增强型绿色荧光蛋白在集胞藻6803中的表达

利用聚球藻7942热休克基因groESL的启动子和报告基因egfp,构建了表达载体pUC-Tegfp并转化集胞藻6803,并通过所制备抗体对转基因藻进行蛋白免疫印迹检测.结果发现,在转基因藻株T-egfp的细胞粗提液中含有能与eGFP抗体特异结合的蛋白质,表明外源增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)在集胞藻6803中成功表达.     

启动子Pcpcβ提高鱼腥藻7120中hGM-CSF基因表达效率的研究

利用聚球藻7002中编码藻蓝蛋白基因(cpcβ)的启动子(Pcpcβ),替代穿梭表达载体pDC-GM中的启动子PpsbA,启动外源人粒巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因在鱼腥藻7120中的表达。蛋白免疫印迹证实,在含Pcpcβ启动子的cGM藻株中,hGM-CSF基因的表达水平比原先构建的含PpsbA启动子的GM藻株中提高了90%,且该基因的高效表达对宿主细胞的生长未产生明显影响。结果表明,对于在蓝藻中表达hGM-CSF基因而言,Pcpcβ启动子可能是较适宜的强启动子之一。     

转基因聚球藻7942中vp28基因表达效率及其光合特性分析

背景:对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是对虾养殖业中危害最严重的病毒之一,至今尚无规模应用的有效药物防治方法。但近年来在WSSV免疫防治上进展较大。Vp28蛋白是WSSV囊膜上的主要结构蛋白,2004年以来其编码基因已在8种宿主中表达成功,在实验室试验中对WSSV的防治疗效显著,但目前尚未见到其在对虾产业中的应用。目的:利用对虾的天然饵料聚球藻表达Vp28重组蛋白,这种药食同源可简化操作,降低成本,有助其在生产中应用。方法:用荧光定量PCR方法检测转vp28基因聚球藻7942中vp28基因的表达效率。通过氧电极的方法测得转vp28基因型聚球藻在不同温度、光照、pH和盐度下的光合活性变化,找到它的最适生长条件。结果:检测了vp28基因表达效率为9.52%,是在鱼腥藻7120表达效率的3倍。最适采收时间是对数生长后期(15d左右)。转基因型蓝藻7 942的最适生长条件是:温度为40℃,盐度为0~0.1mol/L NaCl,pH为7.5,光强为450μmol/(m~2·s)。结论:确定了vp28基因在聚球藻中的表达效率及该转基因藻的最适培养条件,这些研究结果为用转vp28基因型聚球藻7942规模制备药食同源的口服剂提供了依据。     

小鼠金属硫蛋白在聚胞藻中的金属诱导表达与纯化

应用蓝藻类金属硫蛋白基因启动子(smt O-P)的金属诱导性,在单细胞的聚胞藻PCC 6803中表达小鼠金属硫蛋白结构基因(mMT-1 cDNA)。在大肠杆菌HB 101中构建含有smt O-P和mMT1 cDNA的穿梭表达载体pKT-MRE,经质粒转移,链霉素筛选,Southern和Western杂交分析鉴定得稳定的转基因工程藻落。同时,做小批量锌诱导表达,并纯化了外源蛋白,5L培养液含鲜藻重5.0g,得到3.5mg mMT-1;转基因藻在高金属浓度下的耐受性测定表明,外源基因的表达提高了蓝藻对金属离子的抗性,约为野生藻的2倍。     

启动子PpetE与Pcpc560对集胞藻PCC 6803生物合成乙醇的影响

为了增加工程集胞藻PCC 6803的乙醇合成产量,通过选用强启动子Pcpc560 驱动并提高外源乙醇合成基因(pdc,yqhD)的表达,从而促进乙醇的生产。具体方法利用同源双交换引入来源于运动型发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因(pdc)与来源于大肠杆菌的NADPH依赖型醛还原酶基因(yqhD)并选用不同的启动子来驱动其表达。通过逆转录定量PCR分析,比较在不同启动子驱动的情况下,外源乙醇合成基因(pdc,yqhD)的表达情况并检测相应突变株的乙醇产量。结果显示相较于中等启动子,铜离子诱导启动子PpetE,来源于集胞藻PCC 6803的光强启动子Pcpc560显著促进了外源乙醇合成基因(pdc,yqhD)的表达,并增加了工程菌株乙醇合成的产量。超强启动子Pcpc560搭配pdc,yqhD的组合表达,显著提高了工程菌株的乙醇合成产量。     

螺旋藻耐盐相关基因启动子区功能分析

文章利用绿色荧光蛋白基因作为报告基因,研究2个螺旋藻耐盐相关基因启动子区域的功能。通过启动子预测软件预测螺旋藻耐盐相关基因5′端非翻译区的启动子结构,用Primer3.0程序在线设计引物,以pMD18-T载体和pUC18载体克隆螺旋藻启动子序列、gfp和卡那霉素抗性基因,将螺旋藻启动子-GFP基因-卡那霉素抗性基因(pro-gfp-kanr)三联DNA片段克隆至pKW1188载体,并将该重组质粒pKW1188::pro::gfp::kanr转化至受体菌集胞藻6803,激光共聚焦显微镜观察不同盐浓度培养条件下、不同时间段集胞藻表达GFP的情况。结果显示,通过不同盐浓度和不同时间的诱导,2个螺旋藻启动子在0.4~0.6 mol/L NaCl条件下,培养6~8 h表达的绿色荧光蛋白最多。文章成功构建了以绿色荧光蛋白为报告基因、卡那霉素抗性基因为选择标记、集胞藻6803作为外源基因表达受体,进行螺旋藻耐盐相关基因功能研究的平台;另外,从螺旋藻启动子能被盐诱导大量表达GFP的结果看,与启动子相关的螺旋藻基因很可能与螺旋藻的耐盐性相关。     

生物防治

940725启动子改良对杀蚊crylvB基因在聚球藻品种PCC7942中表达的影响〔英〕/Soltes一Rak,E.…厂Appl.Environ.Mierobiol一1993,59(s)一2404~2410〔译自DBA,1993,12(19),93-11028〕 使。ryIVB晶体蛋白基因王在聚球藻属品种PCC7942中表达最佳。制备了三种质粒,其中苏云金芽抱杆菌     

集胞藻PCC 6803蛋白SpPhaB和SpPhaE的原核表达及结晶条件筛选

【目的】克隆蓝藻集胞藻PCC 6803 SpPhaB和SpPhaE的编码基因并构建原核表达载体,优化培养条件以提高在大肠杆菌中可溶蛋白的表达量,筛选SpPhaB结晶条件,为PHB家族蛋白的结构与功能研究提供基础。【方法】克隆集胞藻PCC 6803 PHB合成途径的phaB、phaE基因,将phaB、phaE基因构建到表达载体pET28a中,优化IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,提高在大肠杆菌BL21(DE3)中SpPhaB和SpPhaE可溶蛋白的表达产量,经Ni柱亲和层析纯化分别获得His-SpPhaB和His-SpPhaE蛋白,进一步筛选SpPhaB结晶条件。【结果】构建了pET28a-SpPhaB和pET28a-SpPhaE表达载体;优化获得SpPhaB可溶蛋白的最佳表达条件为：诱导温度37 °C、转速220 r/min、IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导时间7 h;SpPhaE的可溶性蛋白最佳表达条件为：诱导温度25 °C、转速220 r/min、IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导时间7 h,并获得了SpPhaB的结晶条件。【结论】构建了具有高效表达可溶的集胞藻PCC 6803 SpPhaB和SpPhaE的原核表达系统,并筛选优化了SpPhaB的结晶条件,为研究SpPhaB蛋白的结构及功能奠定了基础。     

集胞藻PCC6803高效基因表达平台的构建与评价

针对蓝细菌代谢工程改造的需求,成功构建了可以在模式蓝细菌菌株集胞藻PCC6803中高效表达外源基因的3个基因组整合表达平台,以及1个可以在多株蓝细菌中表达的广宿主穿梭表达平台。该表达平台通过选用集胞藻PCC6803中1,5-二磷酸核酮糖缩化酶/氧化酶的启动子驱动外源基因的表达,应用“SD-AUG”翻译融合的策略提高外源蛋白翻译效率,以及加入终止子序列Trbc以提高转录终止效率,实现了对外源基因的高效表达。利用lacZ作为报告基因,检测了所构建表达平台pFQ20在集胞藻中的基因表达效率,结果显示β-半乳糖苷酶的活性为109 Miller。同时,基于pFQ20表达平台在集胞藻PCC6803中表达了来自大肠杆菌的硫酯酶基因tesA’,蛋白印迹实验结果显示了硫酯酶的成功表达。该表达平台为在蓝细菌中开展遗传研究及基因工程改造提供了有用的遗传工具,其构建策略为在蓝细菌中构建高效稳定的外源基因表达元件提供了借鉴。     

光质对工程聚球藻7002生长及psbA启动子的调控

工程聚球藻的psbA基因及其所用载体的启动子Ppsb A均受光质调控,利用该机制可通过光质调控提高聚球藻的光合效率及其外源基因表达率。以转vp28基因聚球藻7002为实验材料,通过优化光强、温度及pH,解除光限制因素并提高光能利用率。通过改变白光、红光及蓝光的比例,调控光质组成及单色光的光强,检测细胞生长、外源基因的表达及psb A基因的转录。研究结果表明:高比例蓝光下,vp28基因的表达率达到2.4%,是纯白光下的3倍,重组蛋白VP28的积累量提高至2倍。高比例红光抑制了psb AII、psb AIII基因及外源基因的表达,但促使生物量在3 d内突破1.5 g/L。本研究为蓝藻的生物制药和工程蓝藻代谢产物的产业化提供了理论基础。     

蓝藻Synechococcus sp.PCC7942穿梭表达质粒的构建及胸腺素α1基因的表达

利用本实验室构建的含蓝藻Plectonema boryanum内源小质粒的穿梭质粒pPRS-1,改建成含热诱导启动子、泛素融合的胸腺素α1（UB-Tα1）目的基因、卡那霉素抗性选择标记、rbcS终止子的新的穿梭表达重组质粒pPREUT。将这种重组质粒转化蓝藻Synechococcus sp.PCC7942,通过抗性筛选获得了具卡那霉素抗性的转化藻株。经Southern-blot杂交证实,穿梭表达质粒已转入蓝藻Synechococcus sp.PCC7942细胞中,在42℃热诱导30min后,目的基因UB－Tα1得到较高水平表达,表达量约占总蛋白量的7．5％。