中国红豆杉紫杉烯合酶cDNA的分离、表达和鉴定

紫杉烯合酶是一种二萜环化酶,催化牛儿基牛儿基焦磷酸形成紫杉醇生物合成过程中的中间体紫杉烯.利用PCR扩增同源探针筛选cDNA文库,克隆了一个编码中国红豆杉(Taxus chinensis (Pilg.) Rehd.)紫杉烯合酶3′端的2 151 bp的cDNA片段,也通过PCR扩增得到了该基因5′端的611 bp的cDNA片段,将这两个cDNA片段拼接在一起,得到长2 712 bp的cDNA片段,具有一个2 586个碱基的开放阅读框架(ORF),编码包括质体转移肽在内的共862个氨基酸残基;该酶与太平洋红豆杉紫杉烯合酶有97%的同源性(identity),与其他植物萜类环化酶也有较高的同源性.利用融合表达载体pET-32a在大肠杆菌BL21trxB中表达,所表达的融合蛋白以包含体形式存在.包含体经过变性、复性和再折叠,利用His残基亲和凝胶柱层析得到融合的紫杉烯合酶.用毛细管气相色谱-质谱联用对酶促反应产物进行分析,结果表明,融合的紫杉烯合酶能催化产生4(5),11(12)-紫杉烯.     

葡萄白藜芦醇合酶基因的克隆及序列分析

目的:从葡萄中克隆白藜芦醇合酶基因vrs1并对其序列进行生物信息学分析.方法:利用葡萄总RNA为模板,采用RT - PCR技术克隆白藜芦醇合酶基因vrs1并亚克隆进T- Vector.利用生物信息学工具对其核酸和蛋白序列进行分析.结果:测序结果显示其cDNA序列全长为1 257bp,含有一个1 179bp的开放阅读框.生物信息学分析表明葡萄白藜芦醇合酶基因编码392个氨基酸,分子量为42.9kDa,理论等电点为5.97,具有芪合酶家族固有的氨基酸保守结构域,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角组成.结论:该基因的克隆、生物信息学分析为进一步研究其功能奠定了基础.     

野生华东葡萄脂类相关质体蛋白基因VpPAP1的克隆与表达

该研究以前期获得的葡萄cDNA全长文库为基础,采用RT-PCR技术克隆了中国野生华东葡萄‘白河-35-1’(Vitis pseudoreticulata‘Baihe-35-1’)相关质体蛋白基因,命名为VpPAP1(GenBank登录号JN624817)。序列分析表明,VpPAP1基因cDNA编码区全长为1 034bp,其中5′-UTR和3′-UTR区域分别为26bp和63bp,开放阅读框为945bp,编码314个氨基酸,分子量为34 169.37Da,等电点为7.76。葡萄叶片接种白粉菌[Uncinula necator(Schw.)Burr.]后,运用实时定量PCR技术分析VpPAP1基因的表达模式,结果表明VpPAP1基因受白粉菌诱导表达,在接种后24h达到峰值。该研究为进一步研究中国野生葡萄脂类相关质体蛋白基因的表达及其在葡萄白粉病互作中的功能分析提供了依据。     

甘蔗ATP合酶基因的电子克隆及生物信息学分析

目的:运用电子克隆的方法获得甘蔗中的ATP合酶基因。方法:以小麦中一个ATP合酶基因为种子序列,对甘蔗的EST数据库进行搜索,应用相关软件进行聚类分析、拼接组装和延长。结果:获得一个ATP合酶基因SATPC1的cDNA序列全长,该序列长1 415bp,包含一个完整的1 077bp的ORF,编码358个氨基酸,且与水稻、玉米、高粱和葡萄等其他植物的ATP合酶具有高度的同源性。结论:电子克隆获得的cDNA序列为完整的甘蔗ATP合酶基因全长cDNA。     

桃ACC合酶基因的分离及其差异表达

利用5′/3′RACE PCR技术,从桃(Prunus persica (L.) Batsch)果实中克隆了植物乙烯生物合成的关键酶--ACC合酶的全长cDNA pacs,对pacs基因进行全序列测定表明,该基因全长1 848个碱基,编码区为1 449个碱基,5′端有177个碱基的非编码区序列,3′端有219个碱基的非编码区序列(不包括终止密码子TAA).pacs基因编码区共编码483个氨基酸,蛋白质大小为54 kD,等电点为6.43.pacs与番茄(S19677)、梅(AB031026)、番木瓜(U68216)、苹果(AB034993)等其他植物ACC合酶cDNA氨基酸序列同源性分别为65%、70%、75%、90%,并存在与这些ACC合酶氨基酸的活性位点保守序列SLSKDMGFPGFR.RT-PCR结合杂交分析表明,pacs和我们以前克隆的桃ACC合酶cDNA pacs12(AF467782)在叶片和花中基因表达模式基本一致,伤处理和IAA均能诱导叶片pacs 和pacs12基因的表达,但pacs在伤处理叶片的表达水平比pacs12高;pacs 和pacs12基因在果实表达有所不同,pacs在绿熟和成熟果实中均有表达,而pacs12在绿熟果实中基本检测不到,在成熟果实中才有表达,两者在果实中的表达水平比伤处理和IAA处理叶片和花中要低.     

湖北海棠MhPR1a基因的克隆与表达特性分析

以水杨酸诱导的湖北海棠[ Malus hupehensis (Pamp.) Rehd.]全长cDNA文库和基因组DNA为模板,克隆其PR1a基因(MhPR1a)的全编码区序列,并对该序列进行生物信息学分析;在此基础上利用荧光定量RT-PCR技术对湖北海棠根、茎和叶中该基因的表达特性及经过10μmol·L-1ABA、4℃低温处理及苹果蚜虫(Aphis citricola van der Goot)侵染后叶中该基因的表达特性进行了测定.结果表明:克隆获得的MhPR1a基因全长518 bp,最大开放阅读框为492 bp,编码162个氨基酸残基;编码的蛋白质为酸性蛋白,其相对分子质量为16 960,等电点pI 5.46;其基因组DNA序列与cDNA序列完全一致,说明MhPR1a基因内部没有内含子.湖北海棠MhPR1a基因与苹果(M.domestic Borkh.)和沙梨[Pyrus pyrifolia( Burm.f.)Nakai] PR1基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列同源性均较高,其中cDNA序列的同源性均为97％,氨基酸序列的同源性分别为95％和97％;系统树也显示MhPR1a基因编码的氨基酸序列与苹果和沙梨的亲缘关系最近,聚为一类.MhPR1a基因编码的氨基酸序列具有SCP保守结构域,含有1个信号肽和6个保守的半胱氨酸残基.在湖北海棠的叶、茎和根中MhPR1a基因均能表达,在根中的表达量最高.10 μmol·L-1ABA和4℃低温处理48 h后均可诱导MhPR1a基因的表达,且相对表达量明显高于对照(处理0h);苹果蚜虫也可诱导MhPR1a基因的表达,说明MhPR1a基因在湖北海棠抵抗植食昆虫和低温胁迫的过程中可能发挥着重要作用.     

草莓ξ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ξ-胡萝卜素脱氧酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸.序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性.系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近.原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达.用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草每的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞叶.     

2个芹菜品种泛变应原Api g 4基因的克隆与分析

从芹菜(Apium graveolens Linn.)品种‘津南实芹’(‘Jinnanshiqin’)和‘美国西芹’(‘Meiguoxiqin’)中分别克隆获得泛变应原基因Api g 4;2个品种的Api g4基因均包含1个长度为405 bp的开放阅读框,二者间有3个核苷酸位点的差异.2个品种的Api g4基因均能编码134个氨基酸,但二者编码的氨基酸序列有2个位点的差异.多重比对以及进化树分析结果均表明:2个芹菜品种Api g 4基因编码的氨基酸序列与其他植物的泛变应原氨基酸序列同源性较高,氨基酸序列高度保守;与同科植物欧芹[Petroselinum crispum (Miller) Nyman ex A.W.Hill]和胡萝卜(Daucus carota Linn.)的泛变应原氨基酸序列的同源性均达到90％以上,在进化树上也归为同一支.2个品种的泛变应原Api g 4均为疏水性蛋白,具有相似的三维空间结构,均包含3个α螺旋和7个β折叠.实时定量PCR分析结果显示:Api g 4基因在‘津南实芹’和‘美国西芹’根中的表达水平均最高,在茎和茎尖分生组织中的表达水平相对较低,在叶中的表达水平很弱,且2个品种间同一组织的Api g4基因表达水平也有差异,表明Api g 4基因的表达具有明显的组织特异性.     

中国红豆杉紫杉烯合酶cDNA的分离、表达和鉴定

紫杉烯合酶是一种二萜环化酶 ,催化牛儿基牛儿基焦磷酸形成紫杉醇生物合成过程中的中间体紫杉烯。利用PCR扩增同源探针筛选cDNA文库 ,克隆了一个编码中国红豆杉 (Taxuschinensis (Pilg .)Rehd .)紫杉烯合酶 3′端的 2 15 1bp的cDNA片段 ,也通过PCR扩增得到了该基因 5′端的 6 11bp的cDNA片段 ,将这两个cDNA片段拼接在一起 ,得到长 2 712bp的cDNA片段 ,具有一个 2 5 86个碱基的开放阅读框架 (ORF) ,编码包括质体转移肽在内的共 86 2个氨基酸残基 ;该酶与太平洋红豆杉紫杉烯合酶有 97%的同源性 (identity) ,与其他植物萜类环化酶也有较高的同源性。利用融合表达载体pET_32a在大肠杆菌BL2 1trxB中表达 ,所表达的融合蛋白以包含体形式存在。包含体经过变性、复性和再折叠 ,利用His残基亲和凝胶柱层析得到融合的紫杉烯合酶。用毛细管气相色谱 质谱联用对酶促反应产物进行分析 ,结果表明 ,融合的紫杉烯合酶能催化产生 4(5 ) ,11(12 )_紫杉烯     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析

以耐盐的菠菜mRNA为模板,经反转录合成甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因第一链cDNA。在人工合成的两端引物引导下,通过多聚酶链式反应(PCR),扩增获得双链cDNA。把重组有BADH基因的pUC19转化至E.coli DH5α菌株,亚克隆后测定了基因的全序列。所得到的BADH基因全长序列为1491bp,编码497个氨基酸。与文献报道的相比较,核苷酸序列同源性99.8％,氨基酸序列同源性达99.6％。在此基础上,构建了BADH基因的高等植物表达载体。     

内蒙古白绒山羊IGF-IR基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊IGF-IR基因并分析其基本表达模式.采用RT-PCR克隆基因,将得到的IGF-IR基因cDNA片段的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析.半定量RT-PCR进行组织特异性表达检测.获得了内蒙古白绒山羊IGF-IR基因3’端编码区2118 bp的cDNA序列(JN200823),编码705个氨基酸残基.核苷酸序列与牛的IGF-IR( XM606794.3)基因同源性为98％,相应的氨基酸序列同源性为99％.SMART分析表明,推导出的编码蛋白具有跨膜域,酪氨酸激酶催化域.半定量RT-PCR检测表明,IGF-IR基因在绒山羊脑、胰腺、肝、肾组织中均有表达.     

刺五加鲨烯合酶基因cDNA的克隆与序列分析

采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参鲨烯合酶基因(squalene synthase gene,SS) cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SS基因的cDNA序列.克隆得到长度为1258 bp的刺五加SS基因cDNA序列,开放阅读框全长1248 bp,编码415个氨基酸残基,GenBank登录号为HQ456918,与人参的SS1、SS2和SS3氨基酸序列一致性分别为91.73％、97.59％和96.63％.首次分离并报道了刺五加SS基因cDNA序列,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机理研究提供参考.     

花生白藜芦醇合酶基因的克隆与生物信息学分析

利用Protparam、iPSORT prediction、ProtScale、SOPMA、Swiss-Modeling和Scan Prosite等生物信息学工具分别对其理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、二级结构和三级结构进行分析。以花生粤油45总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆花生白藜芦醇合酶基因的DNA和cDNA序列,并利用SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其基因和蛋白质序列进行了分析。测序结果显示,该基因的DNA和cDNA序列长度分别为1 498 bp和1 251 bp,cDNA序列具有完整的开放性阅读框,编码389个氨基酸的多肽。该白藜芦醇合酶氨基酸368-378位点上存在芪合酶家族的特征位点GVLFGFGPGLT。同源性分析表明,其碱基序列与已报道的花生白藜芦醇合酶基因的一致性为99%,其氨基酸序列与已报道的花生白藜芦醇合酶氨基酸序列的一致性为100%。     

中国野生毛葡萄芪合成酶基因克隆及表达分析

采用RT-PCR技术克隆中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因,命名为VqDSTS1,并进行序列及表达模式分析.结果表明:VqDSTS1基因cDNA编码区全长为1 179bp,GenBank登录号为JQ342086,编码392个氨基酸;氨基酸序列分析表明,VqDSTS1含有芪合成酶基因家簇的特征识别序列‘IPNSAGAIAGN’和‘GVLFGFG-PGLT’;序列比对显示,VqDSTS1与其他葡萄种质的芪合成酶氨基酸序列一致性在95.2%～98.7%之间;半定量RT-PCR分析表明,VqDSTS1受白粉病诱导表达,呈双峰模式.为进一步研究中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因家族的表达及功能分析提供了基础.     

穿心莲ent-柯巴基焦磷酸合酶基因的克隆与生物信息学分析

旨在克隆穿心莲CPS的编码基因,并进行序列分析.通过RT-PCR和cDNA末端快速扩增的技术从穿心莲叶片中获得目的基因;并利用生物信息学的方法对其编码蛋白进行功能分析.结果显示,获得了全长2 499 bp的cDNA序列,编码一个833aa的蛋白.序列同源性比较表明,该蛋白与野甘草、咖啡等其他植物来源的CPS具有较高的同源性.保守功能结构域分析显示,该蛋白包含一个富含Asp残基的植物萜类合酶的共有保守功能域“DXDD”,归属于萜类生物合成酶Ⅰ类超级家族和顺式聚异戊二烯焦磷酸合酶超级家族.初步推测克隆得到了穿心莲CPS的编码基因(命名为ApCPS,GenBank登录号为JN216843.1).     

草莓MDHAR及AO基因的克隆及序列分析

从新鲜幼嫩‘丰香’草莓(Fragaria×ananassa cv.Toyonaka)果实中提取分离总RNA,反转录成cDNA,根据已报道的其他植物单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)及抗坏血酸氧化酶(AO)基因的保守区分别设计 一对引物,通过PCR扩增均得到目的条带.序列分析发现:mdhar基因片段长372bp,与刺梨同源性最高达96％,该片段编码123个氨基酸,推导的氨基酸序列与苹果属植物同源性为91％,与其他植物该基因编码的氨基酸序列也有较高相似性;a基因片段长842 bp,编码280个氨基酸,该片段与其他多种植物的ao基因均具有较高同源性,与甜瓜和黄瓜ao基因的同源性最高,均为70％,编码的氨基酸序列与其他多种植物均具有70％左右的相似性.     

一个新高产青蒿倍半萜合酶基因的克隆、表达和分析

用RACE方法从青蒿（Artemisia annua L.)高产株系001中克隆了一个新的1886bp的全长倍半萜合酶cDNA。克隆的倍半萜合酶氨基酸序列与烟草马兜铃烯合酶,莨菪岩兰螺旋二烯合酶,棉花杜松烯合酶的一致性分别为39％,38％和41％;与青蒿柏木脑合酶,紫穗槐二烯合酶和一个推测的倍半萜合酶克隆cASC125的一致性为50％,48％和59％。cDNA编码区序列被克隆进原核表达载体pET-30a,并在大肠杆菌（Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达,但过量表达的蛋白主要是以不溶性蛋白形式存在。Northern blotting分析表明此基因在茎,叶,花中表达,在根中没有表达。     

野生茄子（Solanum torvum）抗黄萎病相关基因Sto Vel的克隆与分析

采用RT—PCR和RAcE技术从野生茄子中扩增克隆到一个抗黄萎病相关基因,命名为StoVel,其cDNA全长3400bp,含有3153bp的完整开放阅读框,编码1051个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与刚果野茄、类番茄和番茄Vel编码的氨基酸序列同源性分别为82％、81％和80％,且有很高的功能区段保守性。将该cDNA全长序列提交Gen Bank,登陆号为DQ020574。半定量PCR表明该基因为组成型表达,在根中表达最多,叶中最少。     

梨α-法尼烯合成酶基因的克隆及其序列分析

利用RT-PCR技术从鸭梨的果皮中获得了一个全长为1824bp的α-法尼烯合成酶基因(α-Farnesene Synthase,PFS)克隆,该cDNA包含一个由1728个核苷酸组成的开放阅读框架,编码分子量约66kDa的576个氨基酸残基的蛋白质。序列相似性分析结果表明,它与苹果中克隆到的AFS1基因具有很高的同源性,核苷酸序列一致性为97.34%,且具有典型的萜类合成酶基因保守结构域。与来源于黄瓜、杉树、松树的α-法尼烯合成酶基因的同源性较低。