还蛋白还原酶TRR在人畜共患猪链球菌2型感染过程中参与的生物学效应。【方法】同源重组法构建猪链球菌2型硫氧还蛋白还原酶trr基因缺失株（Δtrr）及回补株（cΔtrr）,通过细菌染色、点板计数、体外细胞和动物感染模型等试验比较分析trr基因对细菌形态、抗应激反应及致病过程的影响。【结果】缺失trr对猪链球菌2型形态与生长特性的影响不大,但可增强细菌抗热应激、氧化应激和酸应激能力,缺失株对上皮细胞黏附力下降,侵袭进入脑血管内皮细胞作用显著降低,易于被吞噬细胞吞噬清除,对小鼠模型致病效应显著减弱。【结论】猪链球菌2型TRR因子参与细菌应激反应,介导细菌黏附、侵袭等致病过程,是猪链球菌2型新的潜在毒力因子。     

致病性猪链球菌2型溶血素基因的克隆与表达

目的：克隆溶血素基因,为评价溶血素的毒力与抗原活性,构建猪链球菌疫苗提供依据。方法：从致病性猪链球菌II型四川资阳分离株基因组中分离溶血素基因,经中间T载体,将其克隆至改造的pGEX-6p1中,最后通过蛋白质电泳和溶血实验检验溶血素的表达及活性。结果：SDS-PAGE结果表明,重组溶血素在5h表达水平最高,10h次之,15h最弱;溶血实验重组菌周围形成明显的透明溶血环。结论：溶血素为分泌性早期表达,具有正常的β溶血活性。     

猪链球菌2型溶血素基因的表达及其免疫原性

【背景】猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一种重要的人兽共患病原菌,有35种血清型,其中以猪链球菌2型(SS2)危害最为严重。研究发现,各种血清型SS分泌的溶血素(Suilysin,SLY)可能具有较好的免疫保护作用,因此,SLY作为SS基因工程亚单位疫苗的成分具有较大优势。【目的】获得SS2安徽强毒株(AH10-8株)溶血素基因(sly)的表达产物,并对其免疫原性进行测定分析。【方法】根据GenBank数据库中登录号为DQ443533.1的全长sly序列,设计合成一对分别带有Bam HI、XhoI酶切位点的特异性引物,利用PCR从AH10-8株中扩增sly基因,构建pET-30a-sly原核表达重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达和His-Tag镍柱纯化蛋白,SDS-PAGE检测SLY,Western blotting鉴定SLY的反应原性;利用昆明鼠和斑马鱼进行SLY免疫攻毒保护试验,间接ELISA方法检测昆明鼠血清IgG抗体效价,观察比较病理组织变化及其免疫保护率。【结果】重组质粒pET-30a-sly在大肠杆菌中实现高效表达,获得大小为60kD的目的蛋白,与预期大小的SLY分子质量一致,能与SS2阳性血清发生特异性反应。SLY和AH10-8株灭活全菌体3次免疫昆明鼠后的血清IgG抗体效价分别为1:6 400、1:204 800 (以AH10-8株全菌体的超声裂解物为包被抗原)和1:102 400、1:51 200 (以SLY为包被抗原);SLY和AH10-8株灭活全菌体对昆明鼠和斑马鱼的免疫保护率分别为40%、80%和84%、92%;病理组织变化与攻毒对照组之间差异明显。【结论】成功表达的SLY具有良好的反应原性和免疫原性,可诱导机体产生保护性免疫反应,有望成为研制SS2新型疫苗的候选成分。     

猪链球菌2型溶血素基因与38KDa蛋白基因克隆及联合表达

目的:研究有效的猪链球菌病疫苗。方法:以四川株猪链球菌2型基因组DNA为模板分别扩增溶血素基因和38KDa基因主要功能区基因;并经连接、克隆及酶切鉴定。分别构建原核表达载体pET32a-Sly、pET32a-38KDa,提取阳性克隆质粒分别进行双酶切并纯化,通过PCR串联两片断,将目的片断定向克隆到表达载体pET32a中,经测序正确后,重组质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE3),用IPTG进行诱导表达。结果:重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量约为60Ku的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法(Western-blotting)证实该重组蛋白可以与SS2阳性血清发生特异性反应。结论:本研究为重组蛋白的免疫保护应用奠定基础。     

Vaccination with Streptococcus suis serotype 2 recombinant 6PGD protein provides protection against S. suis infection in swine

Streptococcus suis serotype 2 ( S. suis 2 or SS2) is the causative agent of several diseases in both pigs and humans. 6-Phosphogluconate dehydrogenase (6PGD) is a cell surface protein in SS2. In this study, the immunogenicity and protective efficacy of recombinant 6PGD (r6PGD) from SS2 was evaluated in piglets. Immunization with an r6PGD-containing adjuvant induced a vigorous immunoglobulin G (IgG) response, with the titer of IgG2 being higher than that of IgG1. Immunization of piglets with r6PGD yielded 50% survival upon an intravenous challenge with a lethal dose of SS2. Piglets immunized with the r6PDG vaccine were better protected than those immunized with the adjuvant control. The clinical signs and histopathological changes in the piglets were recorded. Collectively, these results suggest that r6PGD can confer partial protection against SS2 infection and could be useful for the development of subunit vaccines against SS2.     

猪链球菌2型强毒株S.suis 05ZY和弱毒株S.suis 1940的比较转录谱分析

目的:比较猪链球菌2型强毒株S.suis 05ZY和弱毒株S.suis 1940毒力相关基因转录水平的差异,为进一步研究强毒株S.suis 05ZY毒力增强的原因提供实验基础。方法:分别提取S.suis 05ZY和S.suis 1940的RNA,反转录成cDNA并纯化,用Cy5或Cy3标记,与猪链球菌全基因组DNA芯片进行杂交,扫描芯片进行数据分析,比较二者在转录水平上的差异基因。结果:编码溶血素、精氨酸氨基肽酶的基因分别上调4.4和6.0倍,参与荚膜多糖合成的相关基因cps2H、cps2I、cps2J和一些可能的毒力相关基因ofs、dpr、SSU05₀196、SSU05₀272、SSU05₁408-1409均发生转录水平的上调。结论:溶血素、荚膜多糖、精氨酸氨基肽酶及一些可能的毒力因子在转录水平的上调很可能与S.suis 05ZY的毒力增强有关。     

猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶基因的克隆与鉴定

根据GenBank猪链球菌2型(SS2)报道序列,对江苏分离株SS2-H部分测序,发现位于已知毒力基因orf2与mrp之间存在两个新的开放阅读框序列。选取可能含有抗原决定簇肽段对应的核酸序列,该阅读框(2738~3694)编码319个氨基酸残基,分子量为33.5kDa,与已知任何基因无同源性。通过InterPro、PHD、DNAstar分析阅读框,并定向克隆至pET-32α( )载体中,转化至大肠杆菌BL21,表达出分子量为48kDa的融合蛋白,蛋白免疫转印可被SS2的抗血清识别,具有免疫原性;并且含有IMP dehydrogenase结构域,催化IMP生成XMP;流式细胞仪检测该蛋白可明显影响HEp-2细胞周期。     

猪链球菌2型菌毛骨架蛋白编码基因SSU2101敲除突变株的构建及其生物学功能

利用同源重组基因敲除方法构建猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2,S.suis2)中国强毒株05ZYH33菌毛骨架蛋白(Backbone protein,BP)编码基因SSU2101敲除突变株。采用引物特异性PCR分析、Southern杂交及RT-PCR等方法鉴定,证实成功构建了BP基因缺失突变株。生物学特性显示,突变株的菌落形态、溶血活性以及染色特性方面与野生株之间均无明显差异。小鼠致病性试验结果显示,突变株的毒力比野生株显著减弱。研究结果提示菌毛在S.suis2感染致病过程中起重要作用,为系统研究S.suis2菌毛分子装配机制及其生物学功能奠定了基础。     

猪链球菌2型不同mrp基因型与毒力的关系

【目的】猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)是重要的人畜共患病病原,且有强弱毒株之分,但至今仍缺少合适的毒力标志基因来鉴定致病性SS2。本文旨在研究mrp基因型与SS2毒力的关系。【方法】通过PCR方法鉴定不同SS2菌株的mrp基因型。再通过"内标"化的斑马鱼感染模型和实时荧光定量PCR,分别测定不同mrp基因型菌株的毒力水平和mrp转录水平。【结果】根据PCR结果可将53株SS2分为mrp-A型(27株)和mrp-B型(26株)两种基因型;mrp-A型菌株比mrp-B菌株毒力偏强,且A型菌株中mrp转录水平更高。【结论】发现mrp基因在SS2中分布广泛,但不同菌株中mrp基因型不同,mrp-A型菌株的致病力更强。而且,以mrp非保守区域作为诊断靶点能有效鉴定SS2强毒株。     

猪链球菌2型新的感染相关因子自溶素的鉴定与分析

根据Sanger研究所公布的猪链球菌2型(SS2)P1/7株的自溶素序列,设计检测引物,取SS2我国2次流行株、其它临床分离株和参考株,及猪链球菌1型、1/2型、7型和9型,共33株,分别以其DNA为模板,PCR扩增.结果表明,SS2除无毒株T15阴性外,其他临床分离株27株(含人源2株)均阳性;其它猪链球菌为,SS7阳性,SS1、SS1/2和SS9均阴性.同时设计引物向两侧扩增,以四川流行株ZY05719和江苏流行株HA9801的DNA为模板,扩增自溶素ORF完整的编码基因,软件分析结果显示,该基因含有6个重复的"GBS_Bsp-like"域和1个"N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶"域,与SS2欧洲株有较高同源性(99.8%),但与SS2加拿大株差异较大.在DNASTAR分析所编码蛋白的抗原性的基础上,另设计引物,以ZY05719株DNA为模板,PCR扩增具有良好免疫原性的片段基因,并定向克隆至表达载体pET30a( )中,进行重组表达,SDS-PAGE和Western blot表明,所获得重组自溶素具有良好反应原性.     

高致病性2型猪链球菌截短型类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶基因的鉴定和功能研究

【目的】克隆表达高致病性2型猪链球菌05ZYH33株的SspA截短型基因,验证其是否具有酶学活性,并构建该基因的缺失突变株细菌,探讨其在2型猪链球菌致病过程中所起的作用【。方法】构建SS2的SspA截短型基因05SSU0811原核表达质粒,表达并纯化05SSU0811蛋白,运用丝氨酸蛋白酶底物Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(pNa),通过显色反应检测表达产物的酶学活性;运用同源重组技术敲除05SSU0811基因,多重交叉PCR筛选敲除株并测序鉴定,动物试验分析05SSU0811基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】成功表达并纯化05SSU0811蛋白,浓度约为3.5 g/L。丝氨酸蛋白酶活性测定试验证实其具有酶学活性;获得05SSU0811基因缺失突变株,小鼠攻毒试验表明,野生株攻毒的20只小鼠全部死亡,基因缺失突变株攻毒组死亡9只,死亡率45%,两组间死亡率有显著性差异。表明05SSU0811基因缺失的菌株毒力较野生株明显下降。【结论】05SSU0811基因编码的截短型丝氨酸蛋白酶仍然具有酶学活性,SS2的截短型基因SspA在高致病性2型猪链球菌的致病性方面具有一定作用。