microRNA499 慢病毒载体转染诱导大鼠骨髓间充质干细胞 向心肌样细胞分化*

目的:探讨microRNA 499(miR-499)慢病毒转染对诱导大鼠骨髓来源间充质干细胞(BM-MSCs)向心肌样细胞分化的作用。方法:取第四代Wistar大鼠骨髓来源间充质干细胞进行流式细胞检测,鉴定干细胞表面特异标记物。使用符合干细胞鉴定标准的细胞批次用于后续实验。实验设置miR499慢病毒转染、慢病毒空白转染2个处理组,分别于处理后即日、1d,3d,5d,7d收集细胞进行下列实验:实时荧光定量PCR检测心肌重要转录因子GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达,western-blot检测心肌特异蛋白I(cTnI)的表达。结果:培养第四代Wistar大鼠骨髓来源间充质干细胞表达干细胞表面特异标记物,可用于实验。大鼠骨髓来源间充质干细胞microRNA 499慢病毒载体转染后microRNA 499表达明显升高,且转染后1d,3d,5d,7d,GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达逐渐增强。慢病毒空白转染组未见明显变化。western-blot检测自第3天开始可见cTnI阳性表达条带,慢病毒空白转染组未检测到明显阳性表达条带。结论:microRNA 499可诱导大鼠骨髓来源间充质干细胞向心肌样细胞分化。     

3种间充质干细胞成软骨分化潜能比较

目的:比较骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞3种间充质干细胞的成软骨分化潜能,为软骨组织工程中种子细胞的选择提供实验依据。方法:采用贴壁法分别分离提取兔骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞3种间充质干细胞,并进行传代培养,绘制3种间充质干细胞的生长曲线并比较其倍增时间。将3种间充质干细胞成软骨诱导14 d后,行甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化染色以观测3种细胞成软骨分化能力。结果:脂肪间充质干细胞的倍增时间短于骨髓间充质干细胞,滑膜间充质干细胞的倍增时间最短;3种细胞成软骨诱导14 d后均产生糖胺聚糖和II型胶原,且组与组之间II型胶原表达水平的差异有统计学意义,骨髓间充质干细胞组高于脂肪间充质干细胞组(P0.01),滑膜间充质干细胞组高于骨髓间充质干细胞组(P0.01)。结论:在一定的培养条件下,3种间充质干细胞均有一定的成软骨细胞分化潜能,滑膜间充质干细胞最快的增殖速度及最强的成软骨分化潜能。     

腺病毒载体与慢病毒载体感染骨髓间充质干细胞的比较

随着基因治疗的发展,建立高效稳定表达目的基因的载体和靶细胞成为目前研究的热点.骨髓间充质干细胞具有自我复制,高度的增殖能力,多向或定向分化的潜能等优势,是细胞和基因工程中的理想靶细胞.而腺病毒载体和慢病毒载体作为基因载体均能将目的基因导入宿主细胞,因此对腺病毒载体和慢病毒载体的结构、分类、优缺点以及感染骨髓间充质干细胞的转染效率等方面做简要的分析.     

表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化的体外研究

目的:研究表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化的可能性。方法:体外培养骨髓间充质干细胞,利用流式细胞仪分析其细胞表型。采用含EGF的培养液诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化,并利用免疫荧光法进行鉴定。结果:从骨髓中分离培养的细胞具有成纤维细胞样形态,贴壁生长,表型相对均一,表面标志为CD90、CD44、CD147阳性;而CD34、CD38、CD45、CD14、HLA-DR阴性。体外诱导后可以得到神经干细胞标志物nestin、神经胶质细胞标志物GFAP和视网膜光感受器细胞标志物Rhodopsin呈阳性表达的细胞。结论:从骨髓中分离培养得到的间充质干细胞具有向视网膜神经细胞分化的潜能。     

不同强度静电磁场对体外培养骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响

本实验研究不同强度静电磁场对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化作用. 体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传代后随机分为6组,分别用强度为0（对照组）、0.9、1.2、1.5、1.8和2.1 mT的静电磁场处理,每d每次处理30 min. 在磁场处理后的9~10 d ,骨髓间充质干细胞开始出现钙化小颗粒. 0.9 mT组抑制骨髓间充质干细胞增殖,1.5到2.1mT组促进骨髓间充质干细胞增殖. 在磁场处理后的12 d和15 d ,1.5和1.8 mT组极显著地增加了碱性磷酸酶(AKP)活性. 采用AKP组织化学染色和钙化结节染色对骨髓间充质干细胞成骨性分化进行鉴定,AKP组织化学染色和钙化结节染色都呈现了极强的阳性结果,尤以1.5 mT和1.8 mT阳性染色面积最大. 在SEMFs处理后的48 h 和96 h ,1.5 mT和1.8 mT组胶原I(collagen-Ⅰ)和骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2, Bmp-2) 基因表达水平显著高于对照组.在SEMFs处理后的12 d, BMP-2蛋白表达量高于对照组. 研究表明,0.9 mT 组抑制骨髓间充质干细胞增殖,1.5 mT到2.1 mT组不同强度静电磁场促进体外培养骨髓间充质干细胞的增殖. 磁场组能促进骨髓间充质干细胞成骨性分化,其中尤以1.5 mT和1.8 mT组促进大鼠骨髓间充质干细胞分化作用效果最为明显.     

对比不同年龄段食蟹猴骨髓间充质干细胞的生物学特征

骨髓间充质干细胞因其广泛的临床应用前景而备受关注.非人灵长类动物在基因、生理和代谢等方面与人类相似,在制作疾病模型和疾病治疗研究等方面具有无可比拟的优势.因此,来源于非人灵长类的骨髓间充质干细胞是细胞移植和组织工程研究中的重要工具.本实验对比研究了不同年龄段食蟹猴骨髓间充质干细胞的生物学特征.结果发现,与中年食蟹猴骨髓间充质干细胞比较,青少年食蟹猴骨髓间充质干细胞具有明显高的增殖和分化潜能.长期体外培养的食蟹猴骨髓间充质干细胞能发生自发转变,转变后的细胞具有明显不同于骨髓间充质干细胞的形态特征.端粒酶活性检测显示,各年龄组不同代数的骨髓间充质干细胞端粒酶活性没有明显差别,但与骨髓间充质干细胞比较,转变后的细胞端粒酶活性显著增高.另一方面,随着体外培养时间延长,染色体不稳定性发生频率相应增加.这些结果提示在使用间充质干细胞进行实验或临床研究前,必须全面考虑各种因素,包括供体的年龄等,并且完善各种检测.     

慢病毒介导KCNMA1体外转染大鼠间充质干细胞及功能测定

间充质干细胞具有高度增殖、自我更新和多向分化的潜能。大电导钙离子激活的钾通道M亚族α亚基（potassium large conductance calcium-activated channel,subfamily M,alpha member 1,KCNMA1）介导细胞内K＋的外流,使细胞膜超极化,降低细胞的兴奋性。该研究通过制备KCNMA1重组慢病毒载体和空白对照慢病毒载体,将其转染至间充质干细胞内,测定转染复数值（MOI）,并通过RT-PCR和Western blot比较转染前后KCNMA1的表达变化情况,检测转染前后细胞微环境中电解质浓度变化。结果成功包装了KCNMA1慢病毒载体和空白病毒载体并转染入干细胞内;含有目的基因的慢病毒转染间充质干细胞后,RT-PCR和Western blot提示KCNMA1过表达,且细胞微环境中K＋浓度升高。证实成功地将含KCNMA1的慢病毒载体转染进入大鼠间充质干细胞内,并在细胞内过表达且发挥功能,为体内研究KCNMA1结合干细胞治疗相关疾病奠定了基础。     

再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞生物学特性的初步研究

目的:研究再生障碍性贫血(aplasticanemia,从)患者骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的生物学特性和初步探讨其异常和AA发生的可能关系。方法:取AA患者骨髓间充质干细胞,测定其生长曲线和倍增时间;流式细胞仪检测其细胞周期和免疫表型;体外定向诱导其向脂肪、成骨、内皮和神经细胞分化;用real-timePCR及油红O染色法比较AA和正常对照组MSCs的成脂分化的不同。结果:AA患者和正常成人的MSCs均呈梭形贴壁生长;AA组细胞倍增时间长于对照组;CD105、CD44、CD29、CD106、FlK-1均阳性;96．51％的细胞处在G0／G1期;AA患者的MSCs保持了多向分化潜能,体外诱导形成脂滴较对照组早,诱导早期的脂蛋白脂酶表达增高。结论:再生障碍性贫血患者的骨髓间充质干细胞增殖能力较正常成人弱,骨髓间充质干细胞的易成脂性可能参与了再障的发病环节。     

Reconstitution of Telomerase Activity Extends the Proliferative Life-span and Maintains the Neurogenetic Potential of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Fetal Muscle

目的 :通过重建端粒酶活性延长胎儿肌肉源间充质干细胞寿命 ,并对其成神经潜能进行研究 ,为组织工程神经修复提供种子细胞。方法 :将人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因通过脂质体转染法导入胎儿肌肉源间充质干细胞 ,RT PCR检测hTERTmRNA的表达 ,TRAP PCR检测细胞端粒酶活性。用bFGF诱导已重建端粒酶活性的肌肉源间充质干细胞向神经细胞分化 ,免疫荧光及免疫印迹法检测分化情况。结果 :转染hTERT的胎儿肌肉源间充质干细胞能稳定表达端粒酶活性。转染后传 75代的细胞经bFGF诱导仍维持着自我更新及向神经细胞分化的潜能 ,且无恶性转化倾向。结论 :重建端粒酶活性可延长胎儿肌肉源间充质干细胞寿命并维持自我更新及成神经潜能 ,为建立组织工程标准细胞系提供了新的实验手段     

DDR2基因缺失对小鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的:骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是骨再生工程中重要的种子细胞,它对骨组织缺损的修复有着良好的效果。但是BMSCs向成骨细胞分化并修复骨组织缺损是是由细胞外因子共同作用产生的结果。DDR2(Discoidin Domain Receptor 2)作为I型胶原的特异性受体在成骨细胞的分化中发挥重要的调节作用。而对于其在BMSCs向成骨细胞的分化过程中的所起到的作用还鲜有研究,对其作用机理尚不明确。因此我们希望通过分离、培养并鉴定比较DDR2基因缺失小鼠与野生型小鼠来源的骨髓间充质干细胞了解其生物学特性,为后续的实验奠定理论基础。方法:采用改良型的全骨髓贴壁细胞分离方法分离培养两种小鼠来源的骨髓间充质干细胞,采用流式细胞技术鉴定其表面标记物的表达,并利用诱导培养液诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成脂肪细胞分化。结果:分离培养的两种骨髓间充质干细胞形态一致,增殖能力和自我更新能力强,流式细胞术检测其表面标记物CD29,Sca-1均表达阳性,CD105,CD45表达为阴性,分离得到的两种细胞均有向成骨细胞和成脂肪细胞分化的能力,但可以明显观察到DDR2基因缺失小鼠的骨髓间充质干细胞的成骨分化能力减弱。结论:本实验通过对于DDR2基因缺失小鼠BMSCs分离、培养和鉴定,初步探索DDR2基因缺失在在成骨过程中的作用结果,为进一步研究提高BMSCs的成骨分化能力奠定理论基础。经实验证明,DDR2基因缺失小鼠来源的骨髓间充质干细胞虽然仍具备干细胞的生物学特性,但其向成骨细胞的分化能力明显减弱,说明DDR2基因缺失对其骨髓间充质干细胞的成骨分化等有着重要的影响。