异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞相关细胞因子表达影响的实验研究

为探讨异补骨脂素加锌对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞相关基因表达的影响,用改良的组织块培养法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,在成骨细胞体系中加入异补骨脂素与锌,以雌激素为阳性对照,空白组为阴性对照。结果显示:异补骨脂素加锌较单纯应用异补骨脂素或硫酸锌在48 h时促体外大鼠成骨细胞Ⅰ型胶原的表达;异补骨脂素加锌组可以明显上调大鼠成骨细胞TGF-β1的细胞信号转导因子Smad4 mRNA的表达(P0.01);能促进Runx2/Cbfa1 mRNA的表达(P0.05)。与空白对照组相比,异补骨脂素组,异补骨脂素加锌组均能增强Osterix mRNA的表达(P0.05)。与单纯应用异补骨脂素或者锌相比,异补骨脂素与锌联合应用能够协同增效,对促进体外培养的成骨细胞相关转录因子的表达更加明显,探讨了异补骨脂素及其与锌配伍调节骨代谢的分子机制,为提高骨质疏松症的临床疗效以及抗骨质疏松新药的开发提供了实验依据。     

甲氧补骨脂素对大鼠成骨细胞生物活性影响的实验研究

为探讨甲氧补骨脂素对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞增殖与分化作用的影响,用改良的组织块培养法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,在成骨细胞体系中以不同浓度加入甲氧补骨脂素,MTT法检测加药后不同时间细胞的增殖情况;用对硝基苯二钠基质动力学法(PNPP)测定细胞内碱性磷酸酶的活性,用改良的Lowry法测蛋白含量;用放射免疫法测定细胞内骨钙素含量。结果显示:与对照组相比,甲氧补骨脂素组在24 h和36 h时促进体外大鼠成骨细胞增殖的作用更明显;在24、48 h和72 h时均能提高成骨细胞碱性磷酸酶活性(ALP)和骨钙素(BGP)的分泌。甲氧补骨脂素对体外培养的大鼠成骨细胞的增殖与分化均有明显的促进作用。     

异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

为探讨异补骨脂素加锌对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞增殖与分化作用的影响,用改良的组织块培养法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,在成骨细胞体系中以不同浓度加入异补骨脂素与锌,MTT法检测加药后不同时间成骨细胞的增殖情况;用对硝基苯二钠基质动力学法(PNPP)测定细胞内碱性磷酸酶的活性,用改良的Lowry法测蛋白含量.结果显示:异补骨脂素加锌较单纯应用异补骨脂素或硫酸锌在24和48 h时促体外大鼠成骨细胞增殖的作用更加明显;在48和72 h时能促进成骨细胞碱性磷酸酶活性(ALP),其中ALP的测定在72h的活性更为显著.与单纯应用异补骨脂素或者锌相比,异补骨脂素与锌联合应用能够协同增效,对体外培养的成骨细胞的增殖与分化作用更加显著.     

补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞增殖与分化影响的实验研究

为探讨补骨脂素加锌对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞增殖、分化作用的影响及其量效关系,用改良的组织块培养法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,在成骨细胞体系中以不同浓度加入补骨脂素与锌,MTT法检测加药后不同时间成骨细胞的增殖情况;用对硝基苯二钠基质动力学法(PNPP)测定细胞内碱性磷酸酶的活性;用放射免疫法(RIA)测定细胞外骨钙素(BGP)的含量,用改良的Lowry法测蛋白含量。补骨脂素加锌较单独应用补骨脂素或硫酸锌在48 h和72 h时促体外大鼠成骨细胞增殖的作用更加明显;在24、48 h和72 h时能提高成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性,其中在48 h时的效果更为显著;在24 h和72 h时能提高细胞外液中的骨钙素含量;补骨脂素浓度为1×10-9mol/L和锌浓度为1×10-5mol/L两者联合用药较为合适。与单独应用补骨脂素或者锌相比,补骨脂素与锌联合应用能够协同增效,对体外培养的大鼠成骨细胞的增殖与分化作用更加显著。     

补骨脂素对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

为探讨补骨脂素体外对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响,用改良的组织块法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,补骨脂素以不同浓度加入细胞培养体系,作用不同时间后,用MTT法检测成骨细胞的增殖情况;用对硝基苯二钠基质动力学法测定细胞内碱性磷酸酶的活性,用改良的Lowry法测蛋白含量。补骨脂素浓度在1μmol/L 24 h,5~20μmol/L浓度范围内48 h,1、10、20μmol/L浓度范围内72 h促进成骨细胞增殖,在10~15μmol/L范围内48 h及72 h提高成骨细胞内碱性磷酸酶的活性。补骨脂素体外能促进成骨细胞的增殖与分化。     

佛手柑内酯对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

为研究佛手柑内酯对大鼠成骨细胞增殖、分化的影响。原代培养新生大鼠颅骨细胞,利用MTT法、微量酶标法、酶联免疫吸附法(ELISA)、q PCR等方法分别测定不同浓度佛手柑内酯对大鼠成骨细胞增殖,碱性磷酸酶(ALP),骨钙素(BGP),Ⅰ型胶原mRNA(CollagenⅠmRNA)表达的影响。结果显示,与对照组相比,佛手柑内酯作用于细胞24、48、72 h均对成骨细胞的增殖有促进作用(P0.05);作用48、72 h均能促进ALP、BGP、CollagenⅠmRNA表达(P0.05)。表明佛手柑内酯可促进大鼠成骨细胞的增殖和分化,为防治骨质疏松症的新药研究提供理论依据。     

雌激素对成骨细胞增殖及IGF-2表达的调控作用

目的 探讨雌激素对大鼠成骨细胞功能的影响及胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor 2,IGF-2）表达的调控机理。方法应用1×10^-10mol／L、1×10^-8mol／L、1×10^-6mol／L浓度的雌二醇（estradiol,172）分别作用原代培养的新生大鼠颅盖骨成骨细胞24h;采用MTT法和对硝基酚磷酸盐法检测成骨细胞增殖能力和细胞中碱性磷酸酶（ALP）活性;应用实时定量PCR和Western印迹杂交分析成骨细胞中IGF-2的mRNA和蛋白质的表达规律。结果1×10^-6mol／L浓度的磁使大鼠成骨细胞增殖能力和ALP活性分别增加了67％和55％,使IGF-2的mRNA与蛋白质的表达水平分别增加了90％和140％,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论雌激素对成骨细胞中IGF-2基因的表达具有正性调控作用。成骨细胞中IGF-2的高表达可能与雌激素调节成骨细胞增殖和分泌功能相关。     

补骨脂素对乳鼠颅骨成骨细胞分化成熟的影响

骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病,其特点是骨量低、骨微结构恶化、骨脆性增加、易骨折。为了改善骨质疏松,需要寻找合成代谢和口服药物的副作用最小的替代药物。补骨脂素是从中草药中提取的香豆素衍生物。然而,补骨脂素在成骨细胞功能中的作用及其分子机制尚不清楚。本研究发现,补骨脂素通过上调成骨细胞特异性标志基因(包括icollagen,骨钙素和骨唾液蛋白)的表达,增强碱性磷酸酶的活性,以剂量依赖的方式促进小鼠原代成骨细胞的成骨分化。本研究同时证明补骨脂素能上调BMP2和BMP4基因的表达,提高磷酸化smad1/5/8蛋白水平,激活BMP报告基因(12xbe-oc-luc)的活性以及增强BMP信号直接靶基因osx的表达。BMP2和BMP4基因的缺失消除了补骨脂素对成骨细胞标志基因col1、alp、oc和bsp表达的促进作用。结果表明,补骨脂素通过激活BMP信号促进成骨细胞分化,提示补骨脂素可能是治疗骨质疏松等骨丢失相关疾病的一种潜在的合成代谢剂。     

洛伐他汀促进成骨细胞增殖、BMP-2表达和矿化的实验研究

目的研究洛伐他汀对体外培养大鼠颅骨成骨细胞生物学功能的影响,探讨其促进骨形成的作用机制.方法洛伐他汀作用于体外培养大鼠颅骨成骨细胞,化学染色观察对成骨细胞矿化结节形成的影响;用免疫细胞化学单标计数测定成骨细胞增殖率及染色吸光度测定BMP-2的表达的变化;BMP-2和BrdU免疫双标染色吸光度测定新生成骨细胞BMP-2的表达情况.结果实验组成骨细胞矿化结节的数量和面积、细胞增殖率及BMP-2的表达明显高于空白对照组(P<0.05);实验组新生成骨细胞BMP-2的表达显著高于对照组(P<0.01).结论洛伐他汀可促进成骨细胞的增殖、分化、BMP-2的表达和矿化结节的形成,从而发挥促进骨形成的作用.     

补骨脂素对肝星状细胞(HSC-T6)增殖、氧化应激及Ⅰ型胶原分泌的影响

通过研究植物雌激素香豆素补骨脂素对体外培养的大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖及相关因子表达的影响,为补骨脂素治疗肝纤维化提供实验依据。常规培养肝星状细胞HSC-T6,采用0.1 mmol/L的H2O2制造HSC-T6氧化应激的模型。分别用MTT法检测肝星状细胞增殖、放射免疫法检测细胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),还原性谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性和含量,ELISA法测定Ⅰ型胶原的分泌。结果表明:与正常对照组组比较,补骨脂素在浓度为10μmol/L,1μmol/L,0.1μmol/L,均呈现出抑制HSC-T6增殖的作用(P<0.05),且最佳作用时间为48 h(P<0.05);与模型组比较,补骨脂素各个浓度组能够提高SOD和GSH-Px的活性(P<0.05),并降低细胞上清液中MDA和GSH的含量(P<0.05);与模型组比较,补骨脂素各个浓度组在作用48 h后,细胞上清液中的Ⅰ型胶原的表达量均降低(P<0.05)。因此,作为植物雌激素的一种,补骨脂素能有效的抑制HSC-T6的增殖及抗HSC-T6氧化应激,很可能成为雌激素的替代品在治疗肝纤维化中。     

改良组织块法培养小鼠成骨细胞的研究

目的 探讨简便、经济、高效的成骨细胞培养方法.方法 取新生乳小鼠的颅骨,用改良的组织块法分离培养成骨细胞;从细胞的形态学、增殖、碱性磷酸酶染色、矿化结节茜素红染色及骨钙素基因表达水平等方法鉴定、比较培养的成骨细胞.结果 分离培养的成骨细胞生长状态良好,纯度较高,具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶染色及矿化结节茜素红染色阳性,骨钙素基因表达水平明显高于阴性对照,差异有统计学意义(P＜0.05).比较1～4次分离培养的成骨细胞在形态、增殖及分化功能上差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 改良的组织块法分离培养乳小鼠的颅骨可获得大量纯度较高的成骨细胞,节约经费、时间,操作简便.     

丹皮酚对过氧亚硝基阴离子致大鼠成骨细胞分化抑制的影响

探讨丹皮酚（Pae）拮抗过氧亚硝基阴离子（ONOO^-）对体外培养大鼠成骨细胞分化的影响。用改良的组织块法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,采用淬灭流动反应方法体外制备ONOO^-,以不同终浓度加入成骨细胞培养体系,在作用不同时间后,用对硝基苯二钠动力学（PNPP）法检测细胞内碱性磷酸酶（ALP）的活性,用Lowry法测定蛋白含量,并以不同终浓度Pae消除ONOO^-（1000μmoL/L）对成骨细胞分化的影响。结果显示,不同浓度的ONOO^-（50-1000μmoL/L）均能抑制碱性磷酸酶的活性,影响分化;高浓度的丹皮酚（10^-3-10^-6mol/L）能消除ONOO^-（1000μmoL/L）对碱性磷酸酶活性的抑制,拮抗ONOO^-抑制成骨细胞分化的作用。     

不同强度50 Hz脉冲电磁场促进大鼠颅骨成骨细胞矿化成熟最佳参数的筛选

为研究不同强度脉冲电磁场(pulse electromagnetic fields,PEMFs)对大鼠颅骨成骨细胞（rat skull osteoblasts,OB）增殖及成熟矿化的影响,将大鼠颅骨成骨细胞随机分为 7 组. 检测大鼠颅骨成骨细胞的增殖,细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性变化,细胞沉积钙盐的情况,组织化学染色以及成骨细胞内标志性分子表达量的改变.结果显示,0.6 mT组促细胞增殖作用最强（P <0.01）;0.6 mT、1.8 mT、3.0 mT和3.6 mT均能提高ALP活性,其中0.6 mT ALP活性最高（P＜0.01）;在磁场处理4 ～12 d时细胞沉积钙盐逐渐增加,6种强度的脉冲电磁场均能促进钙盐沉积,尤以0.6 mT水平最高; ALP 染色、茜素红染色0.6 mT 组均显著高于对照组（P<0.01）;0.6 mT组 Bmp-2和Collagen-1 mRNA 的表达明显（P<0.01）高于对照组,磁场处理组Rankl mRNA 的表达均比对照组低. 0.6 mT 50 Hz 脉冲电磁场是促进成骨细胞增殖和矿化成熟的最佳参数,这为采用脉冲电磁场治疗骨质疏松症提供了治疗参数的基础支持.     

山萘酚对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

为探讨山萘酚体外对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响及中药菟丝子补肾壮骨作用的物质基础,用改良的组织块法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,山萘酚以不同浓度加入细胞培养体系,作用不同时问后,用MTF法检测成骨细胞的增殖情况;用对硝基苯二钠基质动力学法测定细胞内碱性磷酸酶的活性,用改良的Lowry法测蛋白含量。山萘酚在浓度1&#215;10^-5mol／L24h,1&#215;10^-5～1&#215;10^-7mol／L浓度范围内48h促进成骨细胞增殖,在浓度1&#215;10^-9moL／L48h及72h提高成骨细胞内碱性磷酸酶的活性。山萘酚体外能促进大鼠成骨细胞的增殖与分化,山萘酚可能是菟丝子补肾壮骨作用的活性成份之一。     

转化生长因子β1对大鼠心肌细胞肥大的影响

目的：研究转化生长因子β1（TGF-β1）及其下游Smad3信号蛋白在大鼠心肌细胞肥大中的作用。方法：TGF-β1干预培养新生大鼠心肌细胞,流式细胞仪检测心肌细胞总蛋白含量。结扎大鼠腹主动脉复制心肌肥厚模型,在不同时间点处死动物,检测左室质量指数（LVM1）,RT—PCR检测TGF-β1及Smad3的mRNA表达,Westernblot检测Smad3蛋白的表达。结果：不同剂量TGF-β1均能明显增加体外培养的心肌细胞总蛋白含量,TGF-β1（3ng／ml）还增加心肌细胞Smad3 mRNA和蛋白的表达,其表达量1h达高峰,持续至TGF-β1刺激后8h。大鼠腹主动脉结扎术后3d LVMI开始上升并持续至术后28d,心肌组织中TGF-β1、Smad3的mRNA表达水平以及Smad3蛋白表达术后3d也开始上升持续至术后28d,术后14d为表达高峰（P〈0．01）。结论：TGF-β1能诱导大鼠心肌细胞肥大,其信号蛋白Smad3参与了大鼠心肌肥大的病理过程。     

8-异戊烯基柑橘素促进体外培养成骨细胞成熟矿化的研究

研究8-异戊烯基柑橘素对体外培养大鼠颅骨成骨细胞(rat skull osteoblasts,ROB)的分化成熟及生物矿化的影响.取新生大鼠颅骨多次酶消化法得到成骨细胞,培养于含10%FBS的MEM培养液中,3天后首次换液,待细胞铺满皿底传代培养.以碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)为检测指标,96孔板梯度筛选作用最佳浓度,在最佳浓度作用并成骨性诱导培养的第3、6、9、12天测ALP活性、钙盐沉积量;第12天进行ALP和钙化结节组织化学染色及计数;成骨性诱导后不同时间点提取Total RNA,RT real-time PCR法检测成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、成骨相关转录因子Osterix、Runx-2和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的基因表达情况;成骨性诱导的第4、8、12天裂解获得细胞总蛋白,蛋白质印迹法检测人Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)的蛋白质表达量.研究结果表明:1×10-6 mol/L能显著促进成骨细胞的成熟分化,表现为提高ROB的ALP活性、促进钙盐沉积、增加钙化结节数量;提高bFGF、IGF-1、Osterix、Runx-2和BMP-2 mRNA表达水平;促进COL-Ⅰ的合成.由此可知终浓度为1×10-6 mol/L 8-异戊烯基柑橘素能显著促进ROB的分化成熟及生物矿化,证明8-异戊烯基柑橘素能促进成骨细胞的分化成熟及生物矿化,作为促进骨修复和抗骨质疏松的有效成分具有较大的药用价值.     

大豆甙元对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

目的探讨大豆甙元体外对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响。方法用改良的组织块法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,大豆甙元以不同浓度加入细胞培养体系,作用不同时间后,用MTT法检测成骨细胞的增殖情况;用放射免疫法(RIA)测定细胞外骨钙素(BGP)的含量,用改良的Lowry法测蛋白含量。结果大豆甙元1×10(-5)～1×10(-9)mol／L浓度范围内48h,72h促进成骨细胞增殖,在1×10(-7)～1×10(-9)mol／L范围内48h和72h提高成骨细胞外骨钙素含量。结论大豆甙元体外能促进成骨细胞的增殖与分化。     

五味子乙素对大鼠成骨细胞增殖分化的影响

目的:探讨五味子乙素体外对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响。方法:用改良的组织块法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,五味子乙素以不同浓度加入细胞培养体系,作用不同时间后,用MTT法检测成骨细胞的增殖情况;用对硝基苯二钠基质动力学法(PNPP)测定细胞内碱性磷酸酶的活性,用改良的Lowry法测蛋白含量。结果:五味子乙素在0.75×10-4 mol/L 24 h,48 h及72 h,及0.75×10-5mol/L 24 h促进成骨细胞的增殖,在0.75×10-6mol/L24 h提高成骨细胞内碱性磷酸酶的活性。结论:五味子乙素体外能促进成骨细胞的增殖与分化。     

改进竞争性RT-PCR法测定缺碘大鼠颅骨中BMP-2基因表达变化

为更加精确地测定碘缺乏状态下大鼠颅骨组织中骨形态发生蛋白 2 (BMP 2 )mRNA表达水平 ,改进竞争性RT PCR方法 ,探讨碘缺乏对骨骼发育影响的分子机制 .将构建的DNA竞争模板克隆入pSportⅠ质粒中 ,利用pSportⅠ质粒中所含有的SP6RNA聚合酶启动子序列 ,将DNA竞争模板在体外转录成为RNA .以此RNA作为竞争性RT PCR中的竞争模板 ,与所提取的总RNA一同进行RT PCR ,消除逆转录效率对定量结果的影响 .定量检测碘缺乏和正常大鼠颅骨总RNA中BMP 2mRNA的水平 .碘缺乏大鼠 (1d～ 84d)颅骨中BMP 2表达含量明显降低 .1d时降低 6 4 3倍 ,以后差距逐渐缩小 ,至 84d相差 1 5 5倍 .结果提示 ,碘缺乏所致的骨骼发育不良与BMP 2表达不足有关 ,结果首次揭示微量元素碘和甲状腺激素与BMP 2基因表达的调控有关     

50Hz正弦交变电磁场促进体外培养成骨细胞分化成熟的双“强度窗”效应

为研究频率为50 Hz不同强度正弦交变电磁场对体外培养成骨细胞分化及基因表达的影响,体外分离培养大鼠颅骨成骨细胞,传代后随机分为15组,分别用频率50 Hz、强度为0 mT(对照)和0.9～4.8 mT(每组间隔0.3 mT)的正弦交变电磁场处理。发现:正弦交变电磁场处理3～5 d后,成骨细胞呈漩涡样分布;第9 d,1.8和3.6 mT组的碱性磷酸酶活性极显著高于对照组;第0、12、24和96 h,1.5、1.8、3.0和3.6 mT组碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白-2和Osterix基因表达水平显著高于对照组;第10 d,1.8和3.6 mT组钙化结节数明显多于对照组。说明50 Hz、0.9～4.8 mT的正弦交变电磁场能促进体外培养成骨细胞分化成熟,并且具有较明显的双强度窗效应,其中1.8和3.6 mT作用最为明显。