家蚕核型多角体病毒的PCR检测及其部分序列分析

为研究应用PCR技术进行家蚕核型多角体病毒广东株的敏感性检验以及探讨不同地理株系的基因水平的相互关系,本文通过对家蚕核型多角体病毒BmNPV广东株的人工繁殖与纯化,引用了一对根据多角体蛋白基因设计的引物phy35/phy36,对BmNPV的基因组模板DNA进行了PCR扩增,并对其产物进行测序分析.结果显示,PCR技术均可扩增检测出3×108个/mL至3×102个/mL不同浓度的BmNPV模板DNA,特异目标片段大小约为680 bp,且扩增带的亮度随着病毒液浓度的降低而减弱,说明应用引物phy35/phy36进行PCR方法可以有效地应用于检测BmNPV病毒感染的家蚕.同时,测序获得了BmNPV广东株多角体蛋白polyhedrin基因674 bp大小的片段,GC含量为46.4%.经过BLAST比对分析,与BmNPV泰国株的相似性为99%,暗示家蚕BmNPV广东株与泰国株的BmNPV (登录号AY779044)亲缘关系非常相近,两者可能属于BmNPV的不同地理株系.通过系统发育树的进一步分析发现,家蚕核型多角体病毒广东株polyhedrin基因部分序列与家蚕NPV分离株S9多角体蛋白基因(DQ231336)关系很近.     

拯救细胞系恢复重组家蚕核型多角体病毒包涵体实现外源蛋白在家蚕中产业化生产

构建家蚕Bombyx mori肌动蛋白（BmA3）启动子驱动的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）多角体基因（ph）和OpNPV极早期启动子（IE1）驱动的zeocin抗性筛选基因转座供体载体,与鳞翅目辅助转座质粒pie2piggyBac共转染家蚕卵巢细胞BmN,经200μg/ml zeocin抗生素筛选一个月,成功获得持续表达BmNPV多角体蛋白的稳定细胞系BmN-A3ph。多角体缺陷型重组病毒BmBac-GF P感染拯救细胞系BmN- A3ph, 细胞成功装配出病毒包涵体颗粒,其包装效率约为野生型病毒感染正常BmN细胞的8%。用拯救型包涵体病毒颗粒喂食家蚕幼虫进行复感染,结果表明稳定细胞系所包装的包涵体病毒与野生型病毒一样能够通过口服途径感染宿主,却并不在宿主体内形成包涵体,从而保证外源基因高效表达。拯救型包涵体病毒可望解决传统注射感染效率较低问题,通过喂食感染可促进杆状病毒介导的家蚕生物反应器产业化进程。     

家蚕抗核型多角体病毒病育种研究进展

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhydrosis virus,BmNPV)病是蚕业界上最常见、危害比较严重的病害;遗传学研究和抗性分析表明,家蚕对核型多角体病毒抗性由主效基因和微效基因协同控制。在蚕病防治方面,除了加强消毒以外,选育抗病毒新品种无疑是更加经济有效的办法。近年来,随着基因组学和新一代测序技术的迅猛发展,覆盖深度达8.5倍家蚕基因组图谱完成和40个家蚕品种和野生种重测序的完成,为家蚕的抗核型多角体病毒病育种提供了理论依据和基因资源。本文综述了BmNPV基因组研究、家蚕基因组研究以及家蚕抗性品种培育方面取得的进展。     

从广西蚕区分离的家蚕质型多角体病毒生物学特征研究

【背景】家蚕中肠型脓病是一种传染性强、危害大的病毒病,其病原为家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV）,该病原抗逆性强、宿主域广,防控难度大。【目的】调查广西蚕区家蚕中肠型脓病发生情况,并研究家蚕质型多角体病毒的感染性、形态特征和分子鉴定,为养蚕生产中有效防控该病提供参考依据。【方法】通过外观和解剖观察病症与显微镜检验相结合,调查养蚕生产家蚕中肠型脓病的发生率;采用生物试验方法测定多角体病毒对家蚕的半数感染浓度（IC₅₀）;利用光学显微镜和扫描电镜观察多角体病毒的外部形态,利用透射电子显微镜观察多角体病毒的内部结构;采用PCR扩增和测序进行分子鉴定。【结果】广西蚕区家蚕中肠型脓病普遍存在,金城江蚕区和东兰蚕区的家蚕中肠型脓病平均发生率分别为6.06%和13.02%,最高发生率达到30.41%;分离获得2株BmCPV病原（暂命名为BmCPV-J和BmCPV-D）,它们的半数感染浓度（IC₅₀）分别为4.88×10³ PIBs/mL和1.63×10⁴ PIBs/mL,都具有很强的致病性;2株BmCPV的形态均为六角形多角体,大小有差异,多角体直径为1.0-3.4 μm;从2株BmCPV内部结构观察到球形病毒粒子,直径为30-50 nm,有刺状突起;可以扩增出BmCPV-J和BmCPV-D的RNA复制酶基因目的片段,BmCPV-J的目的片段序列与BmCPV参考株一致,而BmCPV-D的目的片段序列与参考株有2个碱基的差异。【结论】广西蚕区家蚕中肠型脓病危害严重,该病病原感染力强、分布广,多角体病毒具有典型的质型多角体病毒特征,属于家蚕质型多角体病毒。研究结果为养蚕生产中有效防控家蚕中肠型脓病提供重要依据。     

以核多角体病毒为载体在家蚕中生产外源蛋白

以家蚕核多角体病毒(BmNPV)为载体,在家蚕幼虫或家蚕培养细胞系中表达的外源基因越来越多,其表达的产物已涉及到医用药物、医疗诊断、疫苗生产、生物防治等诸多领域,文章就BmNPV的特性及其基因组构造,多角体蛋白基因的特性,重组BmNPV的构建及其在家蚕幼虫体内和细胞系中的表达,BmNPV-家蚕表达系统的外源蛋白生产效率及其应用等各个方面作了全面、系统的综述.     

抗BmNPV即刻早期蛋白三联ribozyme在家蚕细胞中的表达

为了阻断家蚕核多角体病毒（BmNPV）的基因表达,以BmNPV的即刻早期蛋白基因(IE)为靶序列,设计了三联ribozyme．体外切割反应表明,该ribozyme能特异地切割靶序列的mRNA;细胞实验表明,细胞中表达的ribozyme也能够特异地切割靶序列,从而使受BmNPV感染的Bm-N细胞中的多角体减少约30％．     

家蚕中肠组织抗核型多角体病毒病的相关蛋白分析

家蚕中肠上皮是病毒经口侵入遇到的第一个组织。昆虫幼虫抵御杆状病毒的感染,可通过选择性的使感染的中肠上皮细胞发生调亡并在释放病毒粒子进入血淋巴之前使感染的细胞从中肠脱落。为研究家蚕抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)病的机制,通过对BmNPV高度抗性和高度敏感性的家蚕品系杂交和回交构建了近等基因系。本文对家蚕高抗,敏感及近等基因系5龄起蚕中肠组织的蛋白质表达谱进行了二维电泳 (two-dimensional gel electrophoresis,2-DE) 分析,并利用基质辅助激光解吸电离飞行时间 (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight, MALDI-TOF) 质谱对差异蛋白进行鉴定。结果发现了5个差异表达的蛋白。推测这些蛋白可能与家蚕中肠对BmNPV的抗性或感性有关。     

异源多角体蛋白对家蚕核型多角体病毒粒子的包装

利用PCR方法从AcMNPV基因组DNA中分离出多角体蛋白基因 ,将该扩增片段克隆到转移载体pBacPAK8中 ,得到重组转移载体pOAc。将该质粒DNA与线性化的Bm BacPAK6病毒基因组DNA共传染BmN细胞 ,得到了能形成多角体且不产生蓝色空斑的重组病毒hp BmNPV。纯化该重组病毒的多角体颗粒 ,并对多角体蛋白、病毒核酸及多角体病毒颗粒进行分析 ,发现AcMNPV的多角体蛋白能在家蚕细胞中大量表达且能在细胞内识别家蚕核型多角体病毒并组装成多角体颗粒 ;病毒基因组DNA因部分交换 ,其酶切行为发生了相应的变化 ;电镜观察发现经AcMNPV多角体蛋白包装的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒大小为1 2 μm～ 2 9μm ,明显小于野生型家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒     

应用环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测家蚕核型多角体病毒的研究

由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopoyhedrosis virus,BmNPV)侵染家蚕Bombyx mori引起的家蚕核型多角体病(血液型脓病)在养蚕生产中发生较为普遍,对蚕业生产造成重大的经济损失。本研究建立了快捷有效的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)用于快速检测BmNPV,为蚕业生产提供了一个有效检测BmNPV和进行早期诊断的技术。该方法是针对BmNPV的pe38基因的6个区段设计的6条引物用于扩增检测,整个反应在恒温条件63℃下进行25 min,扩增产物用电泳法和可视法检测(用SYBR Green I染色)。结果显示,LAMP检测方法的灵敏度是常规PCR方法的100倍,能检测的范围为21个拷贝。另外,用4.86×108OBs/mL感染4龄起蚕,提取血淋巴DNA为模板,PCR在感染36 h后检出病毒DNA,LAMP法能检测感染12h后的样品。     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

家蚕核多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus.BmNPV)和家蚕细胞已成功地用来大量生产具有生物活性的重组蛋白。但是BmNPV的通用载体的类型较少。因此,本实验构建了BmNPV新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的 12位外连接有5个外源基因的克隆位点。将HuIFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的 12位后,构建了pBmIFN 12;同时构建HuIFN-β克隆在-3位后的转移栽体pBmIFN-3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm-N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN-β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN 12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性最高时可达2.0×10~6IU/ml,将BmIFN 12注射5龄家蚕虫体,表达水平为50×10~7IU/ml,是HuIFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒的表达量的2～4倍。家蚕体生产的rHulFN-β为糖基化蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

更换饲料对家蚕幼虫肠道细菌组成的影响及关键物种与产茧性能的相关性

【目的】本研究探讨使用人工饲料部分替代桑叶饲育后家蚕Bombyx mori幼虫肠道细菌群落的变化情况,并分析人工饲料替代桑叶的不同饲育模式下肠道关键细菌与蛹重和茧层量的相关性,为人工饲料部分替代法饲育家蚕的实际应用提供理论依据。【方法】采用全龄桑叶育(Mul1-5)、1-2龄人工饲料育+3-5龄桑叶育(Art1-2)、1-3龄人工饲料育+4-5龄桑叶育(Art1-3)、1-4龄人工饲料育+5龄桑叶育(Art1-4)和全龄人工饲料育(Art1-5) 5种饲养模式饲养家蚕幼虫,统计5种饲养模式下家蚕的全茧量、茧层量及蛹重;收集不同饲养模式下家蚕5龄幼虫肠道样品,通过高通量测序技术分析其肠道菌群的组成和多样性差异,采用Spearman相关性热图分析肠道细菌与蛹重和茧层量的相关性。【结果】人工饲料与桑叶不同搭配的饲育模式对家蚕茧质有显著的影响,Mul1-5和Art1-5的全茧量最高,二者无显著性差异,Art1-2其次; Mul1-5茧层量最高,Art1-2其次,Art1-5茧层量最低。在不同饲育模式下,家蚕肠道细菌多样性和组成显著不同：在门水平上,Art1-2和Mul1-5的细菌组成最相近,优势菌主要是变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),而Art1-3, Art1-4和Art1-5的细菌组成最相近,变形菌门丰度随着人工饲料饲养时间的增加逐渐增加,厚壁菌门的丰度则呈现相反的趋势;在属水平上,家蚕肠道优势菌属有假单胞菌属Pseudomonas、肠球菌属Enterococcus、鞘脂单胞菌科未分类菌属Sphingomonadaceae unclassified及罗尔斯通菌属Ralstonia等。不同饲育模式下家蚕肠道菌属丰度差异最大的是肠球菌属,Art1-2组中肠球菌属丰度最高(40.9%),随着人工饲料饲养时间的延长,丰度逐渐降低,在Art1-5中仅为0.02%。家蚕肠道菌群大部分关键物种均与茧质呈一定的相关性：柯克斯体属Coxiella与蛹重呈显著正相关,与茧层量呈显著负相关;葡萄球菌属Staphylococcus与蛹重呈显著负相关;肠球菌属与茧层量呈显著正相关。【结论】饲育模式Art1-2最接近于Mul1-5,可为人工饲料部分替代桑叶饲育法饲育家蚕提供参考。人工饲料部分替代桑叶后家蚕肠道菌群结构发生了显著变化,肠球菌属丰度的显著降低及假单胞菌属的显著增加可能与全龄人工饲料养家蚕体质弱有关;一些关键细菌与家蚕蛹重和茧层量存在显著相关性,其影响机制需要进一步研究。     

IN VITRO ANTIVIRAL ACTIVITY OF AN ALKALINE TRYPSIN FROM THE DIGESTIVE JUICE OF Bombyx mori LARVAE AGAINST NUCLEOPOLYHEDROVIRUS

Alkaline trypsin protein of molecular mass 25,436 Da purified from the digestive juice of Bombyx mori larvae indicated strong antiviral activity against Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) under in vitro conditions. Partial N-terminal amino acid sequence of the protein was determined and the cDNA was cloned based on the amino acid sequence. A homology search of the deduced amino acid sequence of the cDNA showed 55% identity with Helicoverpa armigera trypsin and the active site of this protein was completely conserved. Hence, the protein was designated B. mori trypsin (Bmtryp). The results suggest that Bmtryp, an insect digestive enzyme, can be a potential antiviral factor against BmNPV at the initial site of viral infection.     

Development and Leaf Consumption by Spodoptera cosmioides (Walker) (Lepidoptera: Noctuidae) Reared on Leaves of Agroenergy Crops

Spodoptera cosmioides (Walker) (Lepidoptera: Noctuidae) is a polyphagous pest that threatens more than 24 species of crop plants including those used for biodiesel production such as Ricinus communis (castor bean), Jatropha curcas (Barbados nut), and Aleurites fordii (tung oil tree). The development and leaf consumption by S. cosmioides reared on leaves of these three species were studied under controlled laboratory conditions. The egg-to-adult development time of S. cosmioides was shortest when reared on castor bean leaves and longest when reared on tung oil tree leaves. Larvae reared on castor bean and Barbados nut leaves had seven instars, whereas those reared on tung oil tree leaves had eight. Females originating from larvae reared on castor bean and Barbados nut leaves showed greater fecundity than did females originating from larvae reared on tung oil tree leaves. Insects fed on castor bean leaves had shorter life spans than those fed on tung oil tree and Barbados nut leaves although the oviposition period did not differ significantly. The intrinsic and finite rates of increase were highest for females reared on castor bean leaves. Total leaf consumption was highest for larvae reared on tung oil tree leaves and lowest for those reared on Barbados nut leaves. We conclude that castor bean is a more appropriate host plant for the development of S. cosmioides than are Barbados nut and tung oil tree.     

桑蓟马在桑树中空间分布的研究

桑蓟马Pseudodendrothrips mori是桑树的一种主要害虫。它的寄生直接影响供桑叶的质量和产量。我们通过泰勒幂法则和Morisita的散度指标对桑树蓟马在植株和桑园内的空间分布进行检验,结果显示:P.mori种群在植株内和桑园里的分布都存在局部化。桑树中蓟马的分布在树内显示出幼虫蓟马位于低层(从上面叶子起5-10层),但成虫更喜欢上层(从上面叶子起1-5层)。同一植株叶子的不同方向上蓟马密度没有出现明显变化。桑园内蓟马主要分布在桑园东部、南部和北部的植株上,中部,西部植株上的蓟马密度较低。P.mori的成虫和幼虫在叶子上的分布呈现明显聚集化。     

家蚕消化管内桑叶的银染法研究

通过银染法对家蚕整体染色,结果表明:家蚕消化管内的桑叶由叶表皮、叶肉和叶脉组成。叶表皮包括上表皮和下表皮。上表皮细胞可分为三种:钟乳体细胞、绿色表皮细胞和黄色表皮细胞;下表皮内含有气孔;叶肉组织内含有晶体,其中海绵组织内的最多。家蚕消化管由前向后可分为前肠、中肠和后肠,由外向内依次为肌层、底膜、上皮细胞层、内膜。中肠最为发达,其发达的上皮细胞向内表面突起形成许多大的指突形皱褶;上皮细胞层内有圆筒形细胞、杯形细胞两种细胞,两者在形状、功能以及嗜银性等方面有所差异。家蚕消化管对桑叶不同组织的消化吸收效率有差异,上表皮吸收效率最高,下表皮和栅栏组织次之,最低的是海绵组织。采用动物细胞染色方法对植物细胞进行染色,并与常规植物学染色方法进行了比较;依据细胞嗜银性的不同,可将桑叶的上表皮细胞分为两种亚型。     

A lipase isolated from the silkworm Bombyx mori shows antiviral activity against nucleopolyhedrovirus

A protein showing strong antiviral activity against Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) was purified from the digestive juice of B. mori larvae. A homology search of the deduced amino acid sequence of the protein cDNA revealed 56% homology with Drosophila melanogaster lipase and 21% homology with human lipase. As lipase activity of the protein was confirmed in vitro, this protein was designated Bmlipase-1. Northern blot analysis showed that the Bmlipase-1 gene is expressed in the midgut but not in other tissues, nor is it activated by BmNPV infection. In addition, the Bmlipase-1 gene was shown not to be expressed in the molting and wandering stages, indicating that the gene is hormonally regulated. Our results suggest that an insect digestive enzyme has potential as a physiological barrier against BmNPV at the initial site of viral infection.     

Multiple sources of esterase enzymes in the crop juice ofCepaea (Mollusca: Helicidae)

Summary Previous workers have (a) compared pulmonate crop juice and digestive gland extracts and found a close similarity in the enzymic complements from these two sources, and (b) located specific enzymes within the various cell types of the digestive gland. The digestive gland seems to be the major source of extracellular enzymes but what is not clear is which of the enzymes associated with particular intracellular structures are actively secreted into the crop juice. The present study has used polyacrylamide disc gel electrophoresis to investigate the digestive gland and crop juice esterases ofCepaea nemoralis andC. hortensis. It appears that only some of the digestive gland esterases are specifically secreted. The variation shown in crop juice esterases suggests three independent sources in the digestive gland. Less detailed studies ofHelix aspersa andArianta arbustorum also indicate multiple sources of extracellular esterases.     

Effect of different artificial diets on diapause induction under controlled temperature and photoperiod in the silkworm, Bombyx mori L.

ABSTRACT. Embryonic diapause of the silkworm, Bombyx mori , is generally induced by temperature and photoperiod during the egg stage of the previous generation and not in the larval stage. However, when silkworm larvae are reared on an artificial diet instead of mulberry leaves, their diapause is strongly affected by temperature and photoperiod experienced in the larval stage, with a distinct long-day response for diapause induction. Moreover when larvae which have been reared on artificial diet under long-day condition are fed mulberry leaves even for a short period of time, most of the resultant female adults lay diapause eggs. These results suggest that the photoperiodic response of larvae for diapause induction may be strongly suppressed by some components in mulberry leaves.     

烟粉虱对四种蔬菜寄主的选择性

为探讨利用趋避作用防治烟粉虱的可能性,进行了3方面试验：1）烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius) 对黄瓜、花椰菜、油菜和莴苣等4种蔬菜的寄主选择性; 2）互喷烟粉虱不同嗜好的寄主植物汁液对其寄主选择性的影响; 3）不同间作方式对黄瓜叶上烟粉虱成虫密度的影响。结果表明,烟粉虱对供试植物有明显的选择性,其嗜好程度为花椰菜>黄瓜>油菜>莴苣。喷施莴苣和花椰菜汁液对烟粉虱的寄主选择性均有显著影响,喷施莴苣原液后,花椰菜和黄瓜上的成虫数分别减少79.6%和87.4%,花椰菜上的着卵量减少84.3%;喷施花椰菜原液后,莴苣上的成虫数和着卵量分别增加82.4%和79.2%,表明不同蔬菜中的内含物是引起烟粉虱对寄主选择性的重要原因。在黄瓜中间作莴苣可使黄瓜叶上烟粉虱成虫数平均减少76.5%;间作花椰菜时,通过诱集作用,也可使黄瓜叶上的成虫数平均降低69.7%。这些结果为利用喷施蔬菜汁液和间作方式控制烟粉虱危害提供了理论依据。     

不同饲料饲养家蚕其肠道微生态优势菌群类型的组成及差异性

为探讨鳞翅目昆虫的生长发育及抗病性与肠道微生态状况的关系,以不同的桑科植物柘叶与桑叶分别饲养家蚕,采用纯培养分离检测技术、16S rDNA序列测定和系统发育分析方法,对4、5龄家蚕肠道优势菌群的类型进行了鉴定和差异性分析。结果表明:柘叶与桑叶饲养家蚕共有的优势菌群有短波单胞杆菌属(Brevundimonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)和葡萄球菌属(Staphylococcus)4个类群。从桑叶饲养家蚕肠道中检索到的优势菌群还有气单胞菌属(Aeromonas)、短杆菌属(Brevibacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)5个类群,而从柘叶饲养家蚕肠道中检索到的优势菌群仅有假单胞菌属(Pseudomonas)和土壤杆菌属(Agrobacterium)2个类群。饲料的改变导致家蚕肠道微生态细菌种群组成的变化,从柘叶饲养家蚕肠道中分离出的优势菌群与桑叶饲养的家蚕相比,出现较大差异且不如桑叶饲养家蚕的菌群丰富。推测这种改变可能与柘叶饲养家蚕生长发育不良、容易患病具有相关性。