链霉菌11371基因工程宿主菌的确定

为消除链霉菌11371内源性质粒对pIJ702的限制,以提高pIJ702转化率,确定11371基因工程宿主菌。采用种内接合转移的方法对链霉菌11371衍生菌U3和P2、P5、P7进行内源性质粒的消除。获得接合转移子U3-P7-6,具有转化外源质粒的能力,转化率为17～20个/100个菌,为链霉菌11371转化体系构建、克隆基因结构、功能鉴定和基因定位等研究提供生物材料。     

污水厂产超广谱β内酰胺酶大肠杆菌通过接合水平传递耐药性

【目的】研究废水中产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌中可移动质粒在耐药基因水平传播机制中的作用。【方法】对污水厂分离所得的50株产ESBLs大肠杆菌进行接合试验,并对所得的接合子采用纸片扩散法测定其对15种常见药物的耐药表型,针对质粒介导的产ESBLs菌株的耐药基因设计7对特异性引物对接合子进行PCR扩增。【结果】研究结果显示,80份水样分离得50株产ESBLs大肠杆菌,共接合成功35株细菌,接合成功率高达70%。接合子与供体菌相比,均发生耐药谱型的改变,且存在丢失一种或几种药物耐药性且产生另一种或几种药物耐药性的现象。PCR扩增结果显示,接合子与供体菌相比,耐药基因型有所减少或不变,bla_(TEM)、bla_(CTX-M)基因全部接合成功,bla_(SHV)基因仅1株未接合成功,耐氟喹诺酮类基因未发生转移。【结论】本研究表明,不同的耐药基因可能位于不同的可移动质粒上,可移动质粒在大肠杆菌耐药性水平传播的过程中起到了十分重要的作用。     

肠毒素质粒的研究III．耐药性产肠毒素大肠杆菌的质粒电泳分析

对20株人源耐药性产肠毒素大肠杆菌所进行的药敏,接合,质粒电泳及肠毒素检测结果表明：目前我省尚未发现天然形成的Ent-R重组质柱。在抗生素的选择压力下,12株多重耐产毒菌株中有8株其R质粒可与Ent质粒共传递给受体菌,使后者获得与供体一样的抗性与产毒性能,并在电泳中显示与供体一样的两条大质粒带,一条为分子量大于F质粒的R质粒带,另一为大小相当于F质粒的EⅡc质粒带。在一多重耐菌株中发现一t~#-T-,多次电泳仅只显示一条大于Ent质粒的质粒带,但兼具供体的抗性与产毒两种性能。此接合子在含药与不含药肉汤中连续传代以及再传递给另一受体菌后,其质柱带及两种性状均保持稳定。据此,我们推测此质粒带系由转座于插入而形成的EⅡt一“质粒重组体。 多重耐药性质粒与肠毒素质粒的共传递及其重组体的形成都将给腹泻的防治带来更大的困难,应予以重视。     

萘质粒转移到大肠杆菌中合成靛蓝的研究

利用含有萘降解质粒的假单胞菌,通过接合和转化,把这种质粒转移到大肠杆菌中,获得接合子和转化子。这种接合子和转化子不仅在L-培养基中能合成靛蓝,而且能在以萘作唯一碳源和能源的培养基中生长繁殖。因此,本工作不仅为微生物合成染料开拓新的途径,而且对研究环境有毒污染物降解菌的遗传工程也具有一定的意义。     

细菌遗传学

质　　粒质粒编码的特性如前所述 ,质粒是环状的染色体外遗传因子 ,它可编码多种遗传信息 ,包括通过接合而自我转移 (ｓｅｌｆ-ｔｒａｎｓｆｅｒ)至其他细胞的信息。并非所有的质粒都能转移它们自己 :非接合(ｎｏｎ -ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ)类质粒既不能编码供体的菌毛也不能进行转移。不过 ,它们可被存在于同一供体细胞内的其他接合性质粒所移动 (ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ)。除了这种任选性的转移能力之外 ,所有的细菌质粒都含有其为在细胞分裂时自我复制及分离进入子细胞所必需的基本遗传信息。质粒似乎普遍存在于细菌之中 ;许多质粒编码以下…     

类杆菌5-硝基咪唑抗性质粒pIP419的研究

5-硝基咪唑类药物广泛应用于厌氧菌感染症的临床治疗,近几年厌氧菌5-硝基咪唑抗性菌株的报道有所增加。本文介绍分离自类杆菌的编码抗5-硝基咪唑抗性质粒pIP419的研究结果。pIP419分子量为10kb,已建立了限制性内切酶物理图谱。该质粒可通过接合和转化在不同的菌种或菌株间转移。质粒上负责质粒复制和转移的基因片段已被定位和克隆。     

含hup基因的质粒在催娩克氏杆菌中的稳定性及吸氢酶的表达

以质料pKT230为载体,亚克隆大豆根瘤菌吸氢酶结构基因（hupSL）片段,构建成嵌合质粒pKH1。将质粒分配系统基因（parDE）片段和吸氢酶结构粒pRKBH。质粒pKH1、pRKBH和载体pRK415经转化和三亲本杂交,得到DH5α/pHR11、DH5α/pRKBH、pRK415、NG1390/pHR11、NG1390/pRKBH和NG1390/pKH1(NGH982)等接合子。稳定性分析发现,质粒pKH1在催娩克氏杆菌中传80代后仍有92％以上的菌株含此质粒,说明质粒pKH1有较高的稳定性。吸氢酶活性分析表明,H2诱导接合子NGH999和NGH982吸氢酶活性高表达,同时固氮效率和固氮酶活性也高。低碳源浓度更有利于接合子吸氢酶活性的表达和固氮效率的提高。接合子NGH982具有耐铵的基因,因此其固氮酶活性的表达有部分去铵阻遏的作用。     

细菌遗传学(续完)

质粒 质粒编码的特性 如前所述,质粒是环状的染色体外遗传因子,它可编码多种遗传信息,包括通过接合而自我转移(self-transfer)至其他细胞的信息.并非所有的质粒都能转移它们自己:非接合(non-conjugative)类质粒既不能编码供体的菌毛也不能进行转移.不过,它们可被存在于同一供体细胞内的其他接合性质粒所移动(mobilized).除了这种任选性的转移能力之外,所有的细菌质粒都含有其为在细胞分裂时自我复制及分离进入子细胞所必需的基本遗传信息.     

大肠埃希菌耐药性水平传播实验研究

目的研究重症监护病房（ICU）患者标本中分离的大肠埃希菌的耐药情况以及耐药性水平传播的实验研究。方法采取双纸片法（K-B）检测细菌的耐药性;产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌为供体菌,耐利福平大肠埃希菌（对其他抗生素敏感）作为受体菌进行接合实验;采用聚合酶链反应（PCR）技术扩增整合子和耐药基因。结果30株大肠埃希菌中产ESBLs菌株检出率为46．7％;接合培养后,接合菌携带23kb和25kb大质粒,而无供体菌中一系列小质粒;供体菌和接合菌均携带I型整合子。结论大肠埃希菌耐药性严重,且呈多重耐药性;产ESBLs菌株可通过质粒和整合子将耐药基因转移给敏感菌,导致耐药性传播。     

变形杆菌的耐药性及接合性R质粒的检测

本文报告了从烧伤病人感染创面分离、鉴定的35株变形杆菌的药敏试验及接合性R质粒的检测结果。35株变形杆菌双测试的6种抗菌药物都具有不同程度的耐药性。其中,对6种药物同时耐受的有26株(74.3％)。对其中的27株做了接合试验,接合性R质粒的检出率为70.4%。     

淋球菌耐药性与耐药质粒的研究

为了解湛江地区淋球菌耐药现状及耐药质粒的分布,并初步探讨其相互关系,对１９９８￣１９９９年广东省湛江地区健康鉴定出的９８株淋球菌流行株,应用纸片扩散法测定细胞对１０种抗生素的敏感性,并采用碱裂解法进行质粒抽提,分析耐药质粒的分布情况,选取ＮＧ４、ＮＧ３１、ＮＧ４３、ＮＧ７０进行细菌的接合试验,以观察耐药质粒能否通过接合进行传递以及传递后受体菌耐药性的变化。结果显示６．１２％菌株对全部抗生素敏感,４８．９６％的菌株对３种及３种以上的抗生素耐药;共检出四种不同分子量的质闰,７．４ｋｂ和４．２ｋｂ质粒检出率较高,分别为５９．１６％和６７．３２％,质粒谱型１２种,以７．４ｋｇ＋４．２ｋｇ和３９．５ｋｇ＋７．４ｋｇ＋４．２ｋｇ为主,占３８．７６％。在细菌的接合传递试验中,ＮＧ４３可通过接合传递将其耐药性传递给淋球菌及大肠     

大肠埃希菌耐药性监测及耐药质粒的研究

为了解医院内感染大肠埃希菌的耐药情况,探讨其耐药发生、流行及传播机制,对从临床分离的32株大肠埃希菌进行了药敏试验、质粒图谱分析以及质粒接合、转化试验,结果表明大肠埃希菌对氨苄青霉素的耐药率＞88%,对庆大霉素的耐药率＞75%,其中28株大肠埃希菌检出质粒,均含有一条分子量为5.66 Mu的质粒带,是医院内感染大肠埃希菌的流行质粒.质粒的接合、转化试验证实了质粒具有横向传播的特点,是细菌产生耐药的主要原因.     

多耐药肺炎克雷伯菌获得性耐药基因检测及指标聚类分析

目的调查多耐药肺炎克雷伯菌中65种获得性耐药基因和7种可移动遗传元件遗传标记基因的存在状况,以及获得性耐药基因和可移动遗传元件遗传标记基因的相关性。方法收集绍兴地区六家医院分离的肺炎克雷伯菌共20株,采用PCR的方法分析65种β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类获得性耐药基因和7种转座子、插入序列、接合性质粒遗传标记基因,并用指标聚类分析(SPSS法)分析β-内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类获得性耐药基因与整合子、转座子、插入序列、接合性质粒遗传标记基因的相关性。结果 20株肺炎克雷伯菌共检测到14种获得性耐药基因(包括6种β-酰胺类获得性耐药基因、6种氨基糖苷类获得性耐药基因、2种喹诺酮类获得性耐药基因)和6种可移动遗传元件遗传标记基因(包括1种整合子遗传标记基因、3种转座子和插入序列基因遗传标记基因、2种接合性质粒遗传标记基因),其余52种基因均未检测到。SPSS法将上述阳性检出基因分成两大簇群。结论绍兴地区六家医院的多耐药肺炎克雷伯菌菌株对抗菌药物的耐药表型与获得性耐药基因相关,且可移动遗传元件的水平转移使细菌的耐药性在同种细菌菌株之间甚至不同种细菌菌株之间得以快速传播。获得性耐药基因与可移动遗传元件遗传标记基因的指标聚类分析显示:OXA-1、aac(6’)-Ⅰb、qnrB、IMP、aadA5、VEB、KPC、qnrS等基因与接合性质粒遗传标记traA相关,提示这些基因在F接合性质粒上;DHA、aph(3′)-Ⅰ等基因与转座子遗传标记tnpU、tnp513相关,提示它们位于转座子上;TEM-1、aac(3)-Ⅱ、qacE△1与接合性质粒遗传标记trbC相关,提示TEM-1、aac(3)-Ⅱ等基因和Ⅰ类整合子可能位于宽范围接合性质粒上;ant(3″)-Ⅰ、rmtB等基因与ISEcp1较为相关,提示这些基因位于插入序列上。     

多重耐药阴沟肠杆菌质粒型AmpC酶DHA-1基因的检出

目的测定56株同时耐头孢噻肟、庆大霉素和环丙沙星的阴沟肠杆菌质粒型AmpC酶基因型。方法先后用头孢西丁纸片法、三维试验、等电聚焦及酶抑制试验和微量稀释法进行表型检测。接合试验证实酶基因的转移性。多重聚合酶链反应以及基因测序等方法鉴定质粒型AmpC酶基因型。结果受试的56株细菌中有5株三维试验阳性,其中1株能转移接合,接合子多重聚合酶链反应扩增结果呈阳性,等电点为7．8,基因测序表明和DHA-1型AmpC酶一致。结论我国的多重耐药阴沟肠杆菌已获得质粒型DHA基因,DHA基因可通过转化、接合等方式转移给其他细菌且易于传播,因此应加强监控以防DHA基因在革兰阴性菌中流行。     

胁迫诱导抗性基因转移导致细菌耐药的分子机制研究进展

抗性基因转移是细菌形成耐药性的重要原因.近年来的研究表明胁迫因子可通过多种机制诱导抗性基因转移.DNA损伤可导致细菌产生SOS应激反应,进而诱导接合DNA介导的抗性基因转移.在一些缺乏SOS系统的细菌中,抗生素胁迫可诱导细菌建立自然转化感受态.此外,作者最近的研究表明普通胁迫应答因子RpoS调控一种由双链质粒DNA介导的固体基质表面的抗性基因转移方式.本文在总结SOS依赖和非依赖型胁迫因子诱导细菌接合和转化介导的DNA转移以及RpoS调控固体基质表面双链质粒DNA转移的基础上,提出今后需重点研究胁迫因子如何激活关键调控蛋白以及这些调控蛋白如何影响DNA转移相关基因表达等关键问题.解决上述问题将为寻找合适的分子靶标用于防控抗性基因转移导致的细菌耐药奠定基础.     

天蓝色链霉菌中分化发育基因参与同源性重组

在天蓝色链霉菌中,ＳＣＰ２＾＊质粒接合转移频率的快增长,ＳＣＰ２＾＊质粒介导的质粒同源性重组频率的快增长与气生菌丝的形成同步。在１株ｂｌｄ基因突变株中,３株ｗｈｉ基因突变株中,测定ＳＣＰ２＾＊质粒接合转移及其介导的质粒同源性重组,结果表明,除ｗｈｉＡ基因突变导致质粒接合转移频率不稳定外,其余３个基因突变对质粒接合转移不产生影响,但在所测定的４个基因突变株中,质粒同源性重组的频率降低超过１０掊。     

杭州地区发酵乳制品中乳酸菌发生耐药传播的安全性研究

目的对杭州地区市售发酵乳制品中分离鉴定的乳酸菌进行耐药传播的安全性分析,旨在揭示发酵乳制品中是否存在可传递耐药基因的超级耐药菌。方法自行分离鉴定的耐药乳酸菌,提取质粒并电泳分析是否存在质粒;以耐受叠氮化钠的大肠埃希菌J53作为受体菌进行质粒接合试验;若乳酸菌存在耐药现象,发现存在耐药质粒,且耐药性可通过质粒传播,评定为3级。乳酸菌存在耐药现象,发现存在耐药质粒,但接合试验未能证明耐药性可通过质粒传播,评定为2级。乳酸菌存在耐药现象,但未检测出耐药质粒,评定为1级。结果美丽健产品中分离的双歧杆菌（MLJ-G-2）和乳杆菌（MLJ-G-1）检测出含有质粒,但不会发生耐药转移,三种菌耐药危害等级分别为2、2、1。伊利产品中分离的双歧杆菌（YL-G-3）、乳杆菌（YL-G-1）、嗜热链球菌（YL-Q）检测出含有质粒,但不会发生耐药转移,四种菌耐药危害等级分别为2、2、1、2。味全产品中分离的双歧杆菌（WQ-G-3）、乳杆菌（WQ-G-1）、乳杆菌（WQ-G-2）、嗜热链球菌（WQ-Q）均检测出含有质粒,其中乳杆菌（WQ-G-1）、乳杆菌（WQ-G-2）会发生耐药转移,四种菌耐药危害等级分别为2、3、3、2。光明产品中分离的乳杆菌（GM-G-2）、乳杆菌（GM-G-3）、嗜热链球菌（GMQ）检测出含有质粒,乳杆菌（GM-G-2）会发生耐药转移,四种菌耐药危害等级分别为2、1、3、2。蒙牛产品中只分离的嗜热链球菌（MN-Q）检测出含有质粒,不会发生耐药转移,耐药危害等级为2。结论发酵乳制品中分离所得的乳酸菌81.2%的菌能检测出质粒,耐药性可能与质粒相关,存在潜在的生物安全威胁;18.8%的菌的耐药性可通过质粒接合发生传播,存在直接的生物安全威胁。     

质粒介导重排子的发现、结构和功能

细菌耐药性已成为全球关注的重大公共卫生问题。接合转移是耐药质粒快速传播的重要方式,其中Ⅳ型菌毛在此过程中发挥着重要的作用。Ⅳ型菌毛具有黏附作用,能够使细菌黏附在宿主细胞和其他介质表面,帮助细菌形成生物被膜、细菌聚集体和微菌落,是细菌在液体中接合转移的重要因素。PilV蛋白是R64质粒Ⅳ型菌毛尖端黏附素,可以识别细菌细胞膜上的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)。重排子(shufflon)结构是多重DNA倒位系统,可使PilV蛋白多样化,进而影响细菌液体接合转移过程中的受体菌识别和接合转移频率。重排子结构最先发现存在于IncI1质粒R64,后陆续在IncI2、IncK、IncZ质粒以及伤寒沙门氏菌致病岛中被发现,其主要由A、B、C、D这4个片段及特异性重组位点sfx组成,受其下游重组酶基因rci的调控,不同质粒的重排子结构存在一定的差异。近期备受关注的可转移多黏菌素耐药基因mcr-1主要位于IncI2型质粒上,重排子可能是其快速传播的原因之一。本文综述了质粒介导重排子的发现、结构、功能和流行,期望基于对重排子更全面深入地了解,能够为耐药质粒的传播机制和控制策略研究提供...     

吸水链霉菌应城变种的四个内源质粒及其逐个消除的研究

在改良质粒DNA提取方法的基础上,从三种农用抗生素的同一产生菌——吸水链霉菌应城变种中同时发现四个内源质粒,用双向电泳技术确定了它们均为CCC构型,根据分子量从大到小的顺序将它们分别命名为pHZ1、pHZ2、pHZ3和pHZ4,与已知分子量的CCC质粒分子同步电泳估计它们的分子量依次分别为61kb、4.7kb、4.1kb和3.3kb,基于这四个内源质粒中至少部分个体可能为接合性质粒,可在没有某个质粒的衍生菌株的菌坪上形成“麻点”的假设,我们分离和鉴定了三个质粒逐个消除的10-22衍生菌株,并在光学显微镜下确证了二种类型的麻点。     

莱茵衣藻玻璃珠法转化线性质粒

[目的]研究线性质粒的转化,提高衣藻外源基因的转化效率。[方法]进行p SP108质粒单酶切试验,采用玻璃珠法转化线性质粒并对转化的关键条件进行优化,最后经抗性筛选、PCR及RT-PCR验证转化情况。[结果]经Bam HⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、SacⅠ单酶切制备的p SP108线性质粒均能成功转化,Bam HⅠ酶切后转化率最高,质粒最佳用量为4μg,最佳震荡时间为25 s,博来霉素最适筛选浓度为15μg/m L。[结论]为构建衣藻生物反应器提供实验基础。