超高静压在琥珀酸生产菌株选育中的应用

采用超高静压对一株产琥珀酸放线杆菌A3进行诱变育种, 进一步提高其生产性能。考察了压力、变压速度、生长期对菌株致死率的影响。在压力为200 MPa, 50 MPa/min变压速度的诱变条件下对稳定期菌株进行诱变, 筛选到一株突变菌株产琥珀酸放线杆菌B19, 琥珀酸产量达到 32.2 g/L, 比出发菌株A3提高了17.9%, 代谢副产物乙酸的产量降低了11.5%, 经过6次传代表明突变菌株具有稳定的遗传特性。     

一株丁二酸高产菌株的筛选和鉴定

从瘤胃中筛选到一株高产丁二酸生产菌株,为革兰氏阴性菌,短杆状,无芽孢,不运动,兼性厌氧.经形态学、生理生化鉴定和基于16S rRNA序列的系统发育分析,该菌株为巴斯德菌科的产琥珀酸放线杆菌,是产琥珀酸放线杆菌CCUG 43843的变种,二者的序列相似性为99.93%,命名为产琥珀酸放线杆菌A3.5L发酵罐分批发酵实验表明,当发酵培养基中葡萄糖浓度为50g/L时,产琥珀酸放线杆菌A3可以产25.8g/L丁二酸,具有较好的丁二酸生产潜力.     

耐铵型产琥珀酸放线杆菌的选育及铵离子对其生长代谢的影响

经硫酸二乙酯(DES)诱变,在含61～242mmol/LNH4+梯度平板中,筛选到一株耐铵型突变株YZ25,该菌株在含121mmol/LNH4+发酵培养基中,琥珀酸产量达32.68g/L,转化率为65.4%,比出发菌提高了180.5%。进一步考察了不同形态铵盐对YZ25生长的影响,结果表明添加少量铵盐能够提高突变菌的生长速率,但当超过一定量后菌株生长受到抑制,不同铵盐对菌株的抑制程度不同,硫酸铵、碳酸氢铵、氯化铵和硝酸铵对突变株YZ25的半抑制浓度分别为:215mmol/L、265mmol/L、235mmol/L、210mmol/L。为了考察铵离子对YZ25发酵产琥珀酸的影响过程,在3.0L发酵罐以氨水作为pH的调控剂发酵,结果表明在稳定期前菌株生长基本不受铵离子抑制,生物量能够达到正常水平,但是进入稳定期后铵离子抑制作用越来越明显,导致菌株生长提前结束,耗糖不完全,产酸受阻。最后结合产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes代谢途径分析了铵离子对菌株抑制作用的机理。     

一株丁二酸高产菌株的筛选鉴定及初步发酵研究

以牛胃内容物为菌源,利用富马酸钠为唯一碳源并加入高浓度丁二酸钠的选择培养基筛选到一株丁二酸产量较高,副产物较少的菌株。经形态学、生理生化鉴定和16S rDNA序列的系统发育分析,该菌株为巴斯德菌科的产琥珀酸放线杆菌,与琥珀酸放线杆菌S.JST序列相似性最高为98.98%,命名为琥珀酸放线杆菌GXAS137,保藏号为M2011399。利用正交试验对发酵条件进行了初步优化,该菌可发酵55 g/L葡萄糖产38.96 g/L丁二酸,具有较好的丁二酸生产潜力。     

基于代谢通量分析的琥珀酸放线杆菌高产选育研究

在对产琥珀酸放线杆菌代谢分析的基础上选育出高产突变株对琥珀酸的工业生物转化有重要意义.在矩阵分析代谢通量基础上,围绕柔性节点下的副产物乙酸及乙醇的降低分别实施软X诱变及定点突变选育,并对比分析了突变株与出发株相关酶活及基因序列变化.针对出发株的流量分析显示产物琥珀酸的代谢通量为1.78(mmol/g/h),主要副产物乙酸与乙醇的代谢通量分别为(0.60mmol/g/h)和(1.04 mmol/g/h),并发现乙醇代谢加剧了琥珀酸合成中的H电子供体的不足;筛选出的氟乙酸抗性突变株S.JST1的乙酸代谢通量降低了96%,为0.024(mmol/g/h),酶活检测表明磷酸乙酰转移酶(Pta)的酶比活力从602降低到74,进一步的序列对比分析发现pta突变基因中产生了一个突变位点:adh定点复合突变株S.JST2的乙醇代谢通量降低了98%,为0.020(mmol/g/h),酶活检测表明Adh的酶比活力从585降低到62.最终突变株S.JST2琥珀酸累积产量达65.7 g/L.围绕产琥珀酸放线杆菌Pta及Adh酶活的降低实施定向选育,在降低副产物流量的同时,有助于改善细胞H供体代谢平衡进而提高琥珀酸的流量.所获突变株具有工业应用潜力.     

产琥珀酸放线杆菌发酵生产琥珀酸的研究进展

近年来,因瘤胃微生物产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes具有高的琥珀酸产量,并能够利用多种碳源进行发酵等优点,在利用发酵法生产琥珀酸领域具有广泛的应用前景和商业化价值,因而其代谢途径和发酵工艺等基础研究成为国内外研发的热点。近年来,人们在产琥珀酸放线杆菌的代谢途径、琥珀酸发酵动力学模型、新型经济培养基以及高产菌株选育等方面的研究取得了很大进展,对研发琥珀酸发酵工艺、降低生产成本和节能减耗等具有重要的理论意义。     

琥珀酸放线杆菌的耐高浓度钠离子菌株选育

以琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593为出发菌,经过紫外线和甲基磺酸乙酯(EMS)诱变处理,选育出一株耐高浓度钠离子菌株SE-6.该菌株在5 L发酵罐中进行分批发酵,单独使用Na2CO3控制发酵过程pH,发酵48 h琥珀酸产量达到35.8g/L,较出发菌(26.0 g/L)提高了37.7%;若采用MgCO3和Na2CO3共同调控发酵过程pH,发酵48 h琥珀酸产量达到45.0 g/L,较出发菌(37.4g/L)提高了20.4%.     

基因组改组技术选育耐酸性琥珀酸放线杆菌

以琥珀酸产生菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593为出发菌,分别经过紫外线-甲基磺酸乙酯(UV-EMS)和紫外线-硫酸二乙酯(UV-DES)诱变处理,得到7株耐酸性有所提高的突变株.以此作为候选菌库,经3轮原生质体递进融合,筛选获得4株可以在pH 5.6下生长的改组菌株.其中改组菌株F3-21在pH 5.6的完全液体培养基中生长的OD值是原始菌的7倍,在pH 5.2条件下仍能生长;其摇瓶发酵48h琥珀酸产量较原始菌株提高48%.在5L发酵罐中进行分批发酵,当控制pH在较低值(5.6～6.0)时,F3-21厌氧发酵48h积累琥珀酸38.1g/L,较出发菌株提高了45%;当控制pH在6.5～7.0时,F3-21厌氧发酵32h积累琥珀酸40.7g/L.F3-21在5L发酵罐中进行补料分批发酵,厌氧发酵72h,产琥珀酸达67.4g/L.结果说明基因组改组技术能够改进琥珀酸放线菌的耐酸性能及其琥珀酸的产量.     

一株琥珀酸产生菌的筛选及鉴定

从牛的瘤胃中筛选获得一株能发酵生产琥珀酸的兼性厌氧菌。对其进行生理生化特性鉴定及16S rRNA基因分析。该菌株短杆状,无鞭毛,革兰氏染色阴性,V-P反应阴性,能发酵多种糖类产酸;其16S rRNA基因与琥珀酸放线杆菌的同源性高达99．8%,认为属于琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes),并将其命名为琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)SW0580,保藏号CGMCC 1593。初步发酵试验表明该菌能发酵60g/L葡萄糖产生25．8g/L的丁二酸。     

产琥珀酸放线杆菌的原生质体制备与再生

基因组重组技术是一项重要的菌种改造技术,原生质体制备和再生是进行基因组重组的前提和基础。目前少有关于产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC2650原生质体研究的报道。为了优化该菌的原生质体制备和再生条件,及利用基因组重组技术构建优良菌种提供参考,研究了甘氨酸预处理,菌龄,酶浓度,作用时间,温度对产琥珀酸放线杆菌原生质体制备和再生的影响,并考察了不同渗透压稳定剂对其再生的影响。结果表明,菌体在添加了0.6mg/ml甘氨酸的TSB培养基中培养5h后收集,用SMM稀释到OD660=1.0,用0.025mg/ml溶菌酶在37℃下酶解45min制备原生质体,将原生质体涂布于含0.3mol/L蔗糖的再生培养基中,再生率最大,达到40.9%。确定了产琥珀酸放线杆菌原生质体制备和再生的最佳条件,所用的原生质体制备的方法对琥珀酸的产生没有影响,这为进一步开展该菌的原生质体诱变及基因组重组等研究奠定了基础。     

环境因素对琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593发酵生产丁二酸的影响

琥珀酸放线杆菌是发酵生产有应用前景的生物基原料-丁二酸的微生物。本研究室从牛瘤胃中筛选获得一株琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593, 分析了环境气体、pH、氧化还原电位(ORP)环境因素对琥珀酸放线杆菌A. succinogenes CGMCC 1593发酵生产丁二酸的影响。结果表明: CO2不仅提供了A. succinogenes CGMCC 1593发酵生产丁二酸的最佳气体环境, 也是发酵生产丁二酸的底物之一; MgCO3是A. succinogenes CGMCC 1593发酵过程较好的pH调节剂, 发酵过程维持pH7.1~6.2, 可满足菌体生长与产酸的要求; 发酵液初始ORP过低, 不利于菌体生长, ORP在-270 mV时对丁二酸产生有利。在菌体对数生长期结束时, 通过Na2S·9H2O降低发酵液ORP到-270 mV, 发酵48 h时可产丁二酸37 g/L, 摩尔产率达到129%。这对深入研究A. succinogenes CGMCC 1593发酵生产丁二酸具有参考价值。     

Simultaneous saccharification and fermentation of acid-pretreated rapeseed meal for succinic acid production using Actinobacillus succinogenes

Rapeseed meal was evaluated for succinic acid production by simultaneous saccharification and fermentation using Actinobacillus succinogenes ATCC 55618. Diluted sulfuric acid pretreatment and subsequent hydrolysis with pectinase was used to release sugars from rapeseed meal. The effects of culture pH, pectinase loading and yeast extract concentration on succinic acid production were investigated. When simultaneous saccharification and fermentation of diluted acid pretreated rapeseed meal with a dry matter content of 12.5% (w/v) was performed at pH 6.4 and a pectinase loading of 2% (w/w, on dry matter) without supplementation of yeast extract, a succinic acid concentration of 15.5 g/L was obtained at a yield of 12.4 g/100g dry matter. Fed-batch simultaneous saccharification and fermentation was carried out with supplementation of concentrated pretreated rapeseed meal and pectinase at 18 and 28 h to yield a final dry matter content of 20.5% and pectinase loading of 2%, with the succinic acid concentration enhanced to 23.4 g/L at a yield of 11.5 g/100g dry matter and a productivity of 0.33 g/(Lh). This study suggests that rapeseed meal may be an alternative substrate for the efficient production of succinic acid by A. succinogenes without requiring nitrogen source supplementation.     

Actinobacillus succinogenes抗氟乙酸突变株的选育及其代谢流量分析

琥珀酸是一种用于合成树脂、可降解塑料及许多化学中间体的重要绿色化工原料。为了提高琥珀酸的发酵产率, 基于Actinobacillus succinogenes的代谢流量分布情况对其育种机制进行了研究。以Actinobacillus succinogenes CGMCC1593为原始菌株进行NTG诱变, 挑选在含有50~100 mmol/L氟乙酸平板生长较快的菌落, 经过初筛和复筛, 发现SF-9菌株产生更多琥珀酸且积累乙酸较少。以50 g/L的葡萄糖为碳源, 在5 L发酵罐上进行分批发酵, 该菌株发酵32 h时琥珀酸产量(34.8 g/L)提高了23.4%, 琥珀酸/乙酸比率为9:1, 副产物乙酸量比原始菌株降低了约50%。代谢流量分析(MFA)结果表明, PEP是影响琥珀酸合成的关键节点, PYR是影响乙酸等杂酸生成比例的关键节点, 并且这两个节点均非刚性节点。通过氟乙酸抗性诱变, 成功地筛选出了流向乙酸、甲酸和乳酸等杂酸的流量相对减少, 而流向琥珀酸的流量明显增强的突变菌株SF-9。     

Actinobacillus succinogenes抗氟乙酸突变株的选育及其代谢流量分析

琥珀酸是一种用于合成树脂、可降解塑料及许多化学中间体的重要绿色化工原料。为了提高琥珀酸的发酵产率, 基于Actinobacillus succinogenes的代谢流量分布情况对其育种机制进行了研究。以Actinobacillus succinogenes CGMCC1593为原始菌株进行NTG诱变, 挑选在含有50~100 mmol/L氟乙酸平板生长较快的菌落, 经过初筛和复筛, 发现SF-9菌株产生更多琥珀酸且积累乙酸较少。以50 g/L的葡萄糖为碳源, 在5 L发酵罐上进行分批发酵, 该菌株发酵32 h时琥珀酸产量(34.8 g/L)提高了23.4%, 琥珀酸/乙酸比率为9:1, 副产物乙酸量比原始菌株降低了约50%。代谢流量分析(MFA)结果表明, PEP是影响琥珀酸合成的关键节点, PYR是影响乙酸等杂酸生成比例的关键节点, 并且这两个节点均非刚性节点。通过氟乙酸抗性诱变, 成功地筛选出了流向乙酸、甲酸和乳酸等杂酸的流量相对减少, 而流向琥珀酸的流量明显增强的突变菌株SF-9。     

耐铵型产琥珀酸放线杆菌的选育

以Actinobacillus succinogenes NJ113为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)诱变,在含8～20 g/L硫酸铵平板中筛选到一株耐铵型突变株YZ25,该菌株在含8 g/L硫酸铵培养基中厌氧发酵,琥珀酸产量达32.68 g/L,比出发菌提高了180.5%,对葡萄糖收率达65.4%,副产物乙酸、甲酸产量分别下降3.5%、28.7%,琥珀酸/乙酸比值由0.63提高到2.5。在7.5 L发酵罐中,用氨水调节pH分批实验,发酵34 h琥珀酸产量达27.13 g/L,较出发菌株提高了85.3%。     

Optimization of culture conditions in CO2 fixation for succinic acid production using Actinobacillus succinogenes

The culture conditions in CO(2) fixation by Actinobacillus succinogenes for succinic acid production were investigated by a model of available CO(2) in a 3-l fermentor. The results from the model analysis showed that the available CO(2) for succinic acid production in the fermentation broth is the sum of HCO(3) (-), CO(3) (2-), and CO(2) influenced by external culture conditions such as medium components, CO(2) partial pressures, and temperature. The optimized conditions for CO(2) supply in a 3-l fermentor were determined as follows: CO(2) partial pressure and stirring speed were maintained at 0.1 MPa and 200 r min(-1), respectively, with a pH of 6.8 and a temperature of 37°C; 0.15 mol l(-1) NaHCO(3) was added. Under the optimized conditions, a CO(2) fixation rate of 0.57 g l(-1) h(-1) was obtained, and a succinic acid concentration of 51.6 g l(-1) with a yield of 75.8% was reached. These results suggest that optimized conditions of CO(2) supply are effective in high succinic acid production and thus have potential applications in succinic acid production and CO(2) fixation.